本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及降低IAA10蛋白及其編碼基因表達(dá)在提高植物對(duì)水稻矮縮病毒抗性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生長素在植物生長發(fā)育的很多方面發(fā)揮作用，如細(xì)胞的分裂和分化、胚的發(fā)育、頂端優(yōu)勢(shì)的形成、莖的伸長、側(cè)根的發(fā)育等。生長素能夠在很短時(shí)間內(nèi)改變其所調(diào)控的基因的表達(dá)。有3類基因能夠在施加生長素后被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，它們分別為：Aux/IAA(AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID)家族、GH3(GRETCHENHAGEN-3)家族和SAUR(small auxin up RNA)家族。Aux/IAA家族基因編碼一類半衰期很短的轉(zhuǎn)錄抑制子。在生長素濃度很低時(shí)，它們的轉(zhuǎn)錄水平也很低，在生長素水平升高后，它們被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，因此這類基因在生長素的快速瞬時(shí)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

Aux/IAA家族蛋白很龐大，在水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的該家族成員至少有31個(gè)，擬南芥中則有29個(gè)。雖然IAA家族蛋白的氨基酸序列差異很大，但是它們的結(jié)構(gòu)卻具有很高的相似性，例如它們都具有核定位信號(hào)，大部分成員都具有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(Domain I、Domain II、Domain III和Domain IV)。Doman I含有保守的LxLxL序列，具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，它不僅能夠抑制與之融合的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性，而且能夠抑制與它相互作用的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。Domain II包含一段高度保守的序列，能夠被該蛋白泛素化過程中的E3識(shí)別，與IAA蛋白的降解相關(guān)。Domain III和Domain IV是介導(dǎo)蛋白－蛋白相互作用的區(qū)域，能夠使同一種IAA蛋白或者不同種IAA蛋白形成二聚體，還能使IAA蛋白與ARF(auxin response factor)蛋白形成二聚體。因此IAA家族蛋白是一類半衰期很短的具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的蛋白因子。

IAA蛋白是auxin通路中非常關(guān)鍵的因子。通常情況下，IAA蛋白與轉(zhuǎn)錄因子ARF家族成員相互作用，形成異源二聚體，抑制ARF調(diào)控的下游基因的表達(dá)。在生長素水平升高的情況下，IAA蛋白和F-box Transport Inhibitor Response/Auxin Signaling F-box(TIR1/AFB)作為auxin的共同受體，它們之間的相互作用增強(qiáng)。TIR1是泛素E3連接酶SCF^TIR1復(fù)合體的一部分，其中TIR1是復(fù)合體的F-box，負(fù)責(zé)結(jié)合底物，然后與復(fù)合體中的其他成分配合，將泛素ubiquitin加到底物上，加上泛素串的底物可以被26S蛋白酶體識(shí)別、降解。Auxin像膠水一樣，將TIR1和Aux/IAA蛋白緊密地結(jié)合在一起，使得Aux/IAA蛋白被SCF^TIR1復(fù)合體泛素化，通過26S酶體途徑降解，從而解除了其對(duì)ARF的抑制作用，啟動(dòng)一系列與生長發(fā)育及抗病相關(guān)的基因的表達(dá)。

水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus，RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸 孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。RDV是引起水稻矮縮病的病原，可以感染水稻，造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。RDV的傳播需借助于昆蟲介體葉蟬。RDV為雙鏈RNA病毒，其基因組為十二條雙鏈RNA。根據(jù)這十二條雙鏈RNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率由慢到快，分別命名為S1到S12。RDV基因組編碼至少七種結(jié)構(gòu)蛋白，包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9；五種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12。

P2是RDV的外殼蛋白，由S2編碼，它能夠與水稻內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶及其類似蛋白相互作用，引起水稻赤霉素含量的降低，是造成水稻矮縮癥狀的原因之一(Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.)。另外，P2在RDV的昆蟲介體葉蟬細(xì)胞中，能夠引起細(xì)胞膜的融合，說明該蛋白在RDV侵染葉蟬過程中發(fā)揮作用(Zhou et al.,2007，The P2capsidprotein of the nonenveloped rice dwarf phytoreovirus induces membrane fusion in insect host cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA.104(49):19547-19552.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于調(diào)控植物抗水稻矮縮病(或提高植物對(duì)水稻矮縮病毒抗性)的蛋白IAA10，所述蛋白是：

(A)具有序列表中的序列1所示的氨基酸序列的蛋白；

(B)包括與序列1所示的氨基酸序列具有95％以上，優(yōu)選98％以上的同一性的氨基酸序列且具有對(duì)水稻矮縮病毒抗性的蛋白。

上述(B)的蛋白可以通過置換、取代、附加或缺失(A)的序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸來獲得。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于調(diào)控植物抗水稻矮縮病(或提高植物對(duì)水稻矮縮病毒抗性)的編碼蛋白IAA10的基因，所述基因是：

