本發(fā)明屬于生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域和蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)細(xì)胞膜具有高親和力多肽及其應(yīng)用，例如用于納米藥物在體檢測(cè)中。

背景技術(shù)：

細(xì)胞膜或稱(chēng)質(zhì)膜，在細(xì)胞群體的“社會(huì)行為”中起著重要作用，諸如細(xì)胞間通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和移行、細(xì)胞粘附、與細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換、被機(jī)體免疫機(jī)制所識(shí)別等，無(wú)不與質(zhì)膜的功能有關(guān)。惡性腫瘤細(xì)胞的許多生長(zhǎng)特性及侵襲轉(zhuǎn)移能力亦均與質(zhì)膜的改變有關(guān)。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞膜化學(xué)組成的一個(gè)重要特點(diǎn)是膜磷脂中單不飽和脂肪酸，主要是油酸的含量相對(duì)增高，而飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量相對(duì)減少。因此膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，硬脂酸與油酸都是18個(gè)碳原子的脂肪酸，硬脂酸經(jīng)酶的作用轉(zhuǎn)化為油酸，腫瘤細(xì)胞膜中油酸增加，故飽和指數(shù)降低。

細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸調(diào)控是重大科學(xué)難題，也是科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)問(wèn)題。藥物在細(xì)胞和亞細(xì)胞內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、結(jié)合、代謝、排泄等細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的考察對(duì)于藥物的治療效果評(píng)價(jià)具有重要意義。故迫切需要將傳統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究從“宏觀”的血漿藥物濃度深入到“微觀”的靶細(xì)胞/亞細(xì)胞層面，研究藥物在靶細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率、胞內(nèi)或細(xì)胞器內(nèi)蓄積量、亞細(xì)胞分布與靶向結(jié)合，與藥物的靶部位活性進(jìn)行相關(guān)分析，建立PK-PD模型，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物在人體的藥效。

用于示蹤細(xì)胞增殖時(shí)，隨著細(xì)胞的每一次分裂，細(xì)胞膜熒光染料能準(zhǔn)確地標(biāo)記細(xì)胞的變化，清晰可視化研究藥物在靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)變化，以及胞內(nèi)細(xì)胞器的積累。.

細(xì)胞膜標(biāo)記技術(shù)早在1985年就已經(jīng)進(jìn)行了初步發(fā)展，DiO/DiD/DiL/DiR屬于長(zhǎng)鏈羰花青熒光染料，是一種親脂性膜染料，它在水溶液中熒光極弱，然而當(dāng)用稀釋的染液標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，DiO/DiD中的烷基鏈嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙份子層中，并激發(fā)出強(qiáng)烈的綠色/紅色熒光，DiO的最大激發(fā)波長(zhǎng)是489nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是501nm，DiD的最大激發(fā)波長(zhǎng)是644nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是665nm。DiO在最早的研宄中被用來(lái)示蹤神經(jīng)細(xì)胞。用于示蹤細(xì)胞增殖時(shí)，隨著細(xì)胞的每一次分裂，膜染料DiO/DiD的熒光能準(zhǔn)確地平分到兩個(gè)子代細(xì)胞上。DiO/DiD染料具有低熒光變異性、良好的標(biāo)記穩(wěn)定性以及極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移這些優(yōu)點(diǎn)，此外，DiO/DiD并不影響標(biāo)記細(xì)胞及后代細(xì)胞的增殖，并能通過(guò)建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)體內(nèi)外細(xì)胞分裂情況。特別是Dil，廣泛應(yīng)用于固定和非固定的組織與細(xì)胞中，進(jìn)行順行或逆行的神經(jīng)示蹤分析。Dil不會(huì)影響細(xì)胞的活力、生長(zhǎng)以及基本生理特性。Dil標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可在培養(yǎng)基條件下持續(xù)跟蹤長(zhǎng)達(dá)四周，在體內(nèi)長(zhǎng)達(dá)一年。染料通過(guò)在質(zhì)膜中的緩慢橫向擴(kuò)散均勻標(biāo)記神經(jīng)元，0.2～0.6mm/每天/固定標(biāo)本，在活體組織里，可以達(dá)到6mm/每天。經(jīng)過(guò)醛固定的組織，Dil的擴(kuò)增可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)1～2年。一般情況下未標(biāo)記的染料不會(huì)向非標(biāo)記的細(xì)胞轉(zhuǎn)移，除非質(zhì)膜被破壞，比如切片部位。。

