本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領域，更具體地講，涉及重組抗腫瘤蛋白TmSm的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物(mPEG-PLGA)納米顆粒的制備以及其作為腫瘤治療藥物的用途。

背景技術(shù)：

癌癥是目前人類死亡率最高的疾病之一，由于癌細胞對放療和化療產(chǎn)生耐藥性，以及容易轉(zhuǎn)移等特性，使得癌癥難以根治。在癌癥的發(fā)生過程中，常伴有某些有利于癌細胞生長的蛋白過量表達。Survivin基因編碼的survivin蛋白，是哺乳動物細胞中凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族最小的成員，在正常細胞中不表達，而在胚胎干細胞和腫瘤細胞中異常表達，并以同源二聚體形式存在。不同于IAP其他家族成員，survivin N端有一桿狀病毒IAP重復序列(BIR)，由3股反平行β片層和4個α螺旋組成，C末端包含42個氨基酸，形成一個α螺旋。Survivin前體mRNA分子成熟結(jié)構(gòu)包含4個主要功能區(qū)域和3個隱含外顯子，通過不同的選擇性剪接形成6種剪接異構(gòu)體，編碼6種不同的蛋白質(zhì)，分別為Survivin、Survivin2B、Survivin3B、SurvivinΔEx3、Survivin3α和Survivin2α。

Survivin參與多種細胞進程，它的BIR區(qū)域在細胞有絲分裂過程中起重要作用。Survivin是迄今所發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，它可通過抑制癌細胞中不同效應蛋白酶caspase的活性來干擾細胞凋亡。Survivin可結(jié)合X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)，形成復合物以抑制XIAP通過泛素蛋白酶體通路降解，并且能抑制Capase-9的活性。更多研究表明，survivin參與細胞自體吞噬，其下調(diào)會引起細胞凋亡。且survivin可與多種DNA損傷修復相關(guān)因子作用，從而協(xié)助核中DNA修復。Survivin蛋白具有細胞周期依賴性，其在G1期表達最低，S期含量上調(diào)，在G2/M期達最大值，提示Survivin在細胞分裂中發(fā)揮了一定的作用。核定位的Survivin與Aurora B kinase、INCENP和Borealin共同形成CPC(chromosomal passenger complex，染色體通道蛋白復合體)，在有絲分裂中，定位于染色體的著絲粒和中心紡錘體上，促進姐妹染色單體的分離并在分裂后期維持微管的穩(wěn)定性，維持和促進了細胞的增殖。

利用survivin突變體的形式靶向survivin的方式稱為survivin負顯性突變體治療。將survivin的第34位磷酸化位點由蘇氨酸(Thr)突變?yōu)楸彼?Ala)后，即survivin(T34A)，廢除survivin的磷酸化，導致survivin-caspase-9復合物的解離，從而激活caspase活性，導致細胞凋亡。本實驗室利用HIV-TAT可以轉(zhuǎn)導蛋白的特性設計了TATm-Survivin(T34A)融合蛋白即TmSm。目前，TmSm注射劑多采用凍干技術(shù)以提高藥物的穩(wěn)定性，但是TmSm粉針劑用藥劑量較大，需要頻繁用藥。關(guān)鍵因素是生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性差，難以大量富集到達腫瘤部位發(fā)揮作用。因此，要解決這個問題需引入控、緩釋制劑的應用。目前，主要包括脂質(zhì)體、微球、微囊注射劑、皮下埋植給藥劑型、智能型給藥系統(tǒng)和納米技術(shù)?？缮锝到獾暮铣删酆衔锊牧暇廴樗?羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是以聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLA)為原料合成的，PLA的親水性較差，降解慢，PGA的親水性好，降解快，而PLGA可把兩種原料的性質(zhì)加以綜合完善，是目前最好的生物可降解聚合物之一，因其制備的納米顆粒具有良好的性能而備受關(guān)注，如：1)生物降解和生物相容性；2)良好的配方和生產(chǎn)方法，適應不同種類的藥物，如疏水或親水性小分子或大分子藥物；3)在注射給藥的藥物傳輸系統(tǒng)方面得到美國食品及藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)的批準；4)可保護藥物不被降解；5)可持續(xù)緩釋；6)可進行表面修飾定向傳遞等。為了控制藥物釋放，可以使聚合物混合或使用不同的添加劑。例如，結(jié)構(gòu)中包括至少兩種不同族群的二聚體和三聚體，既有疏水性又有親水性，這種結(jié)構(gòu)在控制藥物釋放中醫(yī)已贏得越來越多的關(guān)注。其中PEG-PLGA顯示了很好的特性。聚乙二醇(PEG)的加入，會抑制血清蛋白的吸附，降低細胞識別的程度，改進載藥系統(tǒng)的生物相容性，同時有效減少免疫原性和毒性。

