本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒變異株滅活疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）系冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，可引起以嘔吐、腹瀉和脫水為特征的豬腸道傳染性疾病。各種年齡的豬均易感，但哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，死亡率可高達(dá)100%。近幾年我國多省爆發(fā)PED，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無特效藥物治療豬流行性腹瀉，該病的防控以疫苗預(yù)防接種為主。國外使用的疫苗主要為韓國弱毒株，國內(nèi)主要是哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活苗等，此疫苗中使用的毒株為豬流行性腹瀉病毒PEDV CV777株，該毒株分離年代較早，與新變異株相比缺乏廣泛的免疫原性，因此篩選新毒株，制備行豬流行腹瀉疫苗用于預(yù)防豬流行性腹瀉是十分必要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種豬流行性腹瀉病毒變異株滅活疫苗的制備方法以及該滅活疫苗免疫懷孕母豬后的保護(hù)效果，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有疫苗的不足。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)手段：
本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉病毒變異株滅活疫苗，是由腹瀉病毒變異株P(guān)EDV/CH/BJ/2014株滅活后制備取得。
所述滅活疫苗中病毒含量≥107TCID50/mL。
本發(fā)明還提供了一種豬流行性腹瀉病毒變異株滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：腹瀉病毒經(jīng)接種Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞），于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)收獲病毒液、濃縮，經(jīng)0.2%的β-丙內(nèi)酯于4℃滅活24至48小時(shí)后得到疫苗原液，加入ISA201VG水包油包水雙相佐劑乳化即得該病毒疫苗。
本發(fā)明的豬流行性腹瀉病毒PEDV/CH/BJ/2014株，于2014年12月4日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10111。
本發(fā)明的PEDV/CH/BJ/2014株用于制備預(yù)防豬流行性腹瀉的疫苗。與現(xiàn)有的病毒比較，本發(fā)明所篩選的豬流行性腹瀉病毒PEDV/CH/BJ/2014株制備的疫苗免疫原性好，抗體產(chǎn)生快，產(chǎn)生的抗體滴度高且維持時(shí)間長(zhǎng)；免疫劑量小，在產(chǎn)前30天前進(jìn)行免疫注射可使懷孕母豬所產(chǎn)仔豬獲得較好的被動(dòng)免疫，能夠有效抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，提高仔豬的存活率。
附圖說明
圖1：PEDV滅活疫苗免疫斷奶仔豬中和抗體測(cè)定結(jié)果柱形圖，其中黑色柱形為實(shí)驗(yàn)組，灰色柱形為對(duì)照組。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更好地理解本發(fā)明并予以實(shí)施，但實(shí)施例并不作為本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1：豬流行性腹瀉病毒PEDV/CH/BJ/2014株的篩選
1 豬流行性腹瀉病毒PEDV/CH/BJ/2014株的分離和鑒定
在流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，從北京某豬場(chǎng)送檢的腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物中分離到1株豬流行性腹瀉病毒（命名為PEDV/CH/BJ/2014株），豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)陽性，盲傳2代細(xì)胞病變，第3代出現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定的細(xì)胞病變，第5代時(shí)病毒含量可達(dá)到5×105TCID50/mL，能夠被抗豬流行性腹瀉病毒特異性血清中和，將豬流行性腹瀉病毒PEDV/CH/BJ/2014株，于2014年12月4日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10111。
2 用分離得到的PEDV/CH/BJ/2014株制備疫苗
2.1 病毒液的制備
