本發(fā)明屬于基因技術(shù)及植物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力的基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤鹽堿化通常是由于灌溉不當(dāng)、用水過量等原因引起地下水位上升，從而造成土壤中鹽分積聚的過程。這主要發(fā)生在干旱、半干旱、半濕潤氣候區(qū)及受海水侵灌的海濱低地區(qū)域。中國鹽漬土地總面積驚人，主要分布在新疆、河西走廊、柴達(dá)木盆地、河套平原、銀川平原、黃淮海平原、東北平原西部，以及濱海地區(qū)。在中國的鹽堿耕地中，大約73％屬輕度鹽堿化，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響不嚴(yán)重，其余27％為中強(qiáng)度鹽堿化。

盡管對于土壤鹽堿化的治理是一個(gè)重要的課題，正在被越來越多的人員研究和重視，但是目前土壤鹽堿化仍然有越來越嚴(yán)重的趨勢，且短時(shí)間內(nèi)難以扭轉(zhuǎn)。

鹽脅迫與堿脅迫常常同時(shí)發(fā)生，也常被稱為鹽堿脅迫。鹽堿對植物造成的傷害表主要現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：一是細(xì)胞質(zhì)中金屬離子(主要是Na⁺)的大量積累，它會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡并抑制細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝過程，使植物光合作用能力下降，最終因碳饑餓而死亡；二是鹽堿土壤是一個(gè)高滲環(huán)境，它能阻止植物根系吸收水分，從而使植物因“干旱”而死亡。同時(shí)鹽堿土壤pH值較高，這使得植物體與外界環(huán)境酸堿失衡，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞內(nèi)溶物外滲而使植物死亡。因而，受鹽堿脅迫的植物一方面要降低細(xì)胞質(zhì)中離子積累，另一方面還通過積累過程產(chǎn)生某些特殊的產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等來增強(qiáng)細(xì)胞的滲透壓，阻止細(xì)胞失水，穩(wěn)定質(zhì)膜及酶類的結(jié)構(gòu)。多數(shù)植物不宜生長在鹽堿地上。而鹽堿植物在形態(tài)和生理上都與其生長環(huán)境相適應(yīng)。

不同的植物對于鹽堿的耐受能力有所差異，植物體內(nèi)也可能存在一些對 于抵抗環(huán)境脅迫有效的基因。鑒于傳統(tǒng)的育種方法篩選的成功率低，耗時(shí)長，開發(fā)一些新的選育技術(shù)是重要的。通過分析和鑒定出與植物抵抗環(huán)境脅迫有效的基因來對植物進(jìn)行改造或篩選。

盡管目前已經(jīng)鑒別出一些抗逆相關(guān)的基因，然而還需要通過大量的努力進(jìn)一步開發(fā)和尋找新的基因，從而可為植物品種的改良提供更多、更有效的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力的基因及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種OsKEA1多肽或編碼該多肽的多核苷酸的用途，用于增強(qiáng)植物耐鹽堿脅能力或提高植物產(chǎn)量；或用于制備耐鹽堿脅迫的植物或產(chǎn)量提高的植物。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的植物包括但不限于：禾本科植物。

在另一優(yōu)選例中，所述OsKEA1多肽是：

(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)將SEQ ID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-20個(gè)；較佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力的由(a)衍生的多肽；或

(c)氨基酸序列與(a)限定的氨基酸序列有70％以上(較佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地99％以上)相同性且具有增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力的多肽；或

(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的多肽片段(較佳地，其與SEQ ID NO:2的序列相同性高于70％；更佳地高于75％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)。

在另一優(yōu)選例中，所述的OsKEA1多肽或編碼該多肽的多核苷酸：

提高植物根部的Na⁺離子流，K⁺離子流或H⁺離子流，從而增強(qiáng)植物耐鹽堿能力；

促進(jìn)葉片細(xì)胞的葉綠體或根部細(xì)胞原生質(zhì)體中鈉離子、鉀離子的外排；

促進(jìn)對植物的光保護(hù)作用(特別是在鹽堿脅迫條件下或在大田栽培條件下)，從而增強(qiáng)植物耐鹽堿能力；或

提高植物的光合作用效率(特別是在鹽堿脅迫條件下或在大田栽培條件下)，從而增強(qiáng)植物耐鹽堿能力或提高植物產(chǎn)量。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力或提高植物產(chǎn)量的方法，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表達(dá)或活性。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備具有耐鹽堿脅迫能力的植物或產(chǎn)量提高的植物的方法，所述方法包括：提高植物中OsKEA1多肽的表達(dá)或活性。

在一個(gè)優(yōu)選例中，，所述的方法包括：將編碼OsKEA1多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物中。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟：

(i)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含編碼OsKEA1多肽的多核苷酸；

(ii)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(i)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述編碼OsKEA1多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(iii)選擇出轉(zhuǎn)入了編碼OsKEA1蛋白的多核苷酸的植物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種具有耐鹽堿脅迫能力以及耐大田綜合環(huán)境因素脅迫能力的植物或其種子，其是由前述方法制備獲得的轉(zhuǎn)基因植物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種OsKEA1多肽或編碼其的多核苷酸的用途，用作鑒定植物的耐鹽堿脅迫能力的分子標(biāo)記物，或用作鑒定植物產(chǎn)量高低的分子標(biāo)記物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種鑒定植物耐鹽堿脅迫能力或產(chǎn)量高低的方法，包括：檢測待測植物中OsKEA1多肽的表達(dá)；若待測植物中該多肽的表達(dá)量高于(較佳地為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于，如高50％以上)該類植物中OsKEA1多肽表達(dá)的常規(guī)值(或平均值)；則該種植物是具有耐鹽堿脅迫能力或或產(chǎn)量提高的植物；若待測植物中該多肽的表達(dá)量低于(較佳地為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于，如低80％以上)該類植物中OsKEA1多肽表達(dá)的常規(guī)值(或平均值)；則該種植物是不具有耐鹽堿脅迫能力或產(chǎn)量不高的植物。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、突變體(oskea1)和野生型(WT)的表型比較。