PLGA納米粒的制備方法有：乳化-蒸發(fā)法、鹽析法、納米沉淀法、錯流過濾法、乳化-溶劑揮發(fā)法等。然而當采用某些方法制備納米粒子時，卻遇到一些問題，如使用有毒性的有機溶劑(乳化-蒸發(fā)法)、使用與生物不相容的活性化合物穩(wěn)定劑和鹽(鹽析法)以及較低的產(chǎn)率和包封率(納米沉淀法)，同時，這些方法也很難降低納米粒子的大小，無法制備出粒徑小于100nm的納米粒子。通過高效和可再生的方式將預成型的聚合物用乳化-溶劑揮發(fā)法成功制備出納米顆粒。目前，制備PLGA納米粒最常用的方法是乳化-溶劑揮發(fā)法，該方法主要分兩步進行，即乳液的制備和溶劑的揮發(fā)。常常是根據(jù)包載藥物的性質(zhì)制成W/O、O/W、W/O/W、O/W/O型乳狀液。W/O/W雙乳化溶劑揮發(fā)是目前制備水溶性藥物、多肽、蛋白質(zhì)等常用的方法。將水溶性藥物分散于含PLGA等載體的有機相中，形成W/O型初乳，再分散外水相中形成W/O/W型乳，最后再除去有機溶劑即可。對O/W乳化方法進行改進的雙乳化技術(shù)(W/O/W)，可用來包裹一些親水性藥物，如多肽類、蛋白質(zhì)、核酸。首先，配制含有有機相溶劑的常見O/W乳化液體系，繼續(xù)向體系中加入水使有機溶劑擴散到外相水中，形成納米顆粒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒。

本發(fā)明的第二個目的在于提供包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的在于提供包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒的應用。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：一種包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒，其特征在于，用下述制備方法制備獲得：

(1)將mPEG-PLGA溶于乙酸乙酯中，將TmSm 1-10％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴條件下超聲，形成油包水型乳液；

(2)將獲得的油包水型乳液加入到PVA水溶液中，將上述混合液引入高壓均質(zhì)機進行2-4個周期，即形成水包油包水型復乳液；

(3)在室溫常壓下磁力攪拌，揮發(fā)有機溶劑乙酸乙酯；

(4)將固化的納米粒通過低溫高速離心收集，超純水清洗，洗凈納米粒表面的PVA，將離心的上清液進行收集；

(5)將上述清洗的沉淀用蔗糖重懸，先-20℃冷凍半小時，再置于-80℃過夜冷凍，最后置于冷凍干燥機中冷凍干燥24h，去除納米粒中的水分后，得到納米粒成品，4℃環(huán)境下冷藏。

作為一個優(yōu)選方案，TmSm與mPEG-PLGA的質(zhì)量比為1：62.5。

作為一個優(yōu)選方案，納米粒粒徑為181.0±0.8nm，Zeta電位分別為-26.3±0.4mV，多分散指數(shù)為0.122±0.016。

作為一個優(yōu)選方案，納米粒包封率為53.61±2.08％，載藥量為8.58±0.33μg/mg。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：一種包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將mPEG-PLGA溶于乙酸乙酯中，將TmSm 1-10％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴條件下超聲，形成油包水型乳液；

(2)將獲得的油包水型乳液加入到PVA水溶液中，將上述混合液引入高壓均質(zhì)機進行2-4個周期，即形成水包油包水型復乳液；

(3)在室溫常壓下磁力攪拌，揮發(fā)有機溶劑乙酸乙酯；

(4)將固化的納米粒通過低溫高速離心收集，超純水清洗，洗凈納米粒表面的PVA，將離心的上清液進行收集；

(5)將上述清洗的沉淀用蔗糖重懸，先-20℃冷凍半小時，再置于-80℃過夜冷凍，最后置于冷凍干燥機中冷凍干燥24h，去除納米粒中的水分后，得到納米粒成品，4℃環(huán)境下冷藏。

