本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiahorreavirus，pedv)是豬腸道傳染病病原，能夠引起豬嘔吐、腹瀉和脫水，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬中的感染率最高。該病多發(fā)生在冬春寒冷季節(jié)，以12月至次年2月為高發(fā)季節(jié)。2010年冬季至2011年春季全國各地豬場的豬群中先后發(fā)生嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，發(fā)病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時間長，應(yīng)用各種抗生素防治無效，其發(fā)病率達(dá)80％左右，死亡率高達(dá)50％～85％，造成重大的經(jīng)濟損失。此前，對pedv病原的檢測多用常規(guī)的rt-pcr檢測方法，操作繁雜、耗時長、成本較高、不能定量檢測，只能定性判斷，且不能高通量檢測。另一種韓國的膠體金檢測試紙條靈敏度較低、且不能定量、價格較貴，不適合高通量抗原檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒，該試劑盒特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能夠快速、簡便、高效的定量檢測豬流行性腹瀉病毒，成本低、適合高通量檢測。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供分泌抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株pedv，保藏編號為cctccno:c201710。本發(fā)明還提供所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白單克隆抗體及其在制備檢測豬流行性腹瀉病毒試劑盒方面的應(yīng)用。發(fā)明還提供豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒，包括預(yù)包被酶標(biāo)板和酶標(biāo)記抗體，所述預(yù)包被酶標(biāo)板是采用所述抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白單克隆抗體包被的酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)記抗體是辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白多克隆抗體；所述抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白多克隆抗體通過用豬流行性腹瀉病毒n蛋白免疫兔子，獲取兔子血清后純化獲得。在本發(fā)明中，所述豬流行性腹瀉病毒n蛋白是通過誘導(dǎo)表達(dá)攜帶seqidno:1所示n蛋白編碼基因的重組菌獲得的。在本發(fā)明中，抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白單克隆抗體的包被濃度為2μg/ml，酶標(biāo)記抗體的濃度為2μg/ml.在本發(fā)明中，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、樣品稀釋液、顯色劑、終止液和洗滌液。所述標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉為pedv重組n蛋白；所述樣品稀釋液為0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液；所述洗滌液的溶劑是0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液，溶質(zhì)為吐溫-20，吐溫-20在洗滌液中的體積百分濃度為0.2％；終止液：2m的硫酸水溶液；顯色劑包括辣根過氧化物酶催化底物a液和b液；所述辣根過氧化物酶催化底物a液是含有h2o2的溶液；所述辣根過氧化物酶催化底物b液是含有3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺的溶液。本發(fā)明的有益效果:(1)特異性強:本發(fā)明試劑盒與pedv重組n蛋白和臨床病料中的pedv有較強的反應(yīng)性，其他蛋白和其他病原無交叉反應(yīng)。(2)靈敏度高:本發(fā)明試劑盒最低可檢測1ppb含量的pedvn蛋白。(3)定量分析：本發(fā)明試劑盒可以對樣品中n蛋白含量進行定量。(4)重復(fù)性：本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)和批間重復(fù)性較好。(5)快速：本發(fā)明試劑盒操作簡便、快速。因此，本發(fā)明試劑盒為pedv的高通量臨床病原診斷、弱毒活疫苗的質(zhì)量控制以及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)手段，對豬流行性腹瀉病的防控具有重要意義。