A：在培養(yǎng)箱(光強(qiáng)為100μmol photonsm^-2s^-1)中生長30天的野生型(左)和突變體(右)；

B：野生型(左)和突變體(右)葉片中脈近軸面的比較；

C：野生型(左)和突變體(右)葉片中脈遠(yuǎn)軸面的比較；

D：野生型和突變體中脈附近的細(xì)胞比較(左為野生型，右為突變體)(Bar＝50μm)；

E：野生型和突變體中脈附近的細(xì)胞大小的比較；

F：野生型和突變體中脈附近的細(xì)胞數(shù)目的比較。(左為野生型，右為突變體)。

圖2、選取30d水稻小苗的葉片作超薄切片，置于透射電子顯微鏡下觀察葉綠體類囊體。

圖3、OsKEA1的鑒定。

A：OsKEA1基因的圖位克隆，OsKEA1基因的定位區(qū)段。

B：突變體oskea1的互補(bǔ)植株Com-oskea1與野生型、突變體的表型比較。Com-oskea1是使用自身啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化突變體oskea1獲得的互補(bǔ)株系。

C：sKEA1的免疫印跡分析，10天的野生型、突變體和互補(bǔ)幼苗的葉片提取的葉綠體蛋白，每個(gè)泳道上10μg總蛋白，經(jīng)7％SDS凝膠電泳分離后，進(jìn)行免疫印跡鑒定(上)，SDS凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)染色(Coom.)的Rubisco大亞基(Rubisco L)，作為上樣對照。

圖4、野生型的RNAi轉(zhuǎn)基因植株。

A：葉片中脈近軸面表型比較。

B：野生型的RNAi轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR。轉(zhuǎn)基因株系RI3-3表現(xiàn)為突變體oskea1的葉片近軸面特異變白表型，其他株系仍表現(xiàn)為野生型表型或差異很不明顯。

圖5、A：OsKEA1基因的組織定位(Bar＝1mm)；

B：水稻OsKEA1基因的表達(dá)模式RT-PCR，其中，C，愈傷組織(callus)；R，根(root)；S，芽(shoot)；F，花(flower)；L，葉(leaf)；LS，葉鞘(leaf sheath)；

C：OsKEA1的亞細(xì)胞定位。OsKEA1-N-GFP融合蛋白的黃綠熒光信號與葉綠素自發(fā)熒光信號共定位于葉綠體中(Merged)，eGFP：空載體。

圖6、水稻不同組織中(A)以及葉綠體不同組分(B)中OsKEA1的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

A：分離10天幼苗的根、莖、葉和葉脈(主脈)，提取總蛋白，SDS電泳后進(jìn)行免疫印跡檢測，每個(gè)泳道含有5μg總蛋白。

B：從10天幼苗分離完整葉綠體組分，每個(gè)泳道含有10μg總蛋白，經(jīng)7％SDS電泳后進(jìn)行免疫印跡檢測，箭頭指的是OsKEA1免疫信號。SDS凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)染色(Coom.)作為上樣對照。WT，野生型；oskea1，突變體；Com，使用自身啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化突變體oskea1獲得的互補(bǔ)株系。

圖7、野生型與突變體根部原生質(zhì)體Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性的比較。WT，野生型；oskea1，突變體。

圖8、野生型與突變體類囊體膜ATPase活性(A)、Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性(B和C)以及葉片、根、葉綠體(Chl)和類囊體膜鉀鈉離子含量的比較(D-G)。WT，野生型；oskea1，突變體；Com，使用自身啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化突變體oskea1獲得的互補(bǔ)株系。

圖9、野生型(WT)、突變體(oskea1)和互補(bǔ)植株(Com-oskea1)根部K⁺離子流(A)，Na⁺離子流(B)，H⁺離子流(C)的比較。

圖10、野生型(WT)、突變體(oskea1)和互補(bǔ)植株(Com-oskea1)在額外添加NaCl和KCl培養(yǎng)基中的生長表型。上圖(A和C)為生長5天的表型，下圖(B和D)為生長3周的表型。

圖11、野生型(WT)、突變體(oskea1)和互補(bǔ)植株(Com-oskea1)在不同pH下的生長表型，上圖為生長5天的表型，下圖為生長3周的表型。

A、B：pH4.0；

C、D：pH5.7；

E、F：pH7.0。

圖12、野生型(WT)、突變體(oskea1)和互補(bǔ)植株(Com-oskea1)在不同生長條件下的光系II最大光化學(xué)效率的比較。

圖13、OsKEA1過表達(dá)水稻在25mM NaCl下的生長表型(A)以及正常條件下幼苗表型(B)、類囊體膜蛋白積累水平(C)以及維管束組織(D)蛋白水平的比較。WT，野生型；oskea1，突變體；Ov-OsKEA1，是使用Ubiquitin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化野生型獲得的株系。Com，是使用Ubiquitin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化突變體oskea1獲得的株系。

圖14、OsKEA1過表達(dá)水稻在的篩管納離子下載速度(A)、光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)(B)、毫秒級延遲發(fā)光慢相(C)和田間單株產(chǎn)量(D)分析。

WT：野生型水稻(9522)；

oskea1：突變體；

Over12、Over23：OsKEA1在野生型中的過表達(dá)株系，即：利用自身啟動(dòng)子將OsKEA1轉(zhuǎn)化野生型水稻，獲得的OsKEA1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系；

Over1、Over2、Over3：OsKEA1在突變體中的過表達(dá)株系，即：使用ubiquitin強(qiáng)啟動(dòng)子將OsKEA1轉(zhuǎn)化突變體，獲得的OsKEA1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系；

Com：是使用Ubiquitin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化突變體oskea1獲得的過表達(dá)株系。

Com12：是使用自身啟動(dòng)子將OsKEA1轉(zhuǎn)化突變體獲得的互補(bǔ)株系。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人首次分離了一個(gè)葉片白脈的水稻突變體，獲得了控制該性狀的一個(gè)新的功能基因——OsKEA1，該基因編碼一個(gè)假定的鉀離子外排蛋白， OsKEA1定位于葉綠體被膜。本發(fā)明人證明了OsKEA1參與葉綠體鉀離子外排，平衡葉綠體鈉離子和pH，是在鹽堿脅迫條件或在大田栽培條件下維持植物有效光合作用所必需的，因此過表達(dá)OsKEA1的轉(zhuǎn)基因水稻能在大田條件下具有較高的光合能力和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量?？梢詫sKEA1基因應(yīng)用于植物的培育中，選育出具有特定品質(zhì)性狀的品種，如耐鹽堿的或產(chǎn)量提高的植物。