(A)具有序列表中的序列2所示的堿基序列的DNA分子；

(B)編碼具有序列表中的序列1所示的氨基酸序列的蛋白的DNA分子；

(C)編碼蛋白的DNA分子，所述蛋白為包括與序列1所示的氨基酸序列具有95％以上，優(yōu)選98％以上的同一性的氨基酸序列且具有對(duì)水稻矮縮病毒抗性的蛋白。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供上述基因的RNAi(RNA干擾)載體。該RNAi載體例如含有反向互補(bǔ)形式(發(fā)夾結(jié)構(gòu))的上述編碼蛋白IAA10的基因。

所述載體可以使用現(xiàn)有的表達(dá)載體。現(xiàn)有的植物表達(dá)載體包括但不局限于pCambia2300、pCambia1300、pCambia1301、pCambia3301、pWM101等。具體重組載體是本申請(qǐng)實(shí)施例中制備的pCambia2300-actin-IAA10RNAi。

本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述表達(dá)載體的方法，該方法包括：

1)獲得序列2所示的DNA分子；

2)根據(jù)序列2所示的DNA分子設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端加上所需酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物序列為IAA10-5'BamHI：5’-GTGGATCCAAATGAGAGGAGGAGTAGCTGG-3’，IAA10-3'XhoI：5’-GCCTCGAGTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’；

3)用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻的總RNA，用該公司的SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

4)以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，以上述基因特異性引物IAA10-5'BamHI和IAA10-3'XhoI進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到861bp的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸；

5)回收PCR產(chǎn)物后用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行酶切，回收851bp帶有粘性末端的PCR產(chǎn)物；將載體pGADT7用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sal I雙酶切，回收7987bp載體骨架；將上述851bp帶有粘性末端的PCR產(chǎn)物與7987bp載體骨架用T₄連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測(cè)序，該質(zhì)粒為將序列表中序列2所示的基因IAA10插入載體pGADT7的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pGAD-IAA10，即為重組載體；

6)以pGAD-IAA10為模版，IAA10-5'SpeI(序列為：5’-GTACTAGTATGAGAGGAGGAGTAGCTGG-3’和IAA10-3'BglII(序列為：5’-GCAGATCTTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到859bp的PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物用SpeI和BglII雙酶切，連入到用XbalI和BamHI(和SpeI和BglII為同尾酶)酶切過的中間載體pUCCRNAi上，經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒pUCC-IAA10為將IAA10插入pUCCRNAi質(zhì)粒的XbalI和BamHI酶切位點(diǎn)間得到的載體，再將用SpeI和BglII雙酶切的PCR產(chǎn)物連入到用SpeI和BglII雙酶切過pUCC-IAA10質(zhì)粒中，得到pUCC-IAA10RNAi載體，經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒pUCC-IAA10RNAi為將IAA10以反向互補(bǔ)形式插入pUCCRNAi質(zhì)粒的XbalI和BamHI酶切位點(diǎn)和SpeI和BglII酶切位點(diǎn)間得到的載體；

7)將pUCC-IAA10RNAi載體用PstI單酶切，瓊脂糖凝膠回收得到1939bp酶切產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接入用PstI單酶切得到的10379bp的pCambia2300-Actin1-ocs載體骨架上，得到重組載體pCambia2300-actin-IAA10RNAi。

本發(fā)明的再一個(gè)目的提供了上述蛋白IAA10或其編碼基因或所述編碼基因的RNAi(RNA干擾)載體在提高植物對(duì)水稻矮縮病毒抗性中(或在調(diào)控植物抗水稻矮縮病中)的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus)。

上述應(yīng)用中，所述植物優(yōu)選為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述包括如下步驟：將上述蛋白IAA10的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性低于所述目的植物；或者將上述基因以發(fā)夾結(jié)構(gòu)形式轉(zhuǎn)入目的植物中，得到其RNAi的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物。

上述方法中，所述蛋白IAA10的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2，或者為編碼具有序列表中的序列1所示的氨基酸序列的蛋白的DNA分子，或者編碼蛋白的DNA分子，所述蛋白為包括與序列1所示的氨基酸序列具有95％以上，優(yōu)選98％以上的同一性的氨基酸序列且具有對(duì)水稻矮縮病毒抗性的蛋白。

上述方法中，所述水稻矮縮病的病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。

上述方法中，所述蛋白IAA10的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物。

所述重組載體為將所述蛋白IAA10的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的重組載體。例如通過以上所述方法制備的重組載體。上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。