作為一個優(yōu)選方案，TmSm與mPEG-PLGA的質(zhì)量比為1：62.5。

為實現(xiàn)本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：包載重組抗腫瘤蛋白TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。

作為一個優(yōu)選方案，所述腫瘤是指胰腺癌。

作為一個優(yōu)選方案，當腫瘤是胰腺癌時，有效劑量為3-100mg mg/mLTmSm-PLGA。

本發(fā)明制備獲得的納米粒的包封率為53.61±2.08％，載藥量為8.58±0.33μg/mg。；該納米粒粒徑為181.0±0.8nm，Zeta電位分別為-26.3±0.4mV，多分散指數(shù)為0.122±0.016。

本發(fā)明載體材料為mPEG-PLGA。其中，PLGA是可生物降解的合成聚合物材料，由于其無毒、成球性好、化學穩(wěn)定性高、具有控制釋放能力等特點被廣泛用作納米給藥系統(tǒng)的載體。在美國PLGA通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。mPEG親水基團可以有效避免內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的捕獲，體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間明顯延長，能穩(wěn)定地釋放藥物。

本發(fā)明有機溶劑為乙酸乙酯。作為注射顆粒，利用的乙酸乙酯相對于二氯甲烷，毒性較低。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：兼具TmSm的抗腫瘤功效和mPEG-PLGA的生物降解性優(yōu)良、組織相容性好、降解產(chǎn)物不會在重要器官聚集的特點，促進腫瘤細胞凋亡；同時本發(fā)明可以有效提高藥物療效，減少藥物刺激，降低毒副作用，延長藥物作用時間實現(xiàn)長效緩釋，增加藥物的穩(wěn)定性。因此，作為生物大分子藥物的靶向遞送有著更為廣闊的應用前景。本發(fā)明的mPEG-PLGA納米顆粒制備方法簡單，適宜大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為重組蛋白TmSm純化SDS-PAGE圖。其中，泳道M：Marker；泳道1：誘導前菌液；泳道2：誘導后菌液；泳道3：細胞破碎后上清；泳道4：細胞破碎后沉淀；泳道5：超聲洗滌后包涵體；泳道6：一次洗滌后包涵體；泳道7：二次洗滌后包涵體；泳道8：三次洗滌后包涵體；泳道9：溶解包涵體。

圖2為陽離子交換柱SP Sepharose FF柱復性色譜圖。

圖3為重組蛋白TmSm包涵體柱上復性SDS-PAGE圖。其中，泳道M：Marker；泳道1：SP上柱前(溶解后包涵體)；泳道2：流穿液；泳道3：A沖洗峰；泳道4：SP下柱后。

圖4為RP-HPLC法檢測TmSm蛋白純度色譜圖。

圖5為復乳-溶劑揮發(fā)法結(jié)合高壓均質(zhì)制備TmSm-PLGA-NPs流程圖。

圖6為載TmSm的mPEG-PLGA納米顆粒的SDS-PAGE圖。其中，泳道M：Marker；泳道1：空白PLGA納米粒；泳道2：33.3mg/mL TmSm-PLGA納米粒；泳道3：66.7mg/mL TmSm-PLGA納米粒；泳道4：0.150mg/mL TmSm。

圖7為空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs凍干圖。其中，A：空白PLGA-NPs凍干前；B：空白PLGA-NPs凍干后；C：TmSm-PLGA-NPs凍干前；D：TmSm-PLGA-NPs凍干后，每一組第一個瓶子為超純水，后面四個瓶子為1％蔗糖。

圖8為空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs透射電鏡圖。其中，A：空白PLGA-NPs透射電鏡圖；B：TmSm-PLGA-NPs透射電鏡圖。

圖9為空白PLGA-NPs和TmSm-PLGA-NPs粒徑分布和Zeta電位圖。其中，A：空白PLGA-NPs粒徑分布圖；B：空白PLGA-NPs Zeta電位圖；C：TmSm-PLGA-NPs粒徑分布圖；D：TmSm-PLGA-NPs Zeta電位圖。