OsKEA1蛋白是一個(gè)十次跨膜的鉀離子外排逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有一個(gè)很保守的Na⁺/H⁺交換子結(jié)構(gòu)域，而亞細(xì)胞定位顯示，OsKEA1蛋白定位在葉綠體和細(xì)胞膜上。為了驗(yàn)證OsKEA1是否具有Na⁺(K⁺)/H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)活性，本發(fā)明人分別測定其在葉綠體和細(xì)胞膜上的Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性。利用QD(喹吖因)結(jié)合H⁺發(fā)生熒光淬滅的特性，來指示跨膜H⁺的梯度，從而反映Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺的交換活性。分別提取水稻幼苗的原生質(zhì)體(質(zhì)膜)和完整葉綠體(再進(jìn)一步分離出葉綠體被膜和類囊體膜)，進(jìn)行Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性的測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體葉綠體類囊體膜的K⁺/H⁺和Na⁺/H⁺交換活性明顯地降低，表明OsKEA1在維管組織或葉綠體鉀或鈉離子外排中發(fā)揮重要的作用。另一方面，本發(fā)明人也觀察到突變體oskea1的根部質(zhì)膜的Na^+/H⁺和K⁺/H⁺交換活性與野生型9522相比都明顯降低，暗示著該基因突變導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)鈉、鉀離子的外排受到抑制。為了證明這一猜想，本發(fā)明人分析了突變體和野生型根部離子流的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體的鉀、鈉、氫離子的外排活性明顯地低于野生型的，離子含量分析進(jìn)一步說明了，OsKEA1基因的突變，導(dǎo)致葉片中鈉、鉀離子的積累。這結(jié)果提示，OsKEA1參與了葉綠體和細(xì)胞外離子的外排。為了獲得進(jìn)一步的證據(jù)，本發(fā)明人分別比較了突變體和野生型在高鹽和不同酸堿度的培養(yǎng)液中的生長表型和光合作用效率，發(fā)現(xiàn)突變體oskea1在鹽或堿脅迫下生長緩慢、最終葉片受到嚴(yán)重的傷害、甚至死亡，光合作用效率降低為了探討OsKEA1基因在水稻抗鹽堿的應(yīng)用，本發(fā)明人在水稻野生型中過表達(dá)OsKEA1基因，獲得了過表達(dá)OsKEA1基因的轉(zhuǎn)基因水稻，該轉(zhuǎn)基因水稻呈現(xiàn)耐受高鹽、高pH，在鹽堿脅迫條件下具有較高的光合作用效率，在大田栽培條件下，具有較高的光合能力和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

如本文所用，所述的“鹽堿脅迫”包括“鹽脅迫”和“堿脅迫”。本發(fā) 明中劃分某一環(huán)境術(shù)語鹽堿脅迫環(huán)境還是正常環(huán)境的準(zhǔn)則與現(xiàn)有公知技術(shù)相符。例如，對于大多數(shù)植物，通?！澳望}脅迫能力”是指耐受鹽濃度0.1％-0.2％(如NaCl為20～50mM，較佳地25～40mM)的能力。對于大多數(shù)植物，通常，“耐堿脅迫能力”是指耐受pH6.8～8.0，較佳地7.0～8.0。

如本文所用，對于適用于本發(fā)明的植物(或作物)可以是適合進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)化操作，如農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。作為一種優(yōu)選方式，所述的“植物”包括：禾本科植物。比如，所述的“植物”包括：禾本科的水稻、小麥、大麥、玉米、黑麥、高粱、大豆等。

如本文所用，所述的“該類植物中OsKEA1蛋白(多肽)表達(dá)的常規(guī)值(平均值)”當(dāng)是一種用于判定OsKEA1蛋白表達(dá)的“閾值”，OsKEA1蛋白作為一種已知蛋白，本領(lǐng)域人員可以方便地了解這種常規(guī)值。比較蛋白表達(dá)差異的方法也是人們熟知的，例如通過簡單的免疫印跡試驗(yàn)得知。

本發(fā)明中，選擇合適的“對照植物”是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的例行部分，可以包括對應(yīng)的野生型植物或無目的基因的相應(yīng)植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同的品種。對照植物也可以是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因植物的個(gè)體。如本文所用的對照植物不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。

本發(fā)明還包括OsKEA1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的OsKEA1蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

任何一種OsKEA1蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，OsKEA1蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的 OsKEA1蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長OsKEA1蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長OsKEA1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本發(fā)明中，術(shù)語“OsKEA1蛋白”指具有OsKEA1蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與OsKEA1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端(特別是N末端)添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端(特別是N末端)添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括OsKEA1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與OsKEA1蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗OsKEA1蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含OsKEA1蛋白或其片段的融合蛋白。

任何與所述的OsKEA1蛋白同源性高(比如與SEQ ID NO:2所示的序列的同源性為50％或更高；優(yōu)選的，同源性為60％或更高；優(yōu)選的，同源性為70％或更高；優(yōu)選的，同源性為80％或更高；更優(yōu)選的，同源性為90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有OsKEA1蛋白相同功能的蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些蛋白包括但不限于來源于其它物種的同源蛋白。

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明OsKEA1蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。

編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼 序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指:(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的OsKEA1基因優(yōu)選獲自禾本科植物，但是獲自其它植物的與水稻OsKEA1基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。

本發(fā)明的OsKEA1蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

本發(fā)明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或OsKEA1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明中，OsKEA1蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。

所述的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。

本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化植物可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。

本發(fā)明提供了所述的OsKEA1蛋白或其編碼基因的用途，用于增強(qiáng)植物耐鹽堿脅迫能力或提高植物的產(chǎn)量；并且，所述的OsKEA1蛋白還可用于：提高植物根部的Na⁺離子流，K⁺離子流或H+離子流；促進(jìn)葉片細(xì)胞的葉綠體中鈉離子、鉀離子的外排；在鹽堿脅迫條件下發(fā)揮對植物的光保護(hù)作用；或在鹽堿脅迫條件下或大田栽培條件下維持植物的有效的光合作用效率。

本發(fā)明還涉及一種提高植物的耐鹽堿脅迫能力或提高植物產(chǎn)量的方法，所述的方法包括：提高植物中OsKEA1蛋白的表達(dá)或活性；或使所述植物過量表達(dá)OsKEA1蛋白。

在得知了所述的OsKEA1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來調(diào)節(jié)所述的OsKEA1蛋白的表達(dá)。比如可通過本領(lǐng)域人員已知的途徑將攜帶OsKEA1基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并 使之表達(dá)活性的OsKEA1蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，將編碼OsKEA1蛋白的基因通過常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述OsKEA1蛋白的植物。