所述轉(zhuǎn)基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物具體體現(xiàn)在接RDV后，所述轉(zhuǎn)基因植物的感染的RDV病毒的植株數(shù)目少于所述目的植物；可通過鑒定是否含有RDV病毒的目的基因(S2的部分片段)或者植株的感病特征來確定感染的RDV病毒的植株。

上述蛋白IAA10在作為蛋白-泛素連接酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

其中植物表達(dá)載體包括但不局限于pCambia2300、pCambia1300、pCambia1301、pCambia3301、pWM101等；水稻品種優(yōu)選為對(duì)RDV敏感的品種如中花11、秀水11、日本晴、武3等；水稻組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法可選自農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管導(dǎo)入法、脂質(zhì)體融合法以及其他任意可將質(zhì)粒導(dǎo)入的方法。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，通過置換、取代、附加或缺失蛋白序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，可對(duì)其進(jìn)行修飾而不改變其功能。因此，本發(fā)明應(yīng)該被理解為包括了對(duì)序列1所示的(IAA10)蛋白進(jìn)行的上述修飾。

IAA10基因的堿基序列不局限于序列表中序列2所示，還包括具有將IAA10及帶有上述修飾的IAA10蛋白中各氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的任一密碼子進(jìn)行選擇并組合的DNA序列。該密碼子的選擇可以按照常規(guī)方法，也可以參考宿主的密碼子偏好型。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RDV外殼蛋白P2能夠與IAA10相互作用，提高IAA10的穩(wěn)定性，促進(jìn)病毒侵染，而將IAA10表達(dá)量通過RNAi的方式降低的水稻，對(duì)RDV的抗性增強(qiáng)。

附圖說明

圖1為P2和IAA10蛋白在酵母中相互作用的結(jié)果；

圖2為免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P2和IAA10相互作用的結(jié)果；

圖3為體外降解實(shí)驗(yàn)證明RDV的存在使得IAA10穩(wěn)定性增強(qiáng)；

圖4為體外降解實(shí)驗(yàn)證明P2的存在使得IAA10穩(wěn)定性增強(qiáng)；

圖5為轉(zhuǎn)IAA10水稻的Western鑒定；

圖6為轉(zhuǎn)IAA10RNAi水稻的Real-time鑒定；

圖7為轉(zhuǎn)IAA10和IAA10RNAi水稻和野生型水稻在RDV侵染后的RDV病毒相關(guān)基因的RT-PCR檢測(cè)；

圖8為感染RDV的不同水稻株系癥狀圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下將用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些實(shí)施例并非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1、IAA10蛋白及其編碼基因的獲得

一、IAA10蛋白及其編碼基因的獲得

水稻文庫的構(gòu)建所用試劑盒為HybriZAP-2.1Two-HybridPredigested Vector/GigapackCloning Kit(Stratagene)，文庫構(gòu)建及篩選方法根據(jù)說明書進(jìn)行。所用誘餌克隆pGBK-S2與專利號(hào)ZL200510114386.X所公布克隆相同。所用酵母菌株為AH109。篩選得到的陽性克隆經(jīng)測(cè)序和序列分析，確定其編碼的蛋白片段具有序列表中序列1所示的氨基酸序列的91-280個(gè)氨基酸，將該蛋白全長(即序列1對(duì)應(yīng)蛋白)命名為IAA10，其編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?所示的核苷酸，將其命名為IAA10。

二、IAA10全長序列的克隆及含有該片段的重組載體的獲得

根據(jù)序列2設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端加上所需酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物序列為IAA10-5'BamHI：5’-GTGGATCCAAATGAGAGGAGGAGTAGCTGG-3’，IAA10-3'XhoI：5’-GCCTCGAGTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’。

依照說明書，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻(Oryza sativa L.japonica cv.Zhonghua 11,許昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子引導(dǎo)Gt1基因表達(dá)載體的構(gòu)建》，上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010年4月第39卷第2期，204頁，公眾可從北京大學(xué)獲得)的總RNA，用該公司的SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所用引物為16個(gè)核苷酸的Oligod(T)引物。

以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，以上述基因特異性引物IAA10-5'BamHI和IAA10-3'XhoI進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)，得到861bp的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸。

回收PCR產(chǎn)物后用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行酶切，回收851bp帶有粘性末端 的PCR產(chǎn)物；將載體pGADT7(Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：630442)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sal I雙酶切，回收7987bp載體骨架；將上述851bp帶有粘性末端的PCR產(chǎn)物與7987bp載體骨架用T₄連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測(cè)序，該質(zhì)粒為將序列表中序列2所示的基因IAA10插入載體pGADT7的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pGAD-IAA10，即為重組載體。