圖10為TmSm-PLGA-NPs的載藥量和包封率的測定結(jié)果。

圖11為37℃時PLGA載藥體系中TmSm在不同pH條件下(7.4，6.5，5.0)的釋放情況。

圖12為Blank PLGA和TmSm-PLGA納米粒對SW1990的細胞存活。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.重組蛋白TmSm的表達、純化及指標檢測

試劑與試劑盒：異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl B-D-I-Thiogalactopyranoside，IPTG)、氨芐青霉素購自Sigma-Aldrich公司(美國)，SP Sepharose FF陽離子交換柱購置于GE公司(美國)，蛋白分子量標準品Premixed Protein Marker(Low)，蛋白上樣緩沖液4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，購置于寶生物工程有限公司(大連)。其他的生化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純試劑。

菌株和質(zhì)粒：

E.coli BL21(DE3)(Invirogen，USA)作為質(zhì)粒表達菌株。重組質(zhì)粒pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)為本實驗室所構(gòu)建。

試劑配制：

氨芐青霉素(Amp)母液(50mg/mL)配制：用電子天平準確稱量氨芐青霉素粉劑0.5g，加入10mL超純水定容，充分溶解，將溶液用0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，每1mL分裝1支，-20℃保存，備用。培養(yǎng)大腸桿菌時，每1mLLB培養(yǎng)基中加入1μL氨芐青霉素溶液(1：1000)。終濃度為50μg/mL。

異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)母液(1M)配制：用電子天平準確稱量2.38g IPTG溶解于10mL超純水中，配制成238mg/mL的水溶液，用0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，分裝1mL/支，-20℃保存，備用。誘導時每1mL LB培養(yǎng)基中加入1μL IPTG母液。終濃度為1mmol。

LB培養(yǎng)基的配制：根據(jù)《分子克隆實驗指導》配制每升培養(yǎng)基中加入950mL去離子水，10g蛋白胨，10g NaCl，5g酵母膏，搖動容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，用去離子水定容至1L。隨后121℃高壓滅菌20min。

5×蛋白電泳緩沖液(Tris-甘氨酸)：稱取Tris堿15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加雙蒸水定容至1L。

15％蛋白電泳分離膠：量取ddH₂O 2.3mL，30％丙烯酰胺5.0mL，Tris-HCI(pH 6.8)2.5mL，10％SDS 100μL，10％APS 100μL，TEMED 100μL，混合均勻。

5％蛋白電泳濃縮膠：量取ddH₂O 3.15mL，30％丙烯酰胺0.75mL，Tris-HCI(pH 6.8)0.57mL，10％SDS 45μL，10％APS 45μL，TEMED 4.5μL，混合均勻。

考馬斯亮藍染色液：稱取考馬斯亮藍(R-250)2g，量取乙醇200mL，冰醋酸100mL，去離子水750mL，濾紙過濾，室溫保存。

PBS緩沖液：8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，定容至1L，用NaOH溶液或濃HCl溶液調(diào)pH至7.4，倒入HT瓶中，蓋上蓋子(但不擰緊)，在121℃下滅菌20min，擰緊封口，備用。

0.2M pH6.5磷酸鹽緩沖母液(PB)：根據(jù)《分子克隆第二版》配制，先配制0.2mol/L Na₂HPO₄ 1L，稱取28.392g Na₂HPO₄(Mw＝141.96)，用超純水定容至1L。配制0.2mol/L NaH₂PO₄ 1L，稱取27.598g NaH₂PO₄.H₂O(Mw＝137.99)，用超純水定容至1L。Na₂HPO₄和NaH₂PO₄按31.5mL：68.5mL的比例混合。

20mmol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液(PB)：取100mL 0.2mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖母液(PB)，用超純水定容至900mL，通過pH儀用NaOH溶液或H₃PO₄溶液調(diào)節(jié)pH至6.5(初始為pH 6.47)，倒入HT瓶中，蓋上蓋子(但不擰緊)，在121℃下滅菌20min，擰緊封口，備用。

超聲裂解液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl。量取500mL 20mmol/L PB，稱取1.461g NaCl溶解，通過pH儀用NaOH溶液或H₃PO₄溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