附圖說明圖1是顯示重組n蛋白純化結(jié)果的sds-page電泳圖，其中泳道m(xù)k為marker，泳道ls是進樣液，泳道ft是流穿液，泳道40/80/200/500分別為咪唑濃度為40、80、200和500mm的洗脫液。圖2本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為重組n蛋白的濃度，縱坐標(biāo)為od值。具體實施方式下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例1、制備重組n蛋白1.序列合成將已經(jīng)公開的pedv的n基因序列按照大腸桿菌的密碼子偏好情況進行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的n基因序列，如seqidno:1所示。n蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。將優(yōu)化后的n基因送基因公司合成，然后將該片段克隆至原核表達(dá)載體pet-28a(+)的bamhi和xhoi酶切位點之間，得到pet-28a-pedv陽性質(zhì)粒。2.重組n蛋白表達(dá)、純化(1)轉(zhuǎn)化：pet-28a-pedv陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌bl21(de3)，涂布于含有卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度100μg/ml)，在37℃培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落于含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度50μg/ml)中培養(yǎng)12-16h，通過測序鑒定，得到陽性重組菌pet-28a-pedv/bl21，保存其甘油菌于-80℃。(2)菌種活化：37℃過夜培養(yǎng)活化pet-28a-pedv/bl21的甘油菌。(3)誘導(dǎo)表達(dá)：按照接種量為0.5％將pet-28a-pedv/bl21轉(zhuǎn)接至300ml含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600＝0.4-0.6，加入終濃度為1mm的iptg，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h。將發(fā)酵液在8000rpm、4℃條件下離心5min，收集誘導(dǎo)表達(dá)后菌體。(4)菌體裂解：在誘導(dǎo)表達(dá)后菌體中加入100ml破碎液(pbs緩沖液)進行超聲波裂解。超聲波裂解條件：冰浴、功率60％、超聲2s、間隔2s，裂解時間為15min。將菌體裂解液在12000rpm、4℃條件下離心15min，分別收集裂解液上清和沉淀，經(jīng)sds-page電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組n蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。(5)包涵體純化：增溶液：溶劑為ph8.0、20mm的tris-hcl緩沖液，溶質(zhì)及其濃度如下：50mmnacl、20mm咪唑、8m尿素、0.2mmdtt和2％(質(zhì)量百分濃度)triton。采用增溶液懸浮誘導(dǎo)表達(dá)后pet-28a-pedv/bl21的裂解液沉淀，在冰浴條件下放置2h，然后10000rpm、4℃離心15min，收集上清。利用組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料純化重組蛋白，收集流穿液、洗脫液，采用sds-page電泳檢測蛋白純化效果。結(jié)果如圖1所示，重組n蛋白約為55kd，主要被含200mm咪唑的流動相洗脫下來，純度85％，蛋白濃度0.5mg/ml。收集含有重組n蛋白的洗脫液，透析去除咪唑，得到純化后的重組n蛋白。300ml培養(yǎng)基發(fā)酵后，最終得到5mg重組n蛋白。實施例2、鼠抗pedvn蛋白單克隆抗體的制備1、免疫原制備：將實施例1制備的重組n蛋白(0.5mg/ml)分別與等體積佐劑混合乳化均勻，成油包水狀態(tài)，制成重組n蛋白疫苗，以備免疫小鼠。第一次免疫所用佐劑為弗氏完全佐劑和youlong佐劑，第二次及之后的免疫作用佐劑為弗氏不完全佐劑和youlong佐劑。2、免疫策略：取4只balb/c小鼠用重組n蛋白疫苗進行皮下免疫，每只小鼠皮下免疫3次，每次每只小鼠免疫0.1mg免疫原，每次免疫間隔4周，三免后一周斷尾取血，分離血清，采用間接elisa方法檢測其抗體效價，具體方法如下：1)用0.1mol/l、ph＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋重組n蛋白(實施例1制備)至1ug/ml，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃反應(yīng)3h或者4℃靜置過夜。2)甩去板孔中液體，加入250ul洗滌液(溶劑是0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液，溶質(zhì)為吐溫-20，吐溫-20在洗滌液中的體積百分濃度為0.2％)，靜置30s，甩去板中液體，重復(fù)3次。