較長(zhǎng)的熒光衰減時(shí)間，在體檢測(cè)時(shí)，只能用于長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記觀察，藥物代謝時(shí)間往往是短時(shí)間內(nèi)完成，長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞熒光標(biāo)記不利于機(jī)體的正常代謝。Di系列染料雖具有低熒光變異性、良好的標(biāo)記穩(wěn)定性、較低細(xì)胞毒性以及極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移這些優(yōu)點(diǎn)，但在藥物進(jìn)行細(xì)胞代謝時(shí)，標(biāo)記的細(xì)胞功能的完整性受到影響。為了設(shè)計(jì)用于細(xì)胞內(nèi)藥物監(jiān)控的細(xì)胞膜標(biāo)記分子，生物分子多肽因其生物活性、標(biāo)記方便、熒光時(shí)效性，成為新的細(xì)胞膜標(biāo)記的選擇。

本發(fā)明公開(kāi)了能高度親和細(xì)胞膜的多肽，這些多肽能高效結(jié)合細(xì)胞膜，從而靶向各種細(xì)胞，最終達(dá)到標(biāo)記細(xì)胞的效果。這些多肽可制備成藥物進(jìn)入細(xì)胞監(jiān)控的評(píng)價(jià)工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供能夠與細(xì)胞膜相關(guān)的親和多肽，使其能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可用于制備新型的藥物評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)。

本發(fā)明的目的還在于提供包含或部分包含SEQ ID NO：1序列多肽或蛋白的分子作用方式，其結(jié)合細(xì)胞膜，標(biāo)記在細(xì)胞膜表面。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有SEQ ID NO：1的膜標(biāo)記試劑，作為體內(nèi)外檢測(cè)納米藥物進(jìn)出細(xì)胞速率的有效成分。

本發(fā)明所述的SEQ ID NO：1肽是由酸性氨基酸和烷酸結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化得到，其具有天然氨基酸序列，免疫原性小，生物活性好。

為了檢測(cè)本發(fā)明多肽的藥理活性，體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光染料羅丹明B對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)近紅外染料ICG-Der-02對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記，以檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞膜的體內(nèi)外靶向性。在體外細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)和攝取實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的SEQ ID NO：1肽展現(xiàn)出了其良好的對(duì)細(xì)胞膜的靶向能力。在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的SEQ ID NO：1肽未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的毒性。在體內(nèi)組織成像和組織切片均能反映，本發(fā)明的SEQ ID NO：1肽具有良好的在體細(xì)胞膜標(biāo)記特性。

本發(fā)明所述的SEQ ID NO：1肽包含多種變形模式，詳細(xì)發(fā)明進(jìn)行了4種衍生肽的驗(yàn)證，其中H4肽，即修飾多肽為賴(lài)氨酸正十六烷酸，效果最佳，作為發(fā)明實(shí)例。

詳細(xì)發(fā)明內(nèi)容如下：

一、標(biāo)記體外實(shí)驗(yàn)熒光染料

本發(fā)明應(yīng)用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的熒光染料為羅丹明B(Rhodamine B)，簡(jiǎn)稱(chēng)RhB，分別與本發(fā)明H4肽通過(guò)酰胺鍵連接，簡(jiǎn)稱(chēng)為H4-RhB，連接方法具體為取1mg羅丹明B(詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)：Cao，J.，et al.，F(xiàn)ast clearing RGD-based near-infrared fluorescent probes for in vivo tumor diagnosis.Contrast Media Mol Imaging，2012.7(4)：p.390-402)溶于1ml PBS(pH為7.4)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)(摩爾比Rhodamine B∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5)，避光反應(yīng)4h，活化。分別稱(chēng)取1mmol H4肽溶入含有熒光染料羅丹明B的1ml PBS緩沖液(pH7.4)中，室溫避光攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮后通過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱，PBS緩沖液(pH7.4)作洗脫液，得到純化的H4-RhB，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

二、體外細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的人肝癌HepG2細(xì)胞和人肝細(xì)胞L02從12孔板上洗脫后重懸于PBS溶液，分別與羅丹明B標(biāo)記的H4肽(10umol/L)共孵育2小時(shí)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)證明對(duì)細(xì)胞的親和力越強(qiáng)。當(dāng)探針與細(xì)胞上的受體親和力強(qiáng)時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值高。體外親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濃度相同的標(biāo)記了RhB的H4肽的探針?lè)謩e與HepG2和L02細(xì)胞孵育后，在HepG2細(xì)胞中H4肽探針平均熒光強(qiáng)度為62，在L02細(xì)胞中H4肽探針平均熒光強(qiáng)度為24，空白染料平均熒光強(qiáng)度為4，結(jié)果表明這些探針在與HepG2和L02細(xì)胞親和力強(qiáng)弱對(duì)比中，本發(fā)明H4的強(qiáng)度最大。