實(shí)施例2、體外證明IAA10蛋白與RDV P2的相互作用

一、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明IAA10與RDV P2的相互作用

將實(shí)施例1得到的重組載體pGAD-IAA10與pGBK-S2(S2為RDV P2蛋白的編碼基因，RDV P2蛋白的編碼基因?qū)雙GBK中得到的。記載該載體的非專利文獻(xiàn)為Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945；公眾可從北京大學(xué)獲得)共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109(購自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為630444)，酵母轉(zhuǎn)化方法采用公知的PEG/LiAc法；轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布營養(yǎng)缺陷型平板SD/-Trp-Leu，30℃條件下培養(yǎng)2天。轉(zhuǎn)化子劃線至SD/-Trp-Leu-His-Ade營養(yǎng)缺陷型平板，30℃培養(yǎng)4天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長情況。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)負(fù)對(duì)照pGADT7(產(chǎn)品目錄號(hào)為：630442)和pGBK-S2、pGAD-IAA10和pGBK(購自Clontech公司產(chǎn)品目錄號(hào)為630443)。

結(jié)果如圖1所示(A：pGAD-SV40T和pGBK-P53(陽性對(duì)照)；B：pGAD-IAA10和pGBK-S2；C：pGAD-IAA10和pGBK；D：pGAD和pGBK-S2；E：pGAD-SV40T和pGBK-Lam(陰性對(duì)照))。結(jié)果證明，IAA10全長蛋白與RDVP2能在酵母中相互作用。

二、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明IAA10與RDV P2的相互作用

1)pCambia1301-FLAGIAA10及pCambia1301-HAS2克隆的構(gòu)建pCambia1301-FlagIAA10載體的構(gòu)建：以pGAD-IAA10為模板，以引物FlagIAA10-5'SalI(序列為:5’-CCGTCGACATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGAGAGGAGGAGTAGCTG-3’)和IAA10-3’BamHI(序列為：5’-GCGGATCCTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到883bp的PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物用SalI和BamHI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)過同樣酶切pRTL2質(zhì)粒的3852bp的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pRTL2-FLAGIAA10，經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒pRTL2-FLAGIAA10為將FLAG-IAA10插入pRTL2質(zhì)粒的SalI和BamHI酶切位點(diǎn)間得到的載體。

然后將pRTL2-FLAGIAA10用HindIII單酶切，得到1985bp的酶切產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，與用同樣酶酶切的pCambia1301質(zhì)粒(參見Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)，得到11837bp的載體骨架連接，得到重組載體pCambia1301-FlagIAA10(HindIII單酶切，得到1985bp的酶切產(chǎn)物為陽性)。

pCambia1301-HAS2(記載該載體的非專利文獻(xiàn)為：Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945；公眾可從北京大學(xué)獲得)，其為將HAS2(HAP2是在P2蛋白上帶了HA標(biāo)簽)構(gòu)建入pCambia1301。

pCambia1301-FLAGIAA10和pCambia1301-HAS2分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化方法為公知的電擊轉(zhuǎn)化方法，得到EHA105/pCambia1301-FLAGIAA10和EHA105/pCambia1301-HAS2。

2)HAP2和FLAGIAA10在煙草中的表達(dá)

分別挑取EHA105/pCambia1301-FLAGIAA10和EHA105/pCambia1301-HAS2單菌落，接入2ml LB液體培養(yǎng)基(含有Kanamycin 100mg/L，Rifampicin 50mg/L)，28℃振蕩培養(yǎng)16hr(hr為小時(shí)hour的簡(jiǎn)寫)。1:50轉(zhuǎn)接入10ml LB液體培養(yǎng)基(含有Kanamycin 100mg/L，Rifampicin50mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.8。4000rpm(rpm為每分鐘轉(zhuǎn)速)離心5min(min為分鐘)收菌。AS buffer(10mM MES，150μM AS，10mM MgCl₂)重懸，調(diào)OD₆₀₀至1.0。

將兩種菌液以1:1(體積)混合，通過壓力注射方法注射煙草N.benthamiana(記載該煙草的非專利文獻(xiàn)為Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得)并分別單獨(dú)取兩種菌懸液通過壓力注射方法注射煙草作為負(fù)對(duì)照。煙草繼續(xù)生長3天后，將注射的葉片置于液氮中研磨成粉末。

3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

取約500mg上述葉片粉末加入1.5ml離心管中，加入1ml IP Buffer(150mM NaCl，50mM Tris-Cl(pH7.5)，0.1％NP-40，5mM DTT，每50ml加1片蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablets,EDTA-free；Roche)，混勻后4℃，12000rpm離心10min，將上清吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管中。再次以上面條件離心5min，將上清吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管中，防止吸到沉淀，得到煙草蛋白提取物。