3)加入檢測樣本，每孔100ul，同時加入陽性對照(步驟2中所取陽性小鼠血清)、陰性對照(免疫前小鼠血清)和空白對照(不加小鼠血清)37℃反應(yīng)45min，4)重復(fù)步驟2)；5)加入hrp標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，每孔100ul，37℃反應(yīng)45min。6)重復(fù)步驟2)；7)加入顯色劑(將實施例4中辣根過氧化物酶催化底物a液和b液等體積混合后得到)，每孔100ul，室溫避光反應(yīng)15min。8)加入終止液(2m的硫酸水溶液)，每孔100ul，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處讀取od值。結(jié)果如表1。表1各小鼠血清的抗體效價小鼠編號效價fl021-11:243000fl021-2>1:243000fl021-3>1:243000fl021-4>1:2430003、細(xì)胞融合：三免后兩周，取血清抗體效價最高的小鼠對其腹腔注射0.1ml重組n蛋白溶液(0.5mg/ml)進行加強免疫，三天后進行細(xì)胞融合。將該小鼠斷頸處死，用70％乙醇溶液浸泡30min消毒，在超凈臺剪開腹腔，取出脾臟，磨碎，過80目篩網(wǎng)，得到脾細(xì)胞，加入sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，在peg4000的作用下進行細(xì)胞融合。4、融合篩選：將融合好的細(xì)胞鋪進96孔板，用hat培養(yǎng)液(購自sigma)進行培養(yǎng)，三天后換液，改用ht培養(yǎng)液(購自sigma)培養(yǎng)。10天后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清采用間接elisa方法檢測抗體效價(方法同上)，取陽性孔以備進行亞克隆。5、亞克隆與建株：使用有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，10天后檢測，將陽性克隆繼續(xù)采用有限稀釋法進行亞克隆，直到得到的亞克隆都為陽性。最終獲得37株能夠分泌抗pedvn蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，依次編號為1#、2#……37#，各雜交瘤細(xì)胞株與其產(chǎn)生的抗pedvn蛋白單克隆抗體編號相同。6、擴大培養(yǎng)：將各雜交瘤細(xì)胞株分別擴大培養(yǎng)，并進行凍存。7、抗體制備與純化制備、純化上述37株雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗pedvn蛋白單克隆抗體，具體方法如下：a)腹水制備：在小鼠腹腔注射礦物油，一周后將雜交瘤細(xì)胞株以pbs緩沖液稀釋后注射入小鼠腹腔，每只小鼠注射的雜交瘤細(xì)胞數(shù)約為5×105個，10天后收集腹水。b)單克隆抗體純化：將腹水在4000rpm、室溫條件下離心15min，取上清。在4℃、攪拌條件下向腹水上清中逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至體系中硫酸銨飽和度達(dá)到50％，繼續(xù)攪拌30min，然后在13000rpm、4℃條件下離心30min，棄上清，取沉淀溶于pbs緩沖液(0.01m、ph7.4)，在4℃、攪拌條件下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至體系中硫酸銨飽和度為33％，繼續(xù)攪拌30min，在13000rpm、4℃條件下離心30min，棄上清，取沉淀溶于pbs緩沖液(0.01m、ph7.4)，4℃透析過夜，得到單克隆抗體粗蛋白，測定抗體含量，-20℃凍存?zhèn)溆?。將單克隆抗體粗蛋白采用proteing預(yù)裝柱(ge公司)進行純化，新柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml、濃度為0.4m的pb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合位點上；繼續(xù)采用10ml、0.4m的pb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；采用5ml、0.1m甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph2.7)洗脫結(jié)合位點上的抗體，在洗脫液中加入ph8.0、1m的tris-hcl中和甘氨酸，使ph保持為適合抗體保存的中性。8、抗體特性分析分析本實施例標(biāo)題7獲得的37個單克隆抗體的特性。a)效價測定用間接elisa法(同上)檢測各單克隆抗體的效價，以0.5作為截斷值。上述37個單克隆抗體中，有23個單克隆抗體效價>1：1024×103，5個單克隆抗體效價介于1：512×103和1：1024×103之間，4個單克隆抗體效價介于1：64×103和1：128×103之間，5個單克隆抗體效價低于1：64×103。