優(yōu)選的，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：

(1)將外源的OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或組織，獲得轉(zhuǎn)化入OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和

(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了外源OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物植株。

作為一種優(yōu)選的實(shí)例，所述的方法包括步驟：

(s1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸；

(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官與步驟(s1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；

(s3)選擇出轉(zhuǎn)入OsKEA1蛋白的編碼多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及

(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。

其它增加OsKEA1基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)OsKEA1基因或其同源基因的表達(dá)?；蛘咄ㄟ^增強(qiáng)子(如水稻waxy基因第一內(nèi)含子、Actin基因第一內(nèi)含子等)來增強(qiáng)該OsKEA1基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明方法的強(qiáng)啟動(dòng)子包括但不限于：35s啟動(dòng)子，水稻、玉米的Ubi啟動(dòng)子等。

本發(fā)明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括：轉(zhuǎn)入了OsKEA1基因或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物；或者OsKEA1蛋白表達(dá)量(包括低表達(dá)或不表達(dá))降低的植物等。

可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施所述的方法。

此外，本發(fā)明還涉及利用OsKEA1蛋白或其編碼基因作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標(biāo)記。本發(fā)明還涉及利用OsKEA1蛋白或其編碼基因作為一 種分子標(biāo)記，通過檢測植物中OsKEA1蛋白的表達(dá)情況，鑒定植物的耐鹽堿能力。

本發(fā)明還涉及利用OsKEA1蛋白或其編碼基因進(jìn)行改良品種的篩選。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

1.1植物材料

粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品種：9522。

秈稻(Oryza sativa L.ssp.indica)品種：廣陸矮4號。

水稻突變體Oskea1：來自上海交通大學(xué)張大兵實(shí)驗(yàn)室，⁶⁰Coγ射線突變體庫。

水稻過表達(dá)OsKEA1株系Ov-OsKEA1：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、篩選、種植保存。

以上材料和轉(zhuǎn)基因植物種植于本實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱、本所人工氣候室或于6-10月種植于上海市中科院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所松江農(nóng)場。用于提取DNA、RNA、蛋白以及表型觀察和生理生化分析。

1.2載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

(1)以Pro_Ubiquitin作為啟動(dòng)子構(gòu)建過表達(dá)植株

將編碼OsKEA1基因的3465bp的全長cDNA序列(SEQ ID NO:1，編碼SEQ ID NO:2所示的多肽)片段通過SpeI和SacI插入改造過帶有Ubiquitin啟動(dòng)子的用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1300中，構(gòu)建得到p1300:Pro_Ubiquitin:OsKEA1載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化到水稻的突變體(Oskea1)和野生型(9522)的愈傷組織中，分別得到互補(bǔ)植株(Com)以及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株(Ov-OsKEA1)，利用OsKEA1多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，挑選在葉綠體被膜、類囊體膜以及維管束篩管組織表達(dá)量2倍以上的過表達(dá)植株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(2)以自身啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子構(gòu)建過表達(dá)植株

以基因組DNA中OsKEA1基因啟始密碼子ATG前3018bp的基因組序列片段作為自身啟動(dòng)子，來構(gòu)建自身啟動(dòng)子啟動(dòng)的過表達(dá)植株。采用以下引物：

COM-F：5’cgggatcccgAATGTTTGTATTTCTATGCTGTTGGTT 3’(SEQ ID NO:3)；和

COM-R：5’gtcgacTACGGGATGGTAGAAATGGAT 3’(SEQ ID NO:4)；

從水稻日本晴BAC克隆(OsJNBa0032F06)中擴(kuò)增出OsKEA1基因11977bp(包括啟始密碼子ATG前3018bp的自身啟動(dòng)子序列)的基因組序列片段。將該片段通過BamHI和SalI插入到用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1301載體中；測序驗(yàn)證正確，該載體通過電擊導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體Oskea1和野生型9522成熟胚愈傷，T0代獲得互補(bǔ)植株及自身啟動(dòng)子啟動(dòng)的過表達(dá)植株。

1.3 RT-PCR

利用Clontech Nucleobond試劑盒(Clontech；Palo Alto，CA，USA)，根據(jù)產(chǎn)品說明書提取總RNA，使用Invitrogen公司的cDNA合成試劑盒，從5μg的總RNA中合成高質(zhì)量的cDNA，首先利用ACTIN基因的特異引物做RT-PCR，根據(jù)比較ACTIN基因的表達(dá)量調(diào)整cDNA產(chǎn)物的模板量，然后根據(jù)調(diào)整后的均一化的模板量，利用分析基因的特異引物進(jìn)行PCR。

1.4水稻鉀、鈉含量的測定

將水稻用自來水清洗干凈，選取需要測定的組織材料，先在純水中快速洗一次，在雙蒸水中快速洗三次，然后用吸水紙把組織上的水分吸干，裝入牛皮紙袋里，放到90℃烘箱，烘至恒重。材料烘好后，用電子天平稱重，然后放到50ml離心管里，加入0.1M的醋酸溶液，90℃水浴3h，水浴時(shí)顛倒混勻5-6次。將提取液倒入2ml離心管，12,000rpm離心5～10min，取上清，用雙蒸水稀釋到合適的濃度。用于鉀鈉離子分析的葉綠體和類囊體膜按照上述的方法，使用的緩沖液是不含NaCl的，分離后得到的葉綠體或類囊體膜使用蒸餾水洗三遍。用Thermo Elemental Sokaar AA型原子吸收分光光度計(jì)測定K⁺、Na⁺含量。每個(gè)樣品重復(fù)測定兩次。取兩次的平均值，計(jì)算每毫克干重的K⁺、Na⁺含量。

1.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻幼胚愈傷組織及轉(zhuǎn)基因植株的再生

1.5.1水稻幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

取授粉后12-15天的水稻未成熟種子經(jīng)70％乙醇浸泡1分鐘后，于NaClO溶液中(與水1:1--1:3視情況而定，加2-3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和攝子挑出幼胚并接種于N6D₂培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。

1.5.2根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

從YEB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28℃振搖培養(yǎng)過夜，第2天按1％接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6至0.8左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5,000rpm、4℃離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養(yǎng)基中，此時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。