三、體外細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的人肝癌細(xì)胞HepG2，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和正常肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)移到共聚焦皿中，過(guò)夜孵育后分別加入相同濃度的羅丹明B標(biāo)記的H4肽(40umol/L)，加入DiO標(biāo)記的作為陽(yáng)性對(duì)照，37℃孵育2小時(shí)后，加入染核試劑12μg/mL Hochest33342染色，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)探針的攝取情況。在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中(圖3所示)，H4肽探針顯示出了很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，這一結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明多肽探針對(duì)細(xì)胞膜有靶向性且無(wú)特異性。

四、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

U87MG細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞與正常肝L02細(xì)胞，待長(zhǎng)至90％以上時(shí)，用0.25％胰蛋白酶液消化后，制備成單細(xì)胞懸液(完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，以3000個(gè)細(xì)胞/孔鋪96孔板，于37℃，含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)24h后換為1％FBS的低血清培養(yǎng)液，然后加入不同濃度梯度的H1-H4肽，使他們的終濃度為5，10和20μM。結(jié)果顯示(圖6所示)H1-H4肽對(duì)這幾種細(xì)胞的存活率均在80％以上，說(shuō)明H1-H4肽對(duì)這些細(xì)胞基本無(wú)毒。

五、活體細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明應(yīng)用于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的英冠染料為紅外有機(jī)染料ICG-Der-02，與H4通過(guò)酰胺鍵連接，簡(jiǎn)稱(chēng)ICG-Der-02-H4，連接具體方法為取2mg ICG-Der-02(詳見(jiàn)參考文獻(xiàn))溶于1ml PBS(pH為7.4)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)(摩爾比ICG-Der-02∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5)，避光反應(yīng)4h，活化。稱(chēng)取1mmol H4肽溶于含有熒光染料ICG-Der-02的1ml PBS緩沖液(pH＝7.4)，室溫避光攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮后通過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱，PBS緩沖液(pH＝7.4)作洗脫液，得到純化的ICG-Der-02-H4，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在注射?-6小時(shí)，進(jìn)行活體組織成像，肌肉細(xì)胞膜均有較清晰顯示，如圖8所示。24h后進(jìn)行切片仍可觀察到熒光信號(hào)，48h無(wú)熒光信號(hào)。

將標(biāo)記了RhB的H4肽進(jìn)行腎組織、肌肉組織、腫瘤組織切片染色孵育，均能對(duì)固定組織進(jìn)行細(xì)胞膜標(biāo)記如圖7所示。

綜上所述，本發(fā)明的SEQ ID NO：1肽能夠靶向到細(xì)胞膜上，而對(duì)細(xì)胞基本無(wú)特異性，并且SEQ ID NO：1肽對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性。由此可見(jiàn)SEQ ID NO：1肽能夠成為對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行親和熒光標(biāo)記，檢測(cè)藥物進(jìn)入細(xì)胞的情況。

本發(fā)明的SEQ ID NO：1肽可以?xún)?yōu)選用實(shí)施例1固相合成的方法制備。

本發(fā)明的多肽是細(xì)胞膜親和肽。盡管不希望受理論約束，發(fā)明人相信本發(fā)明多肽的親和作用是基于其脂肪酸鏈的插入作用和多肽分子電性。

藥物組合物：可以任何本文所述適應(yīng)癥，包括抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞增殖的治療有效量，任選地與藥學(xué)上可接受的添加劑、載體或賦形劑組合，來(lái)制備基于SEQ ID NO：1肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥，包括酯的藥物組合物。治療有效量可隨著要治療的感染或病況、其嚴(yán)重性、所應(yīng)用的治療方案、所用藥劑的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)以及受治療的患者而改變。

本發(fā)明還包括藥物制劑，該制劑包含作為活性成分的SEQ ID NO：1肽或其酯或前藥或藥學(xué)上可接受的載體。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，是指一種或幾種惰性的、非毒性的固體或液體填充物、稀釋劑，助劑等，它們不逆向與活性化合物或病人發(fā)生作用。