在上述步驟中得到的煙草蛋白提取物中加入20μlprotein G beads(GE healthcare，17-0618-06)，同時(shí)加入0.2μl FLAG抗體(Sigma，F(xiàn)3165)，4℃溫育1.5hr。4℃，1000rpm離心1min，吸掉上清。用IP Buffer 洗beads3次。加入50μl 3×protein sample buffer (125mM Tris-Cl(pH6.8)，20％甘油，6％SDS，0.004％溴酚藍(lán)，30mM DTT)，95℃加熱5min，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用抗體為anti-FLAG-HRP(sigma)和anti-HA-Peroxidase(Roche)。

結(jié)果如圖2所示，表明用FLAG抗體能夠?qū)LAGIAA10和HAP2同時(shí)沉淀下來，說明這兩種蛋白之間相互作用。

實(shí)施例3、P2能夠減弱IAA10的降解

一、表達(dá)克隆構(gòu)建及蛋白的表達(dá)

以pGAD-IAA10質(zhì)粒為模板，用IAA10-5'SalI(序列為：5’-GTGTCGACATGAGAGGAGGAGTAGCTGG-3’和IAA10-3'HindIII(序列為：5’-GCAAGCTTTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到859bp的PCR產(chǎn)物。將此859bp的PCR產(chǎn)物以SalI和HindIII雙酶切后，凝膠電泳回收853bp的酶切產(chǎn)物；將pMAL-p2x質(zhì)粒(New England Biolabs，E8000S，本身表達(dá)MBP蛋白)SalI和HindIII雙酶切，凝膠電泳回收6703bp的載體骨架；將853bp的酶切產(chǎn)物和6713bp的載體骨架以T4DNA連接酶連接，得到重組載體pMAL-p2x-IAA10，經(jīng)過測(cè)序，該重組載體為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pMAL-p2x的SalI和HindIII酶切位點(diǎn)間得到的載體，命名為pMAL-p2x-IAA10。

將pMAL-p2x-IAA10和pMAL-p2x質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株Rosetta(DE3)：取0.5μl質(zhì)粒，加入50μl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上靜置30min；42℃熱激90sec，加入1ml新鮮LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1hr；3000rpm離心2min收集菌體，涂布LB平板(含100mg/L Ampicillin)，得到Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-IAA10(SalI和HindIII雙酶切鑒定，得到853bp的酶切產(chǎn)物的為陽性)和Rosetta(DE3)/pMAL-p2x。

分別挑Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-IAA10和Rosetta(DE3)/pMAL-p2x單菌落接于5ml LB培養(yǎng)基中(含100mg/L Ampicillin)，37℃過夜培養(yǎng)。1:200轉(zhuǎn)接于300ml LB培養(yǎng)基中(含100mg/L Ampicillin)培養(yǎng)至OD600約為0.6。加入IPTG至終濃度1mM，誘導(dǎo)表達(dá)4hr，得到Rosetta(DE3)/pMAL-p2x-IAA10菌液和Rosetta(DE3)/pMAL-p2x菌液。5000rpm離心10min收集菌體。加入5ml過柱緩沖液(20mM Tris-Cl pH7.5，100mM NaCl，0.1％NP-40，1mM DTT，0.01M PMSF)懸浮菌體，超聲破碎。4℃，12000rpm,離心20min，取上清液加入到用8倍體積過柱緩沖液洗滌過的Amylose Resin Column頂，使其緩緩流過柱體。用12倍體積過柱緩沖液洗滌。用含有10mM麥芽糖的過柱緩沖液洗脫純化的蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白的濃度(Bio－Rad)，調(diào)節(jié)至4mg/ml。

二、MBP-IAA10在水稻總蛋白提取物中的降解實(shí)驗(yàn)

RDV感病水稻和健康水稻在液氮中研磨成粉末，加入適量體外降解緩沖液(25mM Tris－HCl，pH7.5，10mM NACl，10mM MgCl2，4mM PMSF，5mM DTT，10mM ATP)懸浮。4℃，12000rpm離心10min，將上清吸出置于新的離心管中。再次離心去掉沉淀。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)至相同濃度。在490μlRDV感病水稻和健康水稻蛋白提取物中分別加入10μl純化的MBP－IAA10蛋白或10μlMBP蛋白。室溫溫育。在0min，5min，15min，30min，60min，120min分別取樣40μl，加入20μl 3×protein samplebuffer，100℃加熱5min，取10μl進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)預(yù)染Marker條帶位置，將膠分為三部分，分子量最大的部分(95kDa以上)用來Western blot檢測(cè)P2蛋白，中間部分(95kDa～72kDa)用來Weestrn blot檢測(cè)MBP－IAA10，分子量最小的部分(72kDa以下)用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)水稻總蛋白的量。