1.5.3水稻轉(zhuǎn)化受體材料與根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

于6cm培養(yǎng)皿中將水稻幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時(shí)搖動(dòng)，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D₂C培養(yǎng)基上，于26℃共培養(yǎng)3天。在轉(zhuǎn)化材料轉(zhuǎn)入前，事先在N6D₂C培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙，并用少量新鮮AAM液體培養(yǎng)基濕潤。共培養(yǎng)時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮(AS)作為農(nóng)桿菌Vir基因活化物，使用濃度為100μM。

1.5.4抗性愈傷組織的篩選及轉(zhuǎn)基因植株的再生

幼胚愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出，用無菌濾紙吸干菌液和水分；切去胚芽并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基N6D₂S1進(jìn)行選擇培養(yǎng)。7-12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到N6D₂S2選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時(shí)光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H或1/2MSENH上生根壯苗，隨后移入人工氣候室或大田。

1.5.5轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

載體為pCAMBIA1300-Ubi的T₀代轉(zhuǎn)基因植株用基因的特異引物做PCR反應(yīng)檢測陽性植株，然后將陽性植株進(jìn)行RT-PCR和Western Blot進(jìn)一步鑒定驗(yàn)證。

1.6水稻原生質(zhì)體的制備(不含Na和K)

1)水稻種子浸種3天(d)后，水培于人工氣候室中，培養(yǎng)條件為28℃，12h光照/24℃，12h黑暗。

2)取發(fā)芽后7～14d的水稻幼苗(10～25cm高)，將其葉片用鋒利的刀片切成0.5mm細(xì)條，立即置于酶解液(0.6M mannitol，10mM MES(pH 5.7)，1.5％Cellulase RS，0.75％Macerozyme，0.1％BSA，1mM CaC12，5mM β-mercaptoethanol and 50μg/ml carbenicillin)中，確保酶液浸沒葉片，黑暗條件下在搖床上40rpm酶解過夜；

3)酶解液用35μm孔徑尼龍膜過濾，用50ml圓底離心管收集過濾后的液體；

4)室溫，100～200g，離心2～3min，沉淀原生質(zhì)體；

5)小心吸去上清，加入含有2mM MES(pH 5.7)的0.6M mannitol溶液重懸，室溫，100～200g，離心5min；

6)重復(fù)步驟5兩次；

7)用適量含有2mM MES(pH 5.7)的0.6M mannitol溶液重懸；待用。

1.7水稻原生質(zhì)體和類囊體膜Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性的測定

類囊體膜提取參照徐敏等(2014)的方法，Na⁺/H⁺或K⁺/H⁺交換活性參照已報(bào)道的(Apse et al/，1999)pH依賴的吖啶熒光猝滅方法進(jìn)行測定。將含終濃度為每毫升20μg的葉綠素的類囊體膜或20μg總蛋白的原生質(zhì)體加入到0.8ml的反應(yīng)液中，反應(yīng)緩沖液含有0.3M的甘露醇，5mM Tris/MES(pH8.0)，2mM DTT，5mM D-Glucose，1.5mM ATP，5μM quinacridine(QA)，1ml反應(yīng)緩沖液，放入比色杯中，使用帶有US-370發(fā)射光和375nm檢測光裝置的葉綠素?zé)晒庹{(diào)制儀器，在激發(fā)和發(fā)射波長分別是422nm和503nm的條件下進(jìn)行活性 的測定。

(1)比色杯中加入900μl QA反應(yīng)液；

(2)熒光讀數(shù)穩(wěn)定后加入100μl Mg₂SO₄(30mM，Mg2⁺)，加入50～100μg類囊體膜，混勻，熒光迅速降低；

(3)加入100μl EDTA(pH8.0，300mM)，混勻，熒光趨于穩(wěn)定；

(4)熒光讀數(shù)穩(wěn)定后加入12.5μl NaCl(4M)或25μl KCl(2M)，混勻，熒光升高；

(5)加入0.1μl莫能菌素(monensin，50mM，一種人工Na⁺/H⁺antiporter)或尼日利亞菌素(nigericin，5mM，一種人工K⁺/H⁺antiporter)，熒光得到恢復(fù)。

其中，QA反應(yīng)液：5mM Tris/MES(pH 8.0)，0.3M mannitol，2mM DTT，5mM D-Glucose，30mM TAMC，1.5mM ATP，5μM QA(quinacrine)。

1.8水稻根部離子流的測定

利用非損傷微測技術(shù)：掃描離子選擇電極技術(shù)(NMT100：Younger USA LLC，Amherst，MA)1002，USA)]測定5天幼苗根部的K⁺、H⁺、Na⁺離子流變化。將根部侵在含有0.5mM KCl，0.5mM NaCl，0.3mM MES，pH6.0的基礎(chǔ)溶液中30分鐘后，對根尖300微米的位置進(jìn)行掃描，通過將離子選擇性的微電極在30微米之間的距離進(jìn)行移動(dòng)，在預(yù)先設(shè)定的可編程頻率為0.3Hz偏移測定離子的濃度梯度。離子流按照菲克擴(kuò)散定律進(jìn)行計(jì)算：J＝-D0(DC/DX)(Sun et al.，2009)。

其中，J表示在x方向上的離子流，dc/dx為離子的濃度梯度，和D0是在特定介質(zhì)中的離子擴(kuò)散常數(shù)。穩(wěn)定離子流測定30分鐘，以確保到達(dá)一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)。瞬態(tài)的Na⁺，K⁺和H⁺的動(dòng)力學(xué)再繼續(xù)測定30分鐘。離子流數(shù)據(jù)使用iFluxes1.0(YoungerUSA，有限責(zé)任公司，阿默斯特，MA01002，USA)軟件獲取，使用JCAL V3.2.1(一個(gè)免費(fèi)的MS Excel電子表格，youngerusa.com或ifluxes.com)最終轉(zhuǎn)換成特定的離子流(pmol/cm²/s)。

1.9水稻完整葉綠體的制備

1)取新鮮水稻葉片10g，冰上剪碎，加入約40ml STN緩沖液[0.4M sucrose，50mM Tris-Cl(pH 7.6)，10mM NaCl(如需特殊用途，可不加NaCl)]；

