技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及具有高殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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綜合治療是惡性腫瘤的重要治療原則,除傳統(tǒng)的化療、放療及手術(shù)等治療方法外,免疫治療的地位日益增強(qiáng)。自20世紀(jì)80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)淋巴因子激活的自體殺傷細(xì)胞(lymphokineactivatedkiller,lak)經(jīng)大劑量il-2體外擴(kuò)增后,可治療惡性腫瘤,由此提出了過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療腫瘤的概念。腫瘤免疫過(guò)繼治療中，nk細(xì)胞是重要的效應(yīng)細(xì)胞，nk細(xì)胞因不需活化即具有細(xì)胞毒作用,且抗瘤譜較廣而被廣泛研究,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)nk細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。然而由于nk細(xì)胞的殺傷活性與il-2的劑量高低、體內(nèi)活化nk的數(shù)量及腫瘤表面mhc-ⅰ類抗原的表達(dá)高低有關(guān),致使nk細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的療效不一，nk細(xì)胞殺傷活性對(duì)于腫瘤細(xì)胞的根除至關(guān)重要。研究表明,nk細(xì)胞表面有抑制性受體及活化性受體,通過(guò)調(diào)節(jié)其受體的表達(dá)可影響nk細(xì)胞的殺傷活性。因此,如何提高nk細(xì)胞的殺傷活性,提高nk細(xì)胞對(duì)表達(dá)mhc-ⅰ類抗原的腫瘤細(xì)胞的識(shí)別,成為解決過(guò)繼免疫治療效果的關(guān)鍵問(wèn)題。

目前尚未有真正簡(jiǎn)單高效的nk細(xì)胞擴(kuò)增方法，這制約著nk細(xì)胞的臨床應(yīng)用。因此，對(duì)nk細(xì)胞的生物學(xué)特性及體外擴(kuò)增的進(jìn)一步研究，必將對(duì)惡性腫瘤的臨床免疫過(guò)繼治療產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。nk細(xì)胞由于無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可直接殺傷靶細(xì)胞,且不具有“mhc限制性”,而腫瘤細(xì)胞往往缺乏mhc-ⅰ類分子的有效表達(dá),故nk細(xì)胞是腫瘤免疫治療中的一個(gè)重要部分。除了nk細(xì)胞獲得性免疫治療,增強(qiáng)nk細(xì)胞活性和探索nk細(xì)胞介導(dǎo)的間接或直接抗腫瘤免疫聯(lián)合治療是未來(lái)nk細(xì)胞腫瘤免疫治療的研究方向。目前,增強(qiáng)nk細(xì)胞活性的策略可以是通過(guò)細(xì)胞因子、多功能抗體介導(dǎo)nk細(xì)胞活性,通過(guò)調(diào)節(jié)抑制性信號(hào)和活化性信號(hào)傳遞促進(jìn)nk活化,或通過(guò)免疫藥物及基因修飾提高nk細(xì)胞功能等。

盡管近年來(lái)nk細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增取得了較大進(jìn)展，已有的擴(kuò)增方案仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化，并通過(guò)大量體內(nèi)、體外的試驗(yàn)對(duì)新的擴(kuò)增方案進(jìn)行評(píng)估。與傳統(tǒng)使用il-2短期培養(yǎng)nk細(xì)胞不同，大規(guī)模長(zhǎng)期擴(kuò)增nk細(xì)胞所需的硬件設(shè)施和軟件管理需要符合現(xiàn)行的藥品生產(chǎn)質(zhì)量規(guī)范(goodmanufacturingpractice，gmp)，培養(yǎng)的細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的細(xì)菌和真菌水平檢驗(yàn)，以控制nk細(xì)胞產(chǎn)品的安全。在nk細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤患者之前，還需要檢測(cè)nk細(xì)胞受體和殺傷功能的變化。目前nk細(xì)胞免疫治療面臨的挑戰(zhàn)還包括：如何增強(qiáng)體外擴(kuò)增的nk細(xì)胞對(duì)腫瘤的識(shí)別和浸潤(rùn)，如何提高nk細(xì)胞在體內(nèi)的存活率。我們?nèi)孕枰M(jìn)一步研究更新的擴(kuò)增方案，提高擴(kuò)增nk細(xì)胞的數(shù)量和功能，為nk細(xì)胞免疫治療清除最終的障礙。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供的具有高殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的具有高殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法為：步驟一：配置培養(yǎng)基，每100mlmem-a培養(yǎng)基加入5ml血漿，加入il-210u/ml，il-15100u/ml，il-2110u/ml，以及scf50ng/ml，包被培養(yǎng)瓶，將纖黏蛋白用pbs或生理鹽水稀釋至0.1mg/ml，吸取5ml加入10cm培養(yǎng)皿中，在4℃包被過(guò)夜后，將殘留液體吸出，待用；