包涵體洗滌液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，2mol/L尿素，pH 6.5。量取500mL 20mmol/L PB，稱取1.461g NaCl，60.06g尿素溶解。通過pH儀用NaOH溶液或H₃PO₄溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

包涵體洗滌液：20mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，0.5％Triton X-100，0.5mol/L尿素，1mol/L氯化鈉，2.5mmol/L EDTA，pH10.0。

包涵體溶解液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，8mol/L尿素，pH 6.5。量取500mL 20mmol/L PB，稱取1.461g NaCl，240.24g尿素溶解。通過pH儀用NaOH溶液或H₃PO₄溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

SP Sepharose FF陽離子交換層析緩沖液：

緩沖液A：20mmol/L pH6.50磷酸鹽，8mol/L尿素，pH6.50。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH6.50的磷酸鹽緩沖液，加入雙蒸水40mL，加入48g的尿素充分溶解后，定容至100mL。而后加入微量的磷酸調(diào)節(jié)pH至6.50，過微濾膜后使用。

緩沖液B：20mmol/L pH6.50磷酸鹽，2mol/L尿素，pH6.50。100mL配制方法：取10mL 0.2mol/L pH6.50的磷酸鹽緩沖液，加入雙蒸水30mL，再加入12g的尿素溶解后定容至100mL，并用少量的濃NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.50，過微濾膜后使用。

緩沖液C：20mmol/L pH6.50磷酸鹽，2mol/L尿素，1mol/L NaCl緩沖液，pH6.50。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH6.50的磷酸鹽緩沖液，加入雙蒸水30mL，而后加入5.844g NaCl溶解后，再加入12g尿素溶解，定容至100mL后用少量的濃NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.50，過膜后使用。

透析液A：20mmol/L PB，2mol/L尿素，1mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

透析液B：20mmol/L PB，1mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

透析液C：20mmol/L PB，0.25mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L精氨酸，pH 6.5。

Bradford法測蛋白濃度相關(guān)溶液：

BSA蛋白標準液(mg/mL)：將10mg BSA溶解于10mL無菌水中，分裝成1mL每管。

Bradford工作液：準確稱取100mg考馬斯亮藍G-250，加入50mL 95％的乙醇，100mL 85％的磷酸，用去離子水定容至1L，棕色瓶避光保存。常溫可放置一個月。

RP-HPLC法測蛋白純度：

緩沖液A：0.08％TFA乙腈：水＝5:95，過微濾膜。

緩沖液B：0.1％TFA乙腈：水＝95:5。

緩沖液C：純乙腈。三種緩沖液進行超聲，除去氣泡。其中TFA為三氟乙酸。

重組蛋白TATm-Survivin(T34A)在大腸桿菌中的表達：從-20℃中取出保藏的菌BL21/pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)，取50μL菌液置于5mL的含10μL50mg/mL Amp(100μg/mL)LB培養(yǎng)基的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rmp，過夜培養(yǎng)；取過夜培養(yǎng)的菌液1mL于100mL含200μL 50mg/mL Amp(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基搖瓶中，37℃，200rmp培養(yǎng)3.5h左右，(取1mL菌液用于SDS-PAGE)至OD600＝0.6左右，加IPTG(75μL)(終濃度為0.75mmol/mL)后轉(zhuǎn)入30℃，200rmp培養(yǎng)4h；4h后，收集菌液(1mL)，用SDS-PAGE電泳鑒定產(chǎn)物表達情況，證明目的蛋白成功表達，結(jié)果如圖1所示。

菌體破碎及包涵體洗滌：將培養(yǎng)液4℃，8000rmp離心10min，獲得濕菌體；濕菌體用10mL細胞破碎液重懸，4℃，8000rmp離心10min；將濕菌體用細胞破碎液重懸，倒入高壓均質(zhì)機中，1000mpa壓力下破碎菌體(破碎3次)；將破碎的菌體4℃，10000rmp離心15min，棄去上清，收集沉淀，得到的沉淀為粗包涵體(在上清液和沉淀中分別取樣，用于SDS-PAGE)；將粗包涵體重懸于10mL包涵體洗滌液中洗滌，冰浴下400rmp攪拌10min。洗滌后于12000rpm，4℃下離心10min，棄去上清，收集沉淀。重復此步3次，收集沉淀為精制包涵體；將精制包涵體溶解于10mL包涵體溶解液中，冰浴下400rmp攪拌4h，于12000rpm，4℃下離心20min，去掉少量不溶物，上清即為溶解的包涵體，于4℃保存。