2)勻漿機(jī)快速勻漿，勻漿液經(jīng)孔徑100μm的尼龍膜過濾將殘?jiān)鼮V去；

3)4℃1,000g離心5分鐘；

4)收集沉淀，用少量(約1ml)STN緩沖液在冰上輕輕懸浮沉淀；

5)配80％和40％的Percoll不連續(xù)梯度，80％Percoll 2ml，40％Percoll3ml，小心用膠頭滴管加入懸浮的沉淀；

6)4℃3,000g離心7分鐘，離心機(jī)的加速和減速調(diào)至最慢；

7)收集離心后40％Percoll和80％Percoll界面處的部分即為完整葉綠體；

8)加入STN緩沖液稀釋所得完整葉綠體，然后4℃2,000g離心5分鐘，收集沉淀重新用STN緩沖液懸浮，葉綠素濃度定量，待用。

1.10葉綠素濃度的測定

稱取少量的葉片剪碎置于Eppendorf管中，加入1ml 80％丙酮溶液，4℃冰箱避光浸泡過夜。待葉片發(fā)白后，混勻靜置，吸取上清分別于波長645nm和663nm處比色，所得的光密度(OD)值代入下列公式可計(jì)算出溶液中的葉綠素a，b的量，C為葉綠素濃度，以μg/μl表示：

C_a＝0.0127×OD₆₆₃-0.00269×OD₆₄₅

C_b＝0.0229×OD₆₄₅-0.00468×OD₆₆₃

C_a+b＝0.00802×OD₆₆₃+0.202×OD₆₄₅

總的葉綠素含量可以簡單用如下公式計(jì)算：C_a+b＝OD₆₅₂/34.5。

1.11植物總蛋白的提取

SDS法——將液氮凍存的植物材料研磨粉碎，按100μl/100mg組織的比例加入蛋白提取緩沖液(100mM NaPO₄(pH 7.0)，5mM DTT，1％SDS)混勻，沸水浴5min后13,000rpm室溫下離心10min。吸取上清后與等體積的2×SDS加樣緩沖液混勻，沸水浴5分鐘后得到的樣品可用來進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting。

1.12葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

利用調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(Walz，Effeltrich，德國)測定生長10天的幼苗葉片綠素?zé)晒鈪?shù)的變化(Schreiber et al.，1986)。水稻幼苗平放在測定專 用的平板上，暗適應(yīng)30分鐘后，使用450nm的激發(fā)藍(lán)光作為飽和脈沖光，進(jìn)行測定，成像信號使用ImagingWin軟件記錄在計(jì)算機(jī)屏幕上，選取直徑為100μm的面積測量葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm等。

實(shí)施例1、突變體的篩選與基因克隆、鑒定

本發(fā)明人從交通大學(xué)構(gòu)建的⁶⁰Coγ射線誘變γ的背景為粳稻9522的突變體庫中篩選獲得了一個(gè)葉片表現(xiàn)為中脈近軸面特異變白的穩(wěn)定遺傳的突變體，命名為oskea1(oryza sativa K⁺efflux antiporters)，見圖1A右圖，其中左圖為野生型對照。

與野生型9522相比，突變體oskea1表現(xiàn)出明顯的葉片中脈近軸面特異變白的葉片表型(圖1B)，而葉片的遠(yuǎn)軸面及其它部位的表型與野生型沒有明顯的差異(圖1C)。

與野生型9522相比，突變體oskea1的株高略低于野生型(圖1A)，劍葉葉片寬度高于野生型。本發(fā)明人統(tǒng)計(jì)在大田生長四個(gè)月的野生型和突變體的株高和劍葉葉片寬度，野生型的平均高度為1007±12cm，平均劍葉葉片寬度為14.5mm(n＝10)，突變體的平均高度為971±21cm，平均劍葉葉片寬度為15.9mm(n＝10)(n＝10)。與野生型相比，突變體的葉片中脈附近的細(xì)胞變大，但數(shù)目減少(圖1D-F)。

為了檢查該突變是否影響葉綠體的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人選取30d水稻小苗的葉片作超薄切片，置于透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體的葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)并沒有受到影響(圖2)。

由于篩選到的突變體是γ射線誘變的突變體，所以本發(fā)明人采用了圖位克隆的策略對突變體進(jìn)行基因定位。本發(fā)明人定位的群體是通過將粳稻9522背景的oskea1與秈稻廣陸矮四號雜交，得到一個(gè)有4956個(gè)突變體單株的定位群體。最后本發(fā)明人將突變位點(diǎn)鎖定在四號染色體分子標(biāo)記SN10和分子標(biāo)記SN11之間46kb的范圍(圖3A)。根據(jù)TIGR數(shù)據(jù)庫(www.tigr.org)的預(yù)測，在這個(gè)46kb的區(qū)域共有7個(gè)候選基因，其中有3個(gè)基因預(yù)測是葉綠體定位基因，包括1個(gè)鉀離子外排逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、1個(gè)分裂和聚合腺苷酸特異性因子5和1個(gè)DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白；另外還有3個(gè)預(yù)測的反轉(zhuǎn)座子蛋白和1個(gè) 假定蛋白。本發(fā)明人認(rèn)為前三個(gè)基因比較可能是引起oskea1突變表型的基因。通過對oskea1的這三個(gè)基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在鉀離子外排逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的第11個(gè)外顯子處(2284～2287bp)缺失4個(gè)堿基(ATTG)(圖3A)，從而導(dǎo)致該基因移框，從而使翻譯提前終止。根據(jù)TIGR數(shù)據(jù)庫記載，OsKEA1基因全長9230bp，共有21個(gè)外顯子，cDNA長為3465bp，是一個(gè)控制水稻K+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼1154個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該基因在數(shù)據(jù)庫中的登錄號為Os04g0682800。通過TargetP v1.1和ChloroP v1.1預(yù)測KEA1在N端有41aa的信號肽；通過TMHMM預(yù)測，該蛋白是一個(gè)十次跨膜的鉀離子外排逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有一個(gè)很保守的Na+/H+交換子結(jié)構(gòu)域，屬于CPA(Cation/H+Antiporter)轉(zhuǎn)運(yùn)體中的CPA2家族。而在擬南芥中則存在6個(gè)成員AtKEA1～6，屬于CPA2家族中的KEA亞家族。通過分析同源蛋白序列發(fā)現(xiàn)，水稻OsKEA1多肽與擬南芥AtKEA2多肽的氨基酸序列有69％的相似性。