步驟二：取樣：取5ml-10ml靜脈血或者臍血，活率≥90％，用于制備單個(gè)核細(xì)胞，取5ml-10ml淋巴細(xì)胞分離液，小心轉(zhuǎn)移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，離心15min，吸取上層液體即血漿層，用于后期細(xì)胞培養(yǎng)，小心吸取中間白膜層，即單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新離心管中；

步驟三：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用500u/ml雙抗的pbs，400g離心10min，充分漂洗3遍，接種在0.1mg/ml纖黏蛋白鋪底的10cm培養(yǎng)皿中，將分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞按1.0-2.0×10⁶個(gè)/ml的濃度接種于包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置在37℃下，5％的co2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

步驟四：第2-6天，觀察培養(yǎng)基顏色并計(jì)數(shù)，每2-3天補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，含5％自的體血漿，調(diào)整nk細(xì)胞密度為1.0-2.0×10⁶個(gè)/ml；

步驟五：第7天后，可將自體血漿含量降低1％，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)懸液體積選擇擴(kuò)瓶，t75培養(yǎng)瓶最大體積40ml，t175培養(yǎng)瓶最大體積200ml，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd3^-cd56⁺細(xì)胞比例，此類細(xì)胞為nk細(xì)胞；

步驟六：純化nk細(xì)胞，每10⁷細(xì)胞加入90μlpbs.加入10μlcd56microbeads，混勻，4-8℃，15min，此后，加入1-2mlpbs，在1500r/min，4℃離心5min,棄上清，每10⁸細(xì)胞用500μlpbs重懸，將ls/ms柱子安裝到磁鐵上，加入3mlpbs，重力作用自然流盡，將細(xì)胞液加入到柱子中，用3mlpbs洗脫三次，利用ls/ms柱子活塞，推出結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，為純化的cd56⁺nk細(xì)胞；

步驟七：利用無(wú)血清凍存液將純化的cd56⁺nk細(xì)胞凍存于液氮中。

本發(fā)明的有益效果：此種自然殺傷性細(xì)胞高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法取材容易、少量外周血或臍血即可獲取大量具有活性的nk細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，并且取材來(lái)源廣泛，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，適宜自體治療，無(wú)免疫原性。它的培養(yǎng)過(guò)程較為簡(jiǎn)單，操作容易，適合腫瘤疾病的輔助治療。

具體實(shí)施方式：

本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：所述的具有高殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法為：步驟一：配置培養(yǎng)基，每100mlmem-a培養(yǎng)基加入5ml血漿，加入il-210u/ml，il-15100u/ml，il-2110u/ml，以及scf50ng/ml，包被培養(yǎng)瓶，將纖黏蛋白用pbs或生理鹽水稀釋至0.1mg/ml，吸取5ml加入10cm培養(yǎng)皿中，在4℃包被過(guò)夜后，將殘留液體吸出，待用；

步驟二：取樣：取5ml-10ml靜脈血或者臍血，活率≥90％，用于制備單個(gè)核細(xì)胞，取5ml-10ml淋巴細(xì)胞分離液，小心轉(zhuǎn)移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，離心15min，吸取上層液體即血漿層，用于后期細(xì)胞培養(yǎng)，小心吸取中間白膜層，即單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新離心管中；

步驟三：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用500u/ml雙抗的pbs，400g離心10min，充分漂洗3遍，接種在0.1mg/ml纖黏蛋白鋪底的10cm培養(yǎng)皿中，將分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞按1.0-2.0×10⁶個(gè)/ml的濃度接種于包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置在37℃下，5％的co2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

步驟四：第2-6天，觀察培養(yǎng)基顏色并計(jì)數(shù)，每2-3天補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，含5％自的體血漿，調(diào)整nk細(xì)胞密度為1.0-2.0×10⁶個(gè)/ml；

步驟五：第7天后，可將自體血漿含量降低1％，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)懸液體積選擇擴(kuò)瓶，t75培養(yǎng)瓶最大體積40ml，t175培養(yǎng)瓶最大體積200ml，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd3^-cd56⁺細(xì)胞比例，此類細(xì)胞為nk細(xì)胞；

步驟六：純化nk細(xì)胞，每10⁷細(xì)胞加入90μlpbs.加入10μlcd56microbeads，混勻，4-8℃，15min，此后，加入1-2mlpbs，在1500r/min，4℃離心5min,棄上清，每10⁸細(xì)胞用500μlpbs重懸，將ls/ms柱子安裝到磁鐵上，加入3mlpbs，重力作用自然流盡，將細(xì)胞液加入到柱子中，用3mlpbs洗脫三次，利用ls/ms柱子活塞，推出結(jié)合在磁珠上的細(xì)胞，為純化的cd56⁺nk細(xì)胞；

步驟七：利用無(wú)血清凍存液將純化的cd56⁺nk細(xì)胞凍存于液氮中。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。