b)亞型測定根據(jù)亞型檢測試劑盒說明書測定抗體亞型，其中30株抗體亞型為igg1，3株為igg2a，3株為igg2b，1株為igm。實施例3、制備酶標(biāo)記多克隆抗體與抗體配對篩選1.制備酶標(biāo)記的抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白的多克隆抗體(1)制備抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白的多克隆抗體將實施例1制備的重組n蛋白按照常規(guī)方法免疫兔子，當(dāng)兔血清抗體效價(實施例2中方法檢測)達(dá)到1：243000以上，采集兔血清。采用如下方法純化多克隆抗體：將兔血清在4000rpm、室溫條件下離心15min，取上清。在4℃、攪拌條件下向上清中逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至體系中硫酸銨飽和度達(dá)到50％，繼續(xù)攪拌30min，然后在13000rpm、4℃條件下離心30min，棄上清，取沉淀溶于pbs緩沖液(0.01m、ph7.4)，在4℃、攪拌條件下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至體系中硫酸銨飽和度為33％，繼續(xù)攪拌30min，在13000rpm、4℃條件下離心30min，棄上清，取沉淀溶于pbs緩沖液(0.01m、ph7.4)，4℃透析過夜，得到兔多克隆抗體粗蛋白，測定抗體含量，-20℃凍存?zhèn)溆谩⑼枚嗫寺】贵w抗體粗蛋白采用proteina預(yù)裝柱(ge公司)進行純化，新柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml、濃度為0.4m的pb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合位點上；繼續(xù)采用10ml、0.4m的pb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；采用5ml、0.1m甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph3.0)洗脫結(jié)合位點上的抗體，收集含有多克隆抗體的洗脫液，在該洗脫液中加入ph8.0、1m的tris-hcl中和甘氨酸，使ph保持為適合抗體保存的中性。(2)酶標(biāo)記多克隆抗體的制備取純化后的抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白的多克隆抗體，與辣根過氧化物酶(hrp)耦連，得到酶標(biāo)記抗體。具體方法如下：(1)取5mghrp溶于純水，加入0.2ml、0.1m的naio4溶液，室溫反應(yīng)30分鐘；(2)將5mg純化后的抗豬流行性腹瀉病毒n蛋白的多克隆抗體用偶聯(lián)緩沖液(ph9.5、10mm的碳酸鹽緩沖液)透析過夜；(3)將步驟(1)所得溶液加入步驟(2)透析后所得抗體溶液中，室溫反應(yīng)2小時；(4)加入硼氫化鈉封閉反應(yīng)位點；(5)磷酸鹽緩沖液透析過夜，得到酶標(biāo)記抗體，加入等量甘油保存于-20℃。2.抗體配對篩選采用實施例2制備的各單克隆抗體分別包被酶標(biāo)板，然后以重組n蛋白(1ppm)或陽性樣本6#(pedv病毒蛋白提取物)作為夾心抗原，以本實施例制備的酶標(biāo)記多克隆抗體作為檢測抗體，進行雙抗夾心elisa檢測，以進行抗體配對篩選。陰性對照中以緩沖液替代夾心抗原。檢測結(jié)果以od450值表示。部分配對篩選結(jié)果如表2。表2抗體配對篩選從表2中的配對篩選數(shù)據(jù)可以看到，其中有7個抗體陽性樣本6#的od450值>2.1*陰性樣本od450值，可判定為可檢出陽性樣本。其中抗pedvn蛋白單克隆抗體16#(縮寫為單克隆抗體16#)對陽性樣本6#的od450值最高，且陰性樣本od450值較低，檢測效果最好，因此，選取單克隆抗體16#作為開發(fā)elisa試劑盒的抗體。單克隆抗體16#是由雜交瘤細(xì)胞株16#制備的，其亞型為igg1，純化后的單克隆抗體16#效價>1:1024×103。雜交瘤細(xì)胞株16#也稱為雜交瘤細(xì)胞株pedv。將雜交瘤細(xì)胞株pedv送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。保藏信息如下：分類命名為：雜交瘤細(xì)胞株pedv，保藏日期為2017年2月15日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱cctcc，保藏單位地址：武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno：c201710。實施例4豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒的組裝選擇雜交瘤細(xì)胞株pedv分泌的抗pedvn蛋白單克隆抗體制備試劑盒，檢測不同的elisa條件：包被抗體濃度、檢測抗體使用濃度、反應(yīng)時間等，最終確定試劑盒中成分及檢測方法。1.試劑盒組成試劑盒：包括預(yù)包被酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、酶標(biāo)記抗體工作液、樣品稀釋液、顯色劑、終止液、洗滌液。