為了驗(yàn)證定位結(jié)果，本發(fā)明人對突變體oskea1做互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。將一段包含OsKEA1基因的11977bp的基因組序列片段通過BamHI和SalI插入到用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1301后(p1301-com)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到突變體oskea1的愈傷中，得到了一百多株的轉(zhuǎn)基因植株，得到的陽性轉(zhuǎn)基因植株(com-oskea1)都恢復(fù)了野生型的表型(圖3B)。本發(fā)明人使用OsKEA1重組蛋白制作抗體，進(jìn)行免疫印跡分析，在野生型和互補(bǔ)植株中能觀察到一條分子量約為124kDa的條帶，但在突變體中缺失該蛋白(圖3C)，表明了定位的正確性。

將編碼OsKEA1基因cDNA序列的361bp的特異性序列片段(RI1)和437bp處于Na+/H+交換子結(jié)構(gòu)域的保守性片段(RI3)分別通過BamHI/KpnI和SacI/SpeI正反向插入到用于RNAi的pTCK309載體中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到野生型中，得到的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)GUS染色為陽性的植株，表現(xiàn)出不同程度的突變表型，最為嚴(yán)重的植株白化死掉，部分植株呈現(xiàn)白化表型，比較多的植株呈現(xiàn)出突變體oskea1的白色中脈表型(圖4)。

實(shí)施例2、OsKEA1基因的表達(dá)模式RT-PCR

以上結(jié)果驗(yàn)證了定位的正確性，接著本發(fā)明人研究了OsKEA1基因在水稻 中的表達(dá)模式。將一段包含OsKEA1基因啟動(dòng)子序列的3018bp的基因組序列片段通過BamHI和NcoI插入到用于轉(zhuǎn)化水稻的帶有GUS基因的雙元載體pCAMBIA1301中，構(gòu)建得到p1301:Pro_OsKEA1:GUS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型9522的愈傷，得到7株轉(zhuǎn)基因植株，通過GUS活性的組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，OsKEA1基因在水稻的分蘗芽、根、莖、莖節(jié)、葉、葉鞘、枝梗、花中的維管束均有表達(dá)(圖5A)。本發(fā)明人分別提取水稻野生型9522開花時(shí)期不同組織以及愈傷組織的RNA，以ACTIN作為內(nèi)參，用OsKEA1基因的特異引物做RT-PCR，發(fā)現(xiàn)水稻OsKEA1基因在愈傷、根、莖、花、葉、葉鞘等不同組織中均有表達(dá)(圖5B)。

實(shí)施例3、水稻OsKEA1基因的定位

根據(jù)預(yù)測OsKEA1在N端有41aa的信號肽，為了證明OsKEA1是定位于葉綠體的，本發(fā)明人將OsKEA1基因cDNA序列的前300bp的特異性序列片段融合到eGFP的N端(OsKEA1-N-GFP)，將由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsKEA1-N-GFP構(gòu)建分別轉(zhuǎn)染到水稻原生質(zhì)體中，48h后通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP的熒光與葉綠素自發(fā)熒光情況。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsKEA1-N-GFP融合蛋白的黃綠熒光信號與葉綠素自發(fā)熒光信號共定位于葉綠體中(圖5C)。這就證明了OsKEA1的確是定位于葉綠體的。

并且，發(fā)明人利用實(shí)驗(yàn)室制作的OsKEA1多克隆抗體對水稻不同組織進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，OsKEA1在水稻根、莖、葉和葉脈中都有積累，但在突變體Oskea1中檢測不到該信號(圖6A)，而作為對照的光系統(tǒng)II蛋白D2在綠色組織中均有積累，野生型和突變體之間沒有差異。

為了進(jìn)一步了解OsKEA1在水稻葉綠體中不同部分的分布，發(fā)明人提取了完整葉綠體后，通過蔗糖密度梯度離心方法，分離到葉綠體不同的組分，進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsKEA1主要分布在類囊體膜，在葉綠體被膜上也有少量分布，但不存在于基質(zhì)中(圖6B)。

實(shí)施例4、OsKEA1提供葉綠體K⁺/H⁺交換活性

通過TMHMM預(yù)測，OsKEA1蛋白是一個(gè)十次跨膜的鉀離子外排逆向轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白，有一個(gè)很保守的Na⁺/H⁺交換子結(jié)構(gòu)域，為了證明OsKEA1是具有Na⁺(K⁺)/H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)活性，本發(fā)明人利用反映跨膜H⁺梯度的喹吖橙結(jié)合H⁺發(fā)生熒光淬滅的特性，來檢測原生質(zhì)體和葉綠體類囊體膜依賴Na⁺或K⁺的H⁺移動(dòng)活性。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體Oskea1的質(zhì)膜的Na⁺/H⁺和K⁺/H⁺交換活性都明顯地低于野生型的。尤其是在低濃度范圍，突變體Oskea1的K⁺/H⁺交換活性與野生型相比明顯降低(圖7)。

另一方面，在突變體Oskea1類囊體膜中，與離子交換活性相關(guān)的ATP合酶的活性低于野生型(圖8A)。K⁺/H⁺交換活性在低濃度范圍內(nèi)與野生型沒有差別，在KCl濃度高于50mM以上，最大降低40％(圖8B)，而Na⁺/H⁺交換活性明顯地低于野生型的，最大降低幅度為81％(圖8C)。

本發(fā)明人認(rèn)為，OsKEA1能提供原生質(zhì)體和葉綠體類囊體膜K⁺/H⁺或Na⁺/H⁺交換活性。

實(shí)施例5、OsKEA1突變導(dǎo)致根部Na⁺，K⁺，H⁺離子流受到抑制

為了檢查OsKEA1的突變是否影響到離子流，本發(fā)明人利用非損傷微測定技術(shù)來測定根部表面的離子流。

圖9A-C顯示，與野生型相比，突變體Oskea1根部的Na⁺，K⁺離子流下降了50％，H⁺離子流甚至變?yōu)樨?fù)值。而互補(bǔ)植株(Com-Oskea1)則呈現(xiàn)為接近野生型的性狀。

這些結(jié)果表明，OsKEA1對于根部離子流是不可缺少的。

實(shí)施例6、突變體葉片的Na⁺，K⁺含量提高

為了知道突變體Oskea1的K⁺/H⁺交換活性和根部離子流的降低是否影響到這些離子的含量，本發(fā)明人分析了培養(yǎng)10天的幼苗葉片和根部的離子含量，與野生型相比，突變體葉片的鈉離子含量提高了2倍左右，葉綠體鈉離子含量增加了1.4倍左右，另一方面，葉片的鉀離子含量增加了30％左右，葉綠體中增加了17％，類囊體膜增加了80％，但根中這些離子含量卻變化不大(圖8D-G)。