SP Sepharose FF柱上復性：將5mL SP Sepharose FF預裝柱，以陽離子上柱緩沖液A沖洗5個柱體積，速率3mL/min；將0.22μm膜過濾的TmSm包涵體溶液8mL上柱，用緩沖液A繼續(xù)沖洗直至吸光值回到基線，去除未結(jié)合的雜蛋白，速率3mL/min；以緩沖液A和緩沖液B組成的線性梯度緩沖液(0％-100％B)沖洗15個柱體積，速率2mL/min；用緩沖液B繼續(xù)沖洗SP柱直至吸光值回到基線；而后則更換陽離子柱洗脫液C進行洗脫，速率2mL/min，收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測純度。

將透析袋按照通用流程預處理，將收集的蛋白放入透析袋中。透析袋按照1：10的體積放入透析液A中，透析6h。隨后取出，放入透析液B中，透析6h。隨后取出，放入透析液C中，透析6h。以上都在冰浴或者4℃下進行。將透析的溶液于12000rpm，4℃下離心20min，隨后取上清用3KDa的超濾管4℃，5000rmp離心超濾，倒去濾液重復數(shù)次濃縮蛋白，隨后-20℃保存蛋白。將濃縮的TmSm蛋白利用Bradford法測蛋白濃度。

SDS-PAGE蛋白電泳：

(1)將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干，準備2個干凈的50mL燒杯。

(2)把玻璃板在灌膠支架上固定好。

(3)按比例配好15％分離膠，用移液槍快速加入，大約5cm左右，之后加少許20％乙醇，靜置30min。凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。

(4)倒出20％乙醇并用濾紙把剩余的20％乙醇吸干，按比例配好5％濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳，靜置30min。

(5)拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入1×蛋白緩沖液(用5×蛋白緩沖液稀釋)，沒過鋸齒。

(6)樣品準備：取蛋白樣品30μL與4×上樣緩沖液10μL(最終稀釋成1×上樣緩沖液loading buffer)(當需要進行非還原電泳時用非還原的上樣緩沖液)混合，煮沸10min，離心。

(7)上樣根據(jù)蛋白濃度可選擇5-30μL，蛋白樣品上樣20μL，蛋白marker上樣10μL。

(8)接通電源，恒壓80V跑30min。

(9)接著換電壓到120V，待溴酚藍跑出膠后(40-50min左右)關(guān)閉電源。

(10)凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色30h左右。

(11)脫色：染色后的凝膠板用水漂洗數(shù)次，再加入脫色液或水置于微波爐中高火加熱15min進行快速脫色。

(12)脫色后，將凝膠板用水漂洗數(shù)次，置于生物電泳圖像分析系統(tǒng)中進行蛋白電泳圖像拍攝。

RP-HPLC法檢測TmSm蛋白純度：

色譜柱：C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)

流動相：緩沖液A：0.08％TFA乙腈：水＝5:95。緩沖液B：0.1％TFA乙腈：水＝95:5。緩沖液A：B＝60％：40％

柱溫：25℃

檢測波長：280nm

檢測流速：0.2mL/min

上樣量：20μL

洗脫方式：在室溫條件下，進行梯度洗脫。

純度計算：按面積歸一化法計算，以目標峰的峰面積占總積分面積的百分比作為純度數(shù)據(jù)。

(1)過SP FF陽離子柱收集的洗脫液進行透析，將透析上清超濾脫鹽，再加入PBS緩沖液進行換液，換液后的TmSm蛋白溶液測定蛋白濃度。

(2)將換液后的TmSm蛋白溶液用石英比色皿進行全波長掃描(200-400nm)，記錄最大吸收峰處的吸收波長。

(3)利用C18柱進行純度測定，記錄色譜圖。

實施例2.TmSm-PLGA-NPs的制備及指標檢測

試劑：單甲氧基聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物mPEG5000-PLGA50/5028000購置于濟南岱罡生物工程有限公司，乙酸乙酯購置于上?；瘜W試劑有限公司，PEG8000購置于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，聚乙烯醇PVA購置于上海凌峰化學試劑有限公司，BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購置于生工生物工程有限公司(上海)。其他的生化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純試劑。

