本發(fā)明涉及免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及卵黃抗體免疫效果的協(xié)同增效技術(shù)，具體涉及一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法。
背景技術(shù)：
：雞心包積液和肝炎綜合征是由禽腺病毒I群中的一些血清型引起雞的一種急性傳染病，但各血清型的致病力不同。該病多發(fā)于3～6周齡的肉雞，也可偶發(fā)于20周齡內(nèi)的后備蛋雞或種雞，無性別差異，在更大齡的肉雞也很少發(fā)生。各種品系肉雞對本病都易感，其他禽類如火雞、鵝、雉雞等也有發(fā)病的報道。臨床上以突發(fā)性死亡率增加，心包積液和肝炎綜合征為主要特征。本病的感染途徑主要是呼吸道、消化道及眼結(jié)膜等，可經(jīng)機(jī)械方式和被帶毒糞便污染的器具而在雞群間、雞場間迅速傳播。國內(nèi)曾經(jīng)在非SPF雞胚傳代的疫苗生產(chǎn)用毒種中檢測到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾經(jīng)推廣使用，可能會引起此病的廣泛傳播。越來越多的研究表明，心包積液和肝炎綜合征的發(fā)生與某些免疫抑制病有關(guān)，常與引起禽類呼吸道疾病的病原微生物混合感染，隨著家禽養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，該病的危害也更加嚴(yán)重，對該病的防控現(xiàn)已成為國際禽病研究的熱點。由于腺病毒的多血清型，該病至今沒有有效疫苗可供使用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中針對腺病毒的人工免疫方法效果不佳的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)注射卵黃抗體免疫腺病毒的方法效果不佳。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進(jìn)行免疫注射。作為優(yōu)選，所述腺病毒液中的抗原成為為腺病毒I群血清4型。作為優(yōu)選，步驟3)所述腺病毒液中病毒效價為108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。作為優(yōu)選，步驟3)所述腺病毒卵黃抗體中抗體效價為1:4、1:8或1:16。作為優(yōu)選，步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體的混合體積比是1:1。作為優(yōu)選，步驟3)中所述注射的劑量是0.5mL。作為優(yōu)選，步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后先加入油佐劑乳化，油水混合制劑型，而后再對雞進(jìn)行免疫注射。作為優(yōu)選，步驟1)所述腺病毒液是通過以下方法制備的：取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)到80％時，收獲，反復(fù)凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。作為優(yōu)選，步驟2)所述腺病毒卵黃抗體是通過以下方法制備的：A)制備腺病毒滅活疫苗；B)取120日齡蛋雞，每只胸部肌肉注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml；C)取步驟B)三免后的雞卵，制備卵黃抗體。作為優(yōu)選，步驟C)所述制備卵黃抗體，具體包括以下操作：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘；加入6倍量酸化水，重復(fù)3組；將各組降溫至1～4℃；4℃靜置2～5小時，14000轉(zhuǎn)離心取上清；加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時；卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌；經(jīng)截留分子量為100KD超濾膜堆進(jìn)行濃縮；加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。作為優(yōu)選，所述雞是SPF雞。本發(fā)明提供了一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法，該技術(shù)方案在卵黃抗體免疫方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在卵黃抗體中加入腺病毒免疫原，利用所得到的抗原抗體復(fù)合物執(zhí)行免疫注射。實驗驗證發(fā)現(xiàn)，在控制特定的混合比例的基礎(chǔ)上不僅不會產(chǎn)生感染問題，而且能顯著提升免疫效果。本發(fā)明創(chuàng)新性的在SPF雞上使用腺病毒免疫原加入卵黃抗體復(fù)合物，各組雞均未見異常，全部健活，進(jìn)行腺病毒抗體的監(jiān)測，免疫原加入卵黃抗體復(fù)合物和滅活疫苗都能迅速的產(chǎn)生抗體。在優(yōu)選技術(shù)方案中，優(yōu)選用SPF雞；優(yōu)選用腺病毒滅活疫苗免疫，制備卵黃抗體；優(yōu)選的，用腺病毒免疫原加入卵黃抗體的復(fù)合物免疫。此外，本發(fā)明方法可以用于雞心包積液和肝炎綜合征的免疫和預(yù)防。本發(fā)明巧妙的利用腺病毒加入卵黃抗體復(fù)合物的免疫方法，能夠在現(xiàn)疫地有效的預(yù)防安卡拉病。本發(fā)明效果突出，同時成本較低、易于實現(xiàn)，因此具有突出的推廣前景。附圖說明圖1是本發(fā)明具體實施方式中不同實驗組免疫后血清中抗體水平變化圖。具體實施方式以下將對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。實施例11、免疫原的制備取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)到80％時，收獲，反復(fù)凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。2、卵黃抗體的制備2.1疫苗的制備將免疫原加入甲醛滅活后，制備成水相。將白油10號高壓滅菌后，水相與油相乳化比例為1:1(V/V)，先將油相導(dǎo)入膠體磨，2500r/min攪拌，緩慢加入水相，加完后10000r/min乳化15分鐘。充分振蕩混勻，制成疫苗。