這些結(jié)果表明，OsKEA1的突變導(dǎo)致葉綠體鉀鈉離子外排受阻，從而導(dǎo)致 這些離子積累于葉片、葉綠體和類囊體膜中。

實(shí)施例7、突變體對NaCl和堿性敏感

一般土壤的pH值為5.7-6.0是適合水稻植物生長的，而pH高于7.0則屬于高pH堿性土壤。

根據(jù)OsKEA1參與離子外排和調(diào)節(jié)植物pH的性質(zhì)，首先，本發(fā)明人檢查突變體的生長是否對額外添加鉀和鈉離子的培養(yǎng)基敏感，當(dāng)在正常的培養(yǎng)基(1/2的MS培養(yǎng)基)中額外添加75mM的NaCl，培養(yǎng)5天后，突變體Oskea1的幼苗明顯地比野生型的矮小，而互補(bǔ)植株則能夠回復(fù)到接近野生型的表型(圖10A)。在正常的培養(yǎng)基中添加較低濃度的NaCl(25mM)培養(yǎng)3周后，突變體的葉片變黃、甚至壞死(圖10B)。與此形成對照，額外添加30mM KCl卻不影響突變體的生長(圖10C-D)。這些結(jié)果說明，突變體對NaCl敏感，但對KCl不敏感。

接著，本發(fā)明人檢查了不同pH對突變體生長的影響，在pH4.0或5.7培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，突變體的生長并不受到影響(圖11A-D)，然而，在pH7.0的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天后，突變體幼苗明顯地比野生型和互補(bǔ)植株矮小，培養(yǎng)3周后，突變體的葉片呈現(xiàn)漂白表型(圖11E、F)。

上述結(jié)果表明，OsKEA1在應(yīng)對高pH條件發(fā)揮作用。

實(shí)施例8、突變體在鹽堿脅迫條件下光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率降低

根據(jù)OsKEA1定位于葉綠體和突變體在pH7.0生長時(shí)葉子被輕微地漂白，本發(fā)明人認(rèn)為該基因在光合作用中發(fā)揮作用，分析比較了在不同條件生長的野生型，突變體和互補(bǔ)植株的光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。圖12顯示，與野生型和互補(bǔ)植株相比，生長在pH4.0條件下，突變體的Fv/Fm值沒有明顯的變化，而在pH5.7條件下，F(xiàn)v/Fm稍微降低，當(dāng)生長在pH7.0條件下，三者的Fv/Fm值都顯著地降低，突變體降低得更顯著。

另一方面，當(dāng)生長在pH5.7，額外增加30mM KCl條件下，突變體的Fv/Fm值沒有明顯的變化，但在外加25mM NaCl的條件下，F(xiàn)v/Fm值就稍微降低。

這些結(jié)果表明，OsKEA1在鹽堿脅迫條件下，起光保護(hù)作用。

實(shí)施例9、過表達(dá)OsKEA1轉(zhuǎn)基因水稻的表型

為了進(jìn)一步驗(yàn)證OsKEA1基因的功能，將編碼OsKEA1基因的3465bp的全長cDNA序列片段通過SpeI和PacI插入到帶有Ubiquitin啟動(dòng)子的用于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體pCAMBIA1300中，構(gòu)建得到p1300:Pro_Ubiquitin:OsKEA1載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到突變體oskea1和野生型9522(WT)的愈傷中，得到的一百多株轉(zhuǎn)基因植株(Ov-OSKEA1)也都表現(xiàn)出野生型表型；同時(shí)，將轉(zhuǎn)基因植株提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，以ACTIN作為內(nèi)參，用OsKEA1基因的特異引物做RT-PCR，結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株中OsKEA1基因表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型的水平。本發(fā)明人進(jìn)一步利用免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)證明了過表達(dá)OsKEA1的植株的OsKEA1的含量無論是在葉片中還是在維管組織中顯著高于野生型(圖13C-D)。

這些實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明人得到了OsKEA1基因的過表達(dá)植株，這對于將OsKEA1的功能應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，提供了很好的改良植物。

為了檢查過表達(dá)OsKEA1的轉(zhuǎn)基因植株是否能耐受鹽脅迫，在正常的培養(yǎng)基(1/2的MS培養(yǎng)基)中額外添加25mM的NaCl，培養(yǎng)3周后，觀察生長表型。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，無論是在鹽脅迫條件下，還是在正常條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的生長明顯的好于野生型(圖13A-B)。

實(shí)施例10、過表達(dá)OsKEA1轉(zhuǎn)基因水稻的排鹽能力、光合能力和產(chǎn)量

為了評估OsKEA1過表達(dá)的效果，本發(fā)明人首先比較了轉(zhuǎn)基因株系、突變體和野生型的鈉離子通過篩管流的下載速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的葉片中鈉離子由維管系統(tǒng)篩管流下載的速度比野生型強(qiáng)，相反，OsKEA1突變使得鈉離子的維管束篩管流下載速度變慢(圖14A)。

接著本發(fā)明人檢測了正常條件和堿脅迫條件下光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率，圖14B顯示，雖然在培養(yǎng)箱條件下，水稻適合的pH范圍內(nèi)(酸性條件下pH4.0-5.7)，反映光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm與野生型沒有差異，但在堿性條件下(pH7.0)條件下，F(xiàn)v/Fm比野生型高大約16％。

本發(fā)明人還比較了大田栽培條件下，最大展開功能葉片中反映跨類囊體 膜質(zhì)子梯度的毫秒級延遲發(fā)光慢相的比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)株系的毫秒級延遲發(fā)光慢相的比值高于野生型的12％，相反，OsKEA1突變導(dǎo)致該值大約下降14％(圖14C)，說明在田間條件下，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系具有較高的光合能力。

本發(fā)明人還評估了大田栽培條件下的單株水稻種子產(chǎn)量，除了一個(gè)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量比野生型略有增加以外，兩個(gè)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量均高于野生型的20％左右(圖14D)。

以上結(jié)果說明，發(fā)明人構(gòu)建和篩選到的過表達(dá)OsKEA1轉(zhuǎn)基因水稻具有較強(qiáng)的抗鹽堿脅迫能力，在鹽堿脅迫條件下以及在大田栽培條件下，能維持較高的光合作用效率，具有較高的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。本發(fā)明為水稻等農(nóng)作物改良提供了新的思路、以及提供具有顯著的增產(chǎn)潛力和應(yīng)用價(jià)值的育種材料。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。