試劑配制：

1％PVA溶液：稱取1g PVA，用超純水加熱溶解，定容至100mL。

5％PEG8000水溶液：稱取0.5g PEG8000，用超純水溶解，定容至10mL。

10％蔗糖：稱取1g蔗糖，用超純水溶解，定容至10mL。

PLGA納米顆粒制備：25mg mPEG-PLGA溶于2mL乙酸乙酯中，將200μL 1mg/mL TmSm 5％PEG水溶液加入到PLGA溶液中，冰浴條件下超聲l min(功率為100W，超1s，停1s，60次)，形成油包水(W1/O)型乳液。將獲得的(W1/O)型乳液加入到20mL 1％PVA水溶液中，將上述混合液引入高壓均質(zhì)機(100MPa)進行兩個周期，即形成水包油包水(W1/O/W2)型復乳液。在室溫常壓下800rmp磁力攪拌4h，揮發(fā)有機溶劑乙酸乙酯。然后，將固化的納米粒通過低溫高速離心(4℃，12100r/min，20min)收集，用5mL超純水清洗3次，洗凈納米粒表面的PVA。其中，將離心的上清液進行收集。將上述清洗的沉淀用2mL 1％蔗糖重懸，置于西林瓶中，先-20℃冷凍半小時，再置于-80℃過夜冷凍，最后置于冷凍干燥機中冷凍干燥24h，去除納米粒中的水分后，得到納米粒成品，4℃環(huán)境下冷藏。其中，利用加超純水代替1％蔗糖作為對照，進行冷凍干燥?？瞻譖LGA納米顆粒制備是利用200μL 5％PEG水溶液作為內(nèi)水相，其他條件不變。

納米顆粒的載藥量和包封率的測定：將離心洗滌過程中的上清液收集，并用50mL容量瓶定容到50mL，采用Micro BCA法測定未被包進納米粒中的TmSm含量，并計算納米粒的包封率。由以下公式計算納米顆粒的載藥量和包封率：

BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測定

A試劑準備

(1)按照以下公式計算所需的BCA工作液總體積。

BCA工作液總體積＝(標準曲線測定點數(shù)+樣品數(shù))×重復次數(shù)×每個樣品所需的BCA工作液體積

(2)根據(jù)所需的BCA工作液總體積，定量取溶液A：溶液B：溶液C＝25:24:1，混勻，制成BCA工作液。

(3)取一定量的BSA標準溶液，用1×PBS溶液稀釋為40μg/mL。

(4)取9支1.5mL離心管，按照下表平行操作，配制BSA濃度梯度。

B酶標板法

(1)選取酶標板上22個孔，分為標準組和樣品組。其中16個孔，每個標準品設置1個重復，各孔分別加入100μL相應濃度的標準蛋白質(zhì)溶液(40μg/mL)；剩余4孔，分為2個重復組，重復孔編號相同。其中編號不同的兩孔加入濃度不同的100μL樣品稀釋液。

(2)各酶標孔加入100μL BCA工作液，迅速混勻。

(3)在37℃保溫30min。

(4)冷卻至室溫后，在酶標儀上測各孔的A562值。

(5)以標準組各孔A562平均值為縱坐標，對應的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，在坐標紙上或Microsoft Excel軟件中繪制標準曲線。

(7)根據(jù)兩個相同樣品稀釋液A562值的平均值，在標準曲線上計算出該樣品經(jīng)過稀釋后的蛋白質(zhì)濃度。選擇合適稀釋度的樣品計算最終的樣品蛋白濃度，再由稀釋倍數(shù)計算原樣品蛋白質(zhì)濃度。

納米顆粒的體外釋放實驗：精密稱取載藥納米顆?；蚩瞻准{米顆粒10mg置于離心管中，加入1.5mL PBS緩沖液(pH 7.4)，置于37℃恒溫搖床中，振蕩速度100rpm。分別在第l、2、4、6、8、12、24、48h以及第3、4、5、6天取出離心管，置于冷凍離心機中，14000rpm離心10min，將全部的釋放介質(zhì)小心吸出并更換新的PBS緩沖液釋放介質(zhì)，以空白納米顆粒的釋放上清液作為空白對照，按Micro BCA試劑盒要求進行加樣，反應顯色后于562nm處測得其吸光度，代入藥物釋放標準曲線，計算求得各個時間點釋放的TmSm的藥量(C0)。同時，測定釋放前納米顆粒中TmSm的含量(C₀)。計算累計釋放百分率F_t：F_t＝(ΣC_t/C₀)×100％，以F_t對時間t作圖，獲得藥物釋放曲線。