(1)試劑的配制包被緩沖液(0.1m、ph值為9.6的cb緩沖液)：3.2克碳酸鈉，5.86克碳酸氫鈉，用純水定容至1l。樣品稀釋液(0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液)：8克氯化鈉，3.35克十二水合磷酸氫二鈉，0.2克氯化鉀，0.2克磷酸二氫鉀，用純水定容至1l。洗滌液：溶劑是0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液，溶質(zhì)為吐溫-20，吐溫-20在洗滌液中的體積百分濃度為0.2％。封閉液：溶劑是0.1m、ph值為9.6的cb緩沖液，溶質(zhì)為bsa(牛血清白蛋白)，bsa在封閉液中的質(zhì)量百分濃度為1％。終止液：2m的硫酸水溶液。顯色劑：包括辣根過氧化物酶催化底物a液和b液。辣根過氧化物酶催化底物a液：體積百分濃度為3％的h2o2水溶液。辣根過氧化物酶催化底物b液：將1ml濃度為10mg/ml的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液加入到100ml濃度為0.1mol/l、ph為6.0的磷酸緩沖液中配成；濃度為0.1mol/l、ph為6.0的磷酸緩沖液的配制方法為：0.1mol/l磷酸二氫鈉水溶液87.7ml和0.1mol/l磷酸氫二鈉水溶液12.3ml混合即成。(2)、預(yù)包被酶標(biāo)板的制備預(yù)包被酶標(biāo)板的制備方法，包括如下步驟：1)包被：采用包被緩沖液將純化后的、由雜交瘤細(xì)胞株pedv分泌的抗pedvn蛋白單克隆抗體(制備方法見實施例2)稀釋至2μg/ml，得到包被工作液。將包被工作液按每孔100μl加入酶標(biāo)板中，4℃靜置12-18h。2)封閉：將酶標(biāo)板以洗板機吸干-洗滌二次，將板條在潔凈的吸水紙上拍干；然后將封閉液按每孔150μl加入酶標(biāo)板中，37℃烘焙3小時。洗滌過程中采用洗滌液。3)抽干密封：棄去烘焙后的酶標(biāo)板中的封閉液，拍干，放入真空冷凍干燥機中抽干3小時，真空熱封。(3)、標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉將實施例1中方法制備得到的重組n蛋白(純化后的)，用樣品稀釋液稀釋到320ng/ml。在3ml棕色玻璃瓶中加入100μl、320ng/ml的重組n蛋白，采用真空冷凍干燥機抽干，得到標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉。(4)、酶標(biāo)記抗體工作液的配制采用實施例3中方法制備酶標(biāo)記多克隆抗體，采用0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液稀釋至2μg/ml，得到酶標(biāo)記抗體工作液，2～8℃避光保存。2.試劑盒的具體使用方法試劑盒的具體使用方法包括如下步驟：(1)從待檢樣本中提取蛋白：取0.1g樣本，加入1ml樣品提取液(0.01mm、ph值為7.4的pbs緩沖液)進行提取，4000rpm離心5分鐘，取上清，得蛋白提取液；(2)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。(3)加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：在預(yù)包被酶標(biāo)板的每孔中加入100μl樣品稀釋液(空白對照)或標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉用樣品稀釋液溶解)或樣本蛋白提取液，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min。(4)洗板：將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破)。(5)加酶標(biāo)記抗體工作液：加入酶標(biāo)記抗體工作液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min，取出重復(fù)洗板步驟(4)。(6)顯色：將辣根過氧化物酶催化底物a液和b液等體積混合，每孔加入100μl，置于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。(7)測定：加入終止液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，在酶標(biāo)儀中檢測450nm波長處每孔的od值，即得到od450值。按照上述方法，將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉稀釋成如下濃度(重組n蛋白濃度)32、16、8、4、2、0μg/kg，制作濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測結(jié)果如表3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。