結(jié)果如圖3所示，溫育60min后，健康水稻總蛋白提取物中的MBP-IAA10蛋白已經(jīng)檢測(cè)不到了，而與RDV感病水稻總蛋白進(jìn)行溫育的MBP-IAA10蛋白直到120min的時(shí)候還有一定量的殘留。表明MBP-IAA10在RDV感病水稻總蛋白提取物中的穩(wěn)定性明顯高于其在健康水稻總蛋白提取物中的穩(wěn)定性或者說MBP-IAA10在RDV感病水稻總蛋白提取物中的降解速度明顯比健康水稻總蛋白提取物中慢。從MBP組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，MBP蛋白在該體系中是穩(wěn)定存在的，它的量不隨時(shí)間的變化而變化，說明MBP-IAA10蛋白的降解性質(zhì)是其中的IAA10蛋白賦予的，因此可以說，MBP-IAA10的降解代表了IAA10的降解。

綜上，RDV能夠減弱P2的降解。

三、MBP-IAA10在煙草總蛋白提取物中的降解實(shí)驗(yàn)

按照2、二、2)中的方法，通過農(nóng)桿菌注射法分別在煙草葉片中注射含有pCambai1301vector或pCambaia1301-HAS2的農(nóng)桿菌，表達(dá)相應(yīng)蛋白。將上述葉片分別在液氮中研磨成粉末，加入適量體外降解緩沖液(25mM Tris－HCl，pH7.5，10mM NACl，10mM MgCl2，4mM PMSF，5mM DTT，10mM ATP)懸浮。4℃，12000rpm離心10min，將上清吸出置于新的離心管中。再次離心去掉沉淀。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)至相同濃度。在490μl含有HAP2的和對(duì)照的煙草蛋白提取物中分別加入10μl純化的MBP－IAA10蛋白或10μlMBP蛋白。4℃溫育。在0min，20min，40min，80min，180min分別取樣40μl，加入20μl 3×protein samplebuffer，100℃加熱5min，取10μl進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)預(yù)染Marker條帶位置，將膠分為三部分，分子量最大的部分(95kDa以上)用來Western blot檢測(cè)P2蛋白，中間部分(95kDa～72kDa)用來Weestrn blot檢測(cè)MBP－IAA10，分子量最小的部分(72kDa以下)用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)水稻總蛋白的量。

結(jié)果如圖4所示，溫育180min后，對(duì)照組煙草總蛋白提取物中的MBP-IAA10蛋白已 經(jīng)檢測(cè)不到了，而與表達(dá)P2的煙草總蛋白進(jìn)行溫育的MBP-IAA10蛋白還有60％的殘留。表明MBP-IAA10在含有HAP2的煙草總蛋白提取物中的穩(wěn)定性明顯高于其在不含HAP2的煙草總蛋白提取物中的穩(wěn)定性或者說MBP-IAA10在P2存在的情況下降解速度明顯比沒有P2的情況下降解速度慢。從MBP組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，MBP蛋白在該體系中是穩(wěn)定存在的，它的量不隨時(shí)間的變化而變化，說明MBP-IAA10蛋白的降解性質(zhì)是其中的IAA10蛋白賦予的，因此可以說，MBP-IAA10的降解代表了IAA10的降解。綜上，P2能夠阻滯IAA10的降解。

實(shí)施例4、IAA10過量表達(dá)能夠提高水稻對(duì)RDV的敏感性，IAA10RNAi能提高水稻對(duì)RDV的抗性

一、表達(dá)載體的構(gòu)建

1)pCambia1301-FLAGIAA10構(gòu)建見實(shí)施例2、二、1)

2)pCambia2300-actin-IAA10RNAi構(gòu)建：以pGAD-IAA10為模版，IAA10-5'SpeI(序列為：5’-GTACTAGTATGAGAGGAGGAGTAGCTGG-3’和IAA10-3'BglII(序列為：5’-GCAGATCTTCAGGATCTGCCTCTTGTTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到859bp的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用SpeI和BglII雙酶切，連入到用XbalI和BamHI(和SpeI和BglII為同尾酶)酶切過的中間載體pUCCRNAi(未名凱拓公司贈(zèng)送，公眾可從北京大學(xué)獲得)上，經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒pUCC-IAA10為將IAA10插入pUCCRNAi質(zhì)粒的XbalI和BamHI酶切位點(diǎn)間得到的載體。再將用SpeI和BglII雙酶切的PCR產(chǎn)物連入到用SpeI和BglII雙酶切過pUCC-IAA10質(zhì)粒中，得到pUCC-IAA10RNAi載體。經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒pUCC-IAA10RNAi為將IAA10以反向互補(bǔ)形式插入pUCCRNAi質(zhì)粒的XbalI和BamHI酶切位點(diǎn)和SpeI和BglII酶切位點(diǎn)間得到的載體。