實施例3.TmSm-PLGA-NPs的體外抗腫瘤活性檢測

試劑與試劑盒：MTT，青鏈霉素混合液，DMSO購置于北京索來寶公司，RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，胰酶購自Gibco公司(美國)。其他的生化試劑屬于國產(chǎn)常規(guī)的分析純試劑。

細胞株和培養(yǎng)基：

人胰腺癌細胞SW1990，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO₂濃度，培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)。

試劑配制：

RPMI1640完全培養(yǎng)基：量取90mL RPMI1640培養(yǎng)液(1×)，加入10mL胎牛血清，1mL青霉素(100IU/L)和1mL鏈霉素(100mg/L)，充分混勻，置于4℃保存。

5mg/mL MTT溶液：稱取250mg MTT溶于50mL PBS中，60℃助溶使其充分溶解，用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，-20℃避光保存。

細胞的傳代：將超凈工作臺用紫外滅菌30min；培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱中預熱。用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞鋪滿瓶底80％-90％時，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，洗去殘留的培養(yǎng)基，然后加入500μL胰酶，消化1-2min，待細胞變圓并從瓶壁上脫落時，加入4ml已預熱的新鮮培養(yǎng)基終止消化，并用無菌的吸管沿著瓶壁吹打細胞，直到形成單細胞懸液，稀釋到合適的細胞密度傳代。

細胞的凍存：超凈臺紫外滅菌30min，培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱中預熱。將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗兩遍；再向培養(yǎng)基中加入500μL胰酶，放入培養(yǎng)箱中消化1-2min，待細胞變圓并有少量細胞漂浮時，加入培養(yǎng)基終止消化；吹打細胞形成單細胞懸液后，將其移入離心管中以1000rpm離心5min，棄去上清，加入1ml細胞凍存液(700μL基礎培養(yǎng)基，200μL胎牛血清，100μL DMSO)，用吸管吹打均勻，移入凍存管中蓋緊蓋子。將凍存管于4℃冰箱中放置0.5h，-20℃放置2h，再放入-80℃過夜，最后放入液氮中長期保持。

細胞的復蘇：從液氮中取出細胞，迅速將其置于37℃水浴中，不停地搖動，使細胞快速溶解；然后將其移入離心管中以1000rpm離心5min；棄去上清，再加入4ml新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻后，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜后，換培養(yǎng)液除去死細胞。

MTT法檢測TmSm蛋白對胰腺癌SW1990細胞增殖的影響：接種胰腺癌SW1990細胞：細胞鋪滿細胞瓶80-90％時，用0.5mL 0.25％胰酶消化后，加入2mL RPMI1640完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清，100IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素，pH7.2)終止消化并吹打細胞，使形成細胞懸液。吸取1mL細胞懸液加入15mL的離心管中，并用6mL含10％胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以2×10⁴個細胞/mL接種到96孔板，每孔加入體積100μL。37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察到孔中細胞長滿至70-80％。小心吸取舊的培養(yǎng)液棄去，每孔加入200μL含10％胎牛血清的培養(yǎng)液，最外一圈加入PBS。其中空白對照孔加入200μL RPMI1640完全培養(yǎng)基；其他孔為不同濃度的空白PLGA和TmSm-PLGA納米顆粒，蛋白濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL和12mg/mL，分別加入200μL，每個濃度共4個平行孔。將加好樣品的96孔板置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察胰腺癌SW1990細胞形態(tài)是否發(fā)生變化。每孔加20μL 5mg/mL MTT溶液。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μL DMSO，在振蕩儀上充分振蕩10min使結(jié)晶溶解。在酶標儀上測定各孔的λ＝490nm處吸光值，計算細胞存活率。細胞存活率＝待測組吸光值/陰性對照組吸光值×100％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。