2.2免疫首免：120日齡蛋雞100只，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；二免：首免10日后進(jìn)行二免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；三免：二免后10日后進(jìn)行三免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；2.3卵黃抗體的制備卵黃抗體制備方法：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘。加入6倍量酸化水，重復(fù)3組。將各組降溫至1～4℃。4℃靜置2～5小時，14000轉(zhuǎn)離心取上清。加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時。卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌。經(jīng)截留分子量為100KD超濾膜堆進(jìn)行濃縮。加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。卵黃抗體效價達(dá)到1:8以上，為合格。3、腺病毒免疫原加入卵黃抗體復(fù)合物的制備3.1配制不同濃度的免疫原將免疫原的108.0TCID50配制成108.5、108.0、107.5TCID50三種濃度。3.2配制不同腺病毒的抗體效價將腺病毒卵黃抗體的效價配制成1:4、1:8、1:16三種濃度。3.3配制不同體積混合的腺病毒加入卵黃抗體復(fù)合物將三種不同濃度的免疫原和三種不同濃度的卵黃抗體按照1:1的比例混合，制成抗原抗體復(fù)合物(三組)如表1，加入油佐劑中進(jìn)行乳化，即可得到抗原抗體復(fù)合物的油水混合制劑型。表1抗原抗體復(fù)合物混合比例表項目復(fù)合物一復(fù)合物二復(fù)合物三免疫原108.5TCID50108.0TCID50107.5TCID50卵黃抗體1:41:81:164、對雞進(jìn)行免疫取10日齡SPF雞50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為復(fù)合物一組、復(fù)合物二組、復(fù)合物三組、疫苗組和空白對照組。分別肌肉注射1.0ml/只，空白對照組不免疫。免疫后，每周進(jìn)行采血，檢測抗體，直至7周。如表2所示。血清中的抗體水平見圖1。表2不同實驗組免疫方法及注射劑量由曲線圖可知，注射抗原抗體復(fù)合物的雞只，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時間都要短于疫苗組，復(fù)合物二組是各組中血清抗體效價上升最快的，能夠產(chǎn)生抗體的水平也是各組中最高的；復(fù)合物一組和復(fù)合物三組與疫苗組在抗體水平達(dá)到穩(wěn)定時，抗體水平?jīng)]有明顯差異。5、攻毒保護(hù)取10日齡SPF雞50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為復(fù)合物一組、復(fù)合物二組、復(fù)合物三組、疫苗組和空白對照組。分別肌肉注射1.0ml/只，空白對照組不免疫。免疫后第7天，分別進(jìn)行腺病毒I群血清4型攻毒，觀察10天。見表3。表3不同實驗組免疫效果評價表組別免疫劑量攻毒發(fā)病只數(shù)死亡只數(shù)復(fù)合物一組復(fù)合物一0.5mlI群4型42復(fù)合物二組復(fù)合物二0.5mlI群4型10復(fù)合物三組復(fù)合物三0.5mlI群4型32疫苗組疫苗組0.5mlI群4型75空白對照組//I群4型1010各組免疫7天后，分別進(jìn)行腺病毒I群血清4型攻毒，觀察10天。統(tǒng)計各組中雞只發(fā)病率、死亡率及保護(hù)率。結(jié)果表明：空白對照組雞只死亡率為100％，復(fù)合物二組死亡率最低，保護(hù)率可達(dá)到100％。復(fù)合物一組和復(fù)合物三組的保護(hù)率都高于疫苗組。實施例2一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進(jìn)行免疫注射。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：所述腺病毒液中的抗原成為為腺病毒I群血清4型。步驟3)所述腺病毒液中病毒效價為108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。步驟3)所述腺病毒卵黃抗體中抗體效價為1:4、1:8或1:16。步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體的混合體積比是1:1。步驟3)中所述注射的劑量是0.5mL。步驟3)中腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后先加入油佐劑乳化，油水混合制劑型，而后再對雞進(jìn)行免疫注射。步驟1)所述腺病毒液是通過以下方法制備的：取分離鑒定株腺病毒I群血清4型，用滅菌生理鹽水10倍稀釋病毒液，接種已長滿單層的雞胚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)到80％時，收獲，反復(fù)凍融三次，測得的病毒含量為108.0TCID50，將檢驗合格的凍融液濃縮4倍后，為免疫原。步驟2)所述腺病毒卵黃抗體是通過以下方法制備的：A)制備腺病毒滅活疫苗；B)取120日齡蛋雞，每只胸部肌肉注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步驟A)所述疫苗2ml；C)取步驟B)三免后的雞卵，制備卵黃抗體。步驟C)所述制備卵黃抗體，具體包括以下操作：將分離的蛋黃攪拌成均勻膏狀，加入等體積注射用水，攪拌均勻后，65℃加熱滅活30分鐘；加入6倍量酸化水，重復(fù)3組；將各組降溫至1～4℃；4℃靜置2～5小時，14000轉(zhuǎn)離心取上清；加入正辛酸終濃度為0.3％，室溫放置5～12小時；卵黃液用孔徑為0.45μm濾器過濾澄清，再用0.22μm濾器過濾除菌；經(jīng)截留分子量為100KD超濾膜堆進(jìn)行濃縮；加入終濃度為0.2％甲醛溶液，室溫放置24小時，期間振搖4～6次。實施例3一種針對腺病毒的多途徑協(xié)同免疫方法，包括以下步驟：1)制備腺病毒液；2)制備腺病毒卵黃抗體；3)將所述腺病毒液與腺病毒卵黃抗體混合后對雞進(jìn)行免疫注射。以上對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3