本發(fā)明組合物的劑型可以是片劑、膠囊、丸劑、栓劑、軟膠囊、口服液、混懸劑、注射液等藥劑學(xué)上常用的劑型。口服用藥片和膠囊含有傳統(tǒng)的賦形劑如填充物、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、分散劑以及粘合劑。

本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)行制備。

以上活性劑的劑量將因配方而異。

有益效果：

1.發(fā)明了一系列新的對(duì)細(xì)胞膜具有高親和力的多肽，擴(kuò)大了細(xì)胞膜標(biāo)記分子的種類(lèi)。

2.這些多肽均為低分子量多肽，合成成本低廉。

3.這些肽均為首次報(bào)道，獲取渠道方便。

4.本品用ICG-Der-02花菁類(lèi)近紅外熒光染料，其側(cè)鏈上有一個(gè)羧基官能團(tuán)，適用作生物熒光標(biāo)記。通過(guò)EDC/NHS催化體系可以有效地將將其活化，與多肽分子鏈末端的氨基共價(jià)偶聯(lián)形成酰胺鍵，構(gòu)建ICG-Der-02-peptide分子探針，從而可使多肽帶有明顯的近紅外熒光特性。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明：

圖1 H4肽質(zhì)譜圖

圖2 H4肽液相純化圖

圖3激光共聚焦細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)觀察羅丹明B標(biāo)記的探針對(duì)U87MG細(xì)胞的攝取

圖4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞親和實(shí)驗(yàn)觀察羅丹明B標(biāo)記的探針對(duì)HepG2細(xì)胞的親和力

圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞親和實(shí)驗(yàn)觀察羅丹明B標(biāo)記的探針對(duì)L02細(xì)胞的親和力

圖6體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察多種肽對(duì)不同細(xì)胞的毒性

圖7離體組織切片H4肽染色情況，藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為細(xì)胞膜

圖8 H4肽活體細(xì)胞成像

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施例僅是用于說(shuō)明，而并非用于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)所做出的各種變化均應(yīng)在本申請(qǐng)權(quán)利要求所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

本發(fā)明多肽H4的合成過(guò)程

1：偶聯(lián)

先將Fmoc-Arg-Rink amide MBHA resin(芴甲氧羰?；?精氨酸-rink氨基樹(shù)脂)0.33/2mmol6.06g溶脹于二甲基甲酰胺中，10ml/g樹(shù)脂，接著用20％六氫吡啶/二甲基甲酰胺溶液脫去Fmoc保護(hù)基(以下稱(chēng)之為脫帽)，用二甲基甲酰胺洗滌脫帽子后的樹(shù)脂，加入原料Fmoc-Lys(Boc)-OH 2.3g，縮合劑用HBTU 1.44g，反應(yīng)時(shí)間30分鐘，kaiser法檢測(cè)，如檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)完成，則接下去進(jìn)行脫帽，時(shí)間30分鐘，如檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，則說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)未完成或反應(yīng)不完全，需要延長(zhǎng)偶聯(lián)時(shí)間或重新投料偶聯(lián)，直至偶聯(lián)反應(yīng)完成。重復(fù)上述操作，依次偶聯(lián)，完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的peptidyl resin，真空干燥箱里充分干燥。

2：樹(shù)脂與肽的分離裂解

將120ml裂解液(10ml/g peptidyl resin)加入樹(shù)脂中，25℃條件下，磁力攪拌2.5h后用砂芯漏斗將裂解液與樹(shù)脂分離，棄去樹(shù)脂，保留濾液。將濾液緩慢滴加到10eq體積的冰無(wú)水乙醚中，滴加完畢后，自然沉降30min。然后用高速離心機(jī)離心10min(4000rpm)，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥箱中干燥8-10h，得到干粉粗品。

3：純化

取上述干粉粗品1g，用0.1％三氟乙酸/水溶解。經(jīng)過(guò)濾后，上樣到C18制備柱，用高效液相進(jìn)行梯度洗脫，收集目標(biāo)肽的洗脫液體，檢測(cè)液體純度。把合格的樣品混合后旋蒸，最后用凍干機(jī)凍干，得到Arg Trp Arg Gly Gly Gly Gly Lys Xaa Lys Lys Xaa，純度大于98％。

序列為：Arg Trp Arg Gly Gly Gly Gly Lys Xaa Lys Lys Xaa，其中Xaa為正十六烷酸修飾。

質(zhì)譜圖如圖1，液相圖如圖2。

紫外光譜圖中273nm處有肽的吸收峰。