將pUCC-IAA10RNAi載體用PstI單酶切，瓊脂糖凝膠回收得到1939bp酶切產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接入用PstI單酶切得到的10379bp的pCambia2300-Actin1-ocs載體骨架上，得到重組載體pCambia2300-actin-IAA10RNAi。

二、過量表達(dá)轉(zhuǎn)RING1水稻的獲得

1)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

中花11水稻(以下也稱為野生型水稻)種子去殼，先用70％乙醇浸泡10min，再用0.1％升汞浸泡30min；進(jìn)行表面除菌。用大量無菌水洗去種子表面的溶液，用無菌濾紙吸去種子表面的水分。將種子置于成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，用Parafilm膜封閉平皿邊緣，于26℃溫箱內(nèi)避光培養(yǎng)。大約15天后，小心取下長出的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到成熟胚繼代培養(yǎng)基上，同樣條件繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。每?jī)芍苄柽M(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)化時(shí)，需挑選繼代培養(yǎng)5天左右、呈淡黃色的顆粒狀愈傷組織。

2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

將pCambia1301-FLAGIAA10和pCambia2300-actin-IAA10RNAi電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組菌EHA105/pCambia1301-FLAGIAA10和EHA105/pCambia2300-actin-IAA10RNAi。

將EHA105/pCambia1301-FLAGIAA10和EHA105/pCambia2300-actin-IAA10RNAi在含有抗生素(50mg/L Kanamycin，50mg/L Rifampicin)的LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)2天。挑取單菌落接入液體LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.5，加入乙酰丁香酮至終濃度100mM，得到用于轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的農(nóng)桿菌懸液。

3)水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

將繼代愈傷組織放入滅過菌的錐形瓶中，倒入農(nóng)桿菌懸液使之浸沒愈傷組織。室溫放置20min，并不時(shí)輕輕晃動(dòng)使愈傷組織與菌液充分接觸。用無菌的鑷子輕輕取出愈傷組織，放于無菌濾紙上吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上。28℃暗培養(yǎng)3天，得到經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織。

4)抗性愈傷組織的篩選與分化

將經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織用適量無菌水清洗，除去表面殘余的農(nóng)桿菌，放在篩選培養(yǎng)基上，26℃避光培養(yǎng)進(jìn)行篩選，兩周后轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選兩周。挑選經(jīng)過兩輪篩選后狀態(tài)較好的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基平板上，先避光培養(yǎng)3天，然后再轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱中(15hr/day)進(jìn)行光照培養(yǎng)。一個(gè)月后可見分化出的小苗。當(dāng)分化的小苗長至約2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到錐形瓶中的生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右。選擇長勢(shì)較好、根系發(fā)達(dá)的小苗，用自來水洗去根部的培養(yǎng)基后移栽入土壤中，收取種子，得到T₁代轉(zhuǎn)FLAGIAA10和IAA0RNAi水稻種子，播種得到T₁代轉(zhuǎn)FLAGIAA10和IAA0RNAi水稻。

T₁代的水稻種子通過潮霉素或G418初步篩選(pCambia1301載體帶有潮霉素抗性篩選基因，pCambia2300載體帶有G418抗性篩選基因)，發(fā)芽的種子，表明載體轉(zhuǎn)入水稻。將發(fā)芽的種子種入土中，生長2周后，取0.1g葉片，用液氮磨成粉末。

IAA10過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻株系的葉片粉末中加入蛋白提取緩沖液(0.25M Tris-Hcl，pH6.8，8％SDS，8％β-巰基乙醇，20％甘油)200μl,冰上孵育10min，100℃煮沸10min，4℃，12000rpm離心10min后取上清，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜之后用Western檢測(cè)。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用抗體為anti-FLAG-HRP(sigma),用抗體anti-Actin檢測(cè)水稻內(nèi)院Actin蛋白，作為內(nèi)參。如圖5，在41KDa處出現(xiàn)條帶者為陽性，表明基因轉(zhuǎn)入且蛋白表達(dá)，選擇三個(gè)株系#7，#12和#20用于之后的抗病分析實(shí)驗(yàn)(圖中“－”為野生型中花11水稻，用作負(fù)對(duì)照；“+”為pCambia1301-FlagIAA10瞬時(shí)表達(dá)煙草材料所提取蛋白，用作正對(duì)照)。

RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻株系的葉片粉末中加入Trizol(Invitrogen)，按照說明書所述 方法提取RNA。之后，按照下表1，用RQ1Dnase(Promega，貨號(hào)：M610A)對(duì)RNA中的基因組DNA進(jìn)行消化：

表1為消化體系

然后取2ug消化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體方法參見invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase(貨號(hào)：28025-021)。將反轉(zhuǎn)得到的cDNA稀釋10倍，取4μl進(jìn)行Quantitative Real-time PCR反應(yīng)，引物為qIAA10F:5’-GGTTGCTGGATGGGTGAAGG-3’和qIAA10R:5’-CCTGTCCTCGTAGGTGAGCTGG-3’。反應(yīng)總體系為20μl，按照SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(TOYOBO)說明書配制。