表3標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果(od450值)(8)通過濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢樣品中的pedvn蛋白濃度。實施例5豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒性能評價考察實施例4中制備的試劑盒的性能。(1)特異性試驗采用實施例4中制備的試劑盒檢測常見的豬病病毒，包括豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)、豬輪狀病毒(rv)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)、豬瘟病毒(csfv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)、豬口蹄疫病毒(fmdv)、豬偽狂犬病毒(prv)。根據(jù)檢測od值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中n蛋白的含量。結(jié)果如表4所示，只有pedv采用上述試劑盒檢測后呈陽性，其它病毒均為陰性，表明無交叉反應(yīng)，說明本發(fā)明試劑盒特異性較好。表4特異性試驗結(jié)果病原pedvtgevrvprrsvcsfvpcv2fmdvprvod值1.0860.1130.1110.1120.10.1010.1110.11n蛋白濃度(μg/kg)26.45-0.53-0.64-0.59-1.1-0.94-0.64-0.65(2)靈敏度分析根據(jù)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算出能夠檢測到的n蛋白的最低濃度,即為試劑盒的檢測敏感性。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，1千克樣品中只要含有1μg及以上的n蛋白，均可以被本發(fā)明試劑盒檢出，靈敏性非常高。對病毒含量為105tcid50/ml的豬流行性腹瀉病毒(pedv)液進行10倍倍比稀釋，提取不同稀釋度的病毒液中的蛋白，采用實施例4中試劑盒進行檢測，結(jié)果如表5所示。從表5可見，該試劑盒最低可檢測的病毒含量為102tcid50/ml。表5敏感性試驗(3)重復(fù)性實驗①批內(nèi)重復(fù)實驗使用同批制備的試劑盒在不同時間分別檢測8份隨機選擇的pedv陽性糞便病料中pedvn蛋白的含量，計算平均值x，標(biāo)準(zhǔn)差sd，變異系數(shù)cv。結(jié)果如表6，可見8份糞便病料檢測結(jié)果的變異系數(shù)在0.6％-6.8％之間，說明同批試劑盒在不同時間操作檢測結(jié)果重復(fù)性良好。表6批內(nèi)重復(fù)性實驗檢測結(jié)果：n蛋白含量(μg/kg)②批間重復(fù)實驗采用三批次試劑盒在同一時間檢測8份隨機選擇的pedv陽性糞便病料樣品，檢測得出pedvn蛋白的含量，計算平均值x，標(biāo)準(zhǔn)差sd，變異系數(shù)cv。結(jié)果如表7，可見8份樣品的變異系數(shù)在2.2-8.2％之間，說明不同批次試劑盒檢測結(jié)果重復(fù)性良好。表7批間重復(fù)性實驗結(jié)果：n蛋白含量(μg/kg)sequencelisting<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心elisa定量檢測試劑盒及其應(yīng)用<130>20170424<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>1323<212>dna<213>artificial<220><223>n基因<400>1atggcaagcgttagctttcaggatcgtggtcgtaaacgtgttccgctgagcctgtatgca60ccgctgcgtgttaccaatgataaaccgctgagcaaagttctggcaaataatgcagttccg120accaacaaaggtaataaagatcagcagattggctattggaatgagcagattcgttggcgt180atgcgtcgtggtgaacgtattgaacagccgagcaattggcatttctattatctgggcacc240ggtccgcatgccgatctgcgttatcgtacccgtaccgaaggtgttttttgggttgcaaaa300gaaggtgcaaaaaccgaaccgaccaatctgggtgttcgtaaagcaagcgaaaaaccgatt360attccgaattttagccagcagctgccgagcgttgttgaaattgttgaaccgaatacccct420ccgaccagccgtagcaatagccgtagccgtagtcgtggtaatggtaataatcgtagccgt480tcaccgagcaataatcgtggcaataatcagagccgtggtaatagccagaatcgcggtaat540aaccaggaccgtggtgcaagtcagaatcgtggtggcaacaataacaacaacaataaaagc600cgcaaccagtccaaaaatcgcaatcagagtaatgatcgcggtggtgttaccagccgtgat660gatctggttgcagcagttaaagatgcactgaaaagcctgggtattggtgaaaatccggat720aaactgaaacagcagcagaaaccgaaacaagaacgtagcgatagcagcggtaaaaatacc780ccgaaaaaaaacaaaagccgtgcgaccagcaaagaacgtgatctgaaagatatcccggaa840tggcgtcgtattccgaaaggtgaaaatagcgttgcagcatgttttggtccgcgtggtggc900tttaaaaactttggtgatgcagagtttgtggaaaaaggtgttgatgcaagcggttatgca960cagattgcaagcctggcaccgaatgttgcagcactgctgtttggtggtaatgttgccgtt1020cgtgaactggcagatagctatgaaattacctataactataaaatgaccgtgccgaaaagc1080gatccgaatgtggaactgctggttagccaggttgatgcatttaaaaccggtaatgcaaaa1140ccgcagcgcaaaaaagaaaaaaaaaataaacgtgaaaccacacagcagctgaatgaagag1200gcaatttatgatgatgttggtgttccttcagatgtgacccatgcaaatctggaatgggat1260accgcagttgatggtggtgatacagcggttgaaattatcaacgaaattttcgataccggc1320aat1323<210>2<211>441<212>prt<213>豬流行性腹瀉病毒<400>2metalaservalserpheglnaspargglyarglysargvalproleu151015serleutyralaproleuargvalthrasnasplysproleuserlys202530valleualaasnasnalavalprothrasnlysglyasnlysaspgln354045glnileglytyrtrpasngluglnileargtrpargmetargarggly505560gluargilegluglnproserasntrphisphetyrtyrleuglythr65707580glyprohisalaaspleuargtyrargthrargthrgluglyvalphe859095trpvalalalysgluglyalalysthrgluprothrasnleuglyval100105110arglysalaserglulysproileileproasnpheserglnglnleu115120125proservalvalgluilevalgluproasnthrproprothrserarg130135140serasnserargserargserargglyasnglyasnasnargserarg145150155160serproserasnasnargglyasnasnglnserargglyasnsergln165170175asnargglyasnasnglnglyargglyalaserglnasnargglygly180185190asnasnasnasnasnasnlysserargasnglnserlysasnargasn195200205glnserasnaspargglyglyvalthrserargaspaspleuvalala210215220alavallysaspalaleulysserleuglyileglygluasnproasp225230235240lysleulysglnglnglnlysprolysglngluargseraspserser245250255glylysasnthrprolyslysasnlysserargalathrserlysglu260265270argaspleulysaspileproglutrpargargileprolysglyglu275280285asnservalalaalacyspheglyproargglyglyphelysasnphe290295300glyaspalagluphevalglulysglyvalaspalaserglytyrala305310315320glnilealaserleualaproasnvalalaalaleuleupheglygly325330335asnvalalavalarggluleualaaspsertyrgluilethrtyrasn340345350tyrlysmetthrvalprolysseraspproasnvalgluleuleuval355360365serglnvalaspalaphelysthrglyasnalalysproglnarglys370375380lysglulyslysasnlysarggluthrthrglnglnleuasngluglu385390395400alailetyraspaspvalglyvalproseraspvalthrhisalaasn405410415leuglutrpaspthralavalaspglyglyaspthralavalgluile420425430ileasngluilepheaspthrglyasn435440當(dāng)前第1頁12