以O(shè)sEF1a作為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為R10：5’-CTTCCTCTGCGCTTGAGGTG-3’和F12：5‘-ACATTGCCGTCAAGTTTGCTG-3’(參見Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.)。

部分株系Real-time PCR鑒定結(jié)果如圖6所示。大部分IAA10RNAi(圖中為節(jié)省空間，簡(jiǎn)寫為Ii)，轉(zhuǎn)基因株系中IAA10的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，為陽性苗。選擇IAA10RNAi-1-2(Ii-1-2)、IAA10RNAi-5-1(Ii-5-1)和IAA10RNAi-10(Ii-10-1)三個(gè)株系進(jìn)行后續(xù)的侵染實(shí)驗(yàn)。

三、IAA10過量表達(dá)能夠提高水稻對(duì)RDV的敏感性，IAA10RNAi能提高水稻對(duì)RDV的抗性

1)通過RT-PCR鑒定RDVS2的表達(dá)來鑒定RDV的侵染

用攜帶RDV(參見Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學(xué)獲得。)的葉蟬(病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus))接種T₁代轉(zhuǎn)IAA10過量表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中花11，每種水稻接種20株，白天30度，晚上22度，濕度60％培 養(yǎng)，每株接5頭葉蟬，咬食三天后將葉蟬捉出，咬食過的水稻在陽光溫室中培養(yǎng)(自然光，溫度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值)。

接毒4周后，提取20株T₁代轉(zhuǎn)IAA10過量表達(dá)、20株RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和20株野生型水稻中花11總RNA，之后，按照表1，用RQ1Dnase(Promega，貨號(hào)：M610A)對(duì)RNA中的基因組DNA進(jìn)行消化，然后取2ug消化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和半定量PCR，具體方法參見invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase(貨號(hào)：28025-021)，擴(kuò)增產(chǎn)物為RDV P2部分蛋白的編碼序列S2；其中使用的引物為：RDVS2F1946:CTATACCACGATGAAGGCCT和RDVS2R2446:TAATGGTACCGATGGTTACC。得到500bp大小條帶的為感染RDV陽性，沒有的為感染RDV陰性。

以O(shè)sEF1a作為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為R10：5’-CTTCCTCTGCGCTTGAGGTG-3’和F12：5‘-ACATTGCCGTCAAGTTTGCTG-3’(參見Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins andrice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.)。結(jié)果如圖7所示，可以看出，20株IAA10過量表達(dá)T1代水稻中有15株擴(kuò)增得到500bp的S2；20株IAA10RNAi轉(zhuǎn)基因水稻中有4株擴(kuò)增到500bp的S2；20株野生型水稻中花11中有10株擴(kuò)增得到500bp的S2；IAA10過量表達(dá)能夠提高水稻對(duì)RDV的敏感性，IAA10RNAi能提高水稻對(duì)RDV的抗性。

2)通過表型確定RDV侵染率

接毒4周后，觀察20株T₁代轉(zhuǎn)IAA10過量表達(dá)、20株RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和20株野生型水稻中花11的癥狀(其中感染RDV病毒的為植株矮縮，葉色濃綠，葉片僵硬，在葉片或葉鞘上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)并與葉脈平行排列成虛線狀，無感染RDV病毒的為葉片或葉鞘上不出現(xiàn)白色斑點(diǎn))，統(tǒng)計(jì)有癥狀植株數(shù)目，計(jì)算帶毒率＝(有表型株數(shù)/總株數(shù))*％。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下表2：

表2為轉(zhuǎn)基因水稻在病毒侵染后帶毒率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

可以看出，IAA10過量表達(dá)水稻感病率更高，而IAA10RNAi水稻感病率相對(duì)較低。除此以外，我們對(duì)不同株系感病水稻進(jìn)行了拍照，如圖8所示，為侵染后4周健康，IAA10過量表達(dá)和IAA10RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的感病癥狀圖?？梢钥闯?，IAA10過量表達(dá)的水稻感病癥狀更強(qiáng)，表現(xiàn)為矮化程度更強(qiáng)，葉片上表示病毒積累的斑點(diǎn)數(shù)量更多；而IAA10RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻的感病癥狀則相對(duì)更弱，表現(xiàn)為矮化程度相對(duì)野生型更弱，而病斑數(shù)量更少(圖8，圖中WT代表野生型中花11水稻，IAA10oe代表IAA10過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，IAA10i代表IAA10RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻)。與野生型水稻相比，IAA10過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻更加易感，而IAA10RNAi轉(zhuǎn)基因水稻更加抗病。