按照常規(guī)方法制備Vero細(xì)胞（Vero細(xì)胞購自美國ATCC），生長(zhǎng)液為含10%新生牛血清的DMEM，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)接種PEDV/CH/BJ/2014病毒；取PEDV/CH/BJ/2014毒株（5×105TCID50/mL）按1%接種長(zhǎng)勢(shì)良好的Vero單層細(xì)胞，置37℃吸附1小時(shí)，棄去吸附液，補(bǔ)加含有10 μg/mL胰蛋白酶的 DMEM作為維持液繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后，每日觀察2次，記錄細(xì)胞病變情況，細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，反復(fù)凍融三次，4℃ 8000 rpm離心20分鐘去除細(xì)胞碎片，收集上清；測(cè)定收集的病毒液毒價(jià)為2×107TCID50/mL，同時(shí)按照《中國獸藥典》對(duì)收集的病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，結(jié)果為陰性。病毒液經(jīng)超濾濃縮管20倍濃縮后，加入0.2%的β-丙內(nèi)酯于4℃滅活24至48小時(shí)得到疫苗原液，滅活期間需間隔2小時(shí)搖勻一次；
病毒滅活檢測(cè)：吸取滅活后的病毒液接種健康Vero細(xì)胞，0.5 mL/T25瓶，共接2瓶，同時(shí)設(shè)立1瓶陰性細(xì)胞對(duì)照；37℃ 5% CO2培養(yǎng)3日后將培養(yǎng)物收獲，經(jīng)-80℃凍融3次后，4℃ 8000 rpm離心5分鐘取上清進(jìn)行接種健康Vero細(xì)胞，如此傳代3次若無病變產(chǎn)生說明滅活徹底，否則不合格。
乳化：分別稱取等質(zhì)量的抗原與ISA201VG雙相佐劑，將水相抗原和佐劑均放置到水浴鍋中預(yù)熱至36℃。調(diào)整磁力攪拌器溫度至32℃，將佐劑加入到無菌玻璃燒杯中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為350 rpm。在磁力攪拌器熱托盤上32℃將水相抗原加入到攪拌的佐劑中，攪拌5分鐘。將乳化液轉(zhuǎn)移至20℃冷浴鍋中冷卻1小時(shí)，期間避免移動(dòng)或攪拌。
3 疫苗檢驗(yàn)方法及結(jié)果
3.1 性狀檢驗(yàn) 3批滅活疫苗外觀呈淡黃色或乳白色乳膠狀，久置后無分層。
3.2 無菌檢驗(yàn) 3批滅活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無菌生長(zhǎng)。結(jié)果見表1。
3.3 支原體檢驗(yàn) 3批滅活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無支原體生長(zhǎng)。結(jié)果見表1。
3.4 外源病毒檢驗(yàn) 3批滅活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等污染。結(jié)果見表1。
3.5 安全檢驗(yàn) 取豬流行性腹瀉中和抗體、抗原均為陰性的3日齡豬15頭，隨機(jī)分成3組，每組5頭，肌注10頭份疫苗，臨床觀察14日，均5/5健活，未見不良反應(yīng)發(fā)生。
表1 3批滅活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例2 豬流行性腹瀉滅活苗的安全試驗(yàn)
1 實(shí)驗(yàn)方法
對(duì)妊娠母豬的超劑量試驗(yàn) 取產(chǎn)前4-6周豬流行性腹瀉中和抗體、抗原均為陰性的妊娠母豬12頭，隨機(jī)分成3組，第1、2、3組分別肌肉注射201601、201602、201603批豬流行性腹瀉滅活苗各2頭份/頭，第4組不進(jìn)行注射作對(duì)照組，觀察至母豬產(chǎn)仔。
2 結(jié)果
超劑量試驗(yàn)結(jié)果 3批疫苗免疫組9頭妊娠母豬與對(duì)照組比較，采食、飲水、妊娠產(chǎn)仔均未見異常，注射部位均未見不良反應(yīng)。
實(shí)施例3 豬流行性腹瀉滅活疫苗的效力試驗(yàn)
1 實(shí)驗(yàn)方法
取產(chǎn)前5周豬流行性腹瀉中和抗體、抗原均為陰性的相同預(yù)產(chǎn)期妊娠母豬15頭，隨機(jī)分成5組，每組3頭。第1組肌肉注射201601批豬流行性腹瀉病毒滅活苗1頭份/頭；第2組肌肉注射201602批豬流行性腹瀉病毒滅活苗1頭份/頭；第3組肌肉注射201603批豬流行性腹瀉病毒滅活苗1頭份/頭；第4組肌肉注射商品化豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗1頭份/頭；第5組肌肉無菌細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 4 mL/頭作為對(duì)照組。
母豬產(chǎn)仔后，每組3日齡仔豬各取15頭，均口服豬流行性腹瀉強(qiáng)毒PEDV/CH/BJ/2014株 0.5MID/mL(最小感染劑量)2 mL，觀察攻毒后仔豬的臨床表現(xiàn)，記錄7日內(nèi)發(fā)病情況。
2 結(jié)果
結(jié)果見表2，本發(fā)明制備的PEDV變異株滅活疫苗免疫懷孕母豬能有效保護(hù)仔豬不受強(qiáng)毒株的感染，保護(hù)率可達(dá)86.7%~93.3%，顯著高于商品化滅活疫苗的保護(hù)率（60%）。
表2 免疫母豬所產(chǎn)的仔豬攻毒保護(hù)率
實(shí)施例4 豬流行性腹瀉滅活疫苗的免疫消長(zhǎng)規(guī)律試驗(yàn)
1 實(shí)驗(yàn)方法
選取10頭PEDV抗原抗體陰性斷奶仔豬，隨機(jī)分成2組，第1組免疫201601批滅活疫苗；第2組免疫DMEM作為對(duì)照。于免疫后7日、14日、21日、35日、49日、84日、112日采集實(shí)驗(yàn)豬血清，檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。
2結(jié)果
免疫組5頭斷奶仔豬在免疫后2周均能產(chǎn)生一定水平的中和抗體，隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)抗體水平持續(xù)上升，免疫后35日抗體水平可以達(dá)到峰值，持續(xù)期較長(zhǎng)，在免疫后84日抗體水平已經(jīng)下降，到112日時(shí)抗體平均水平仍高于1:32；而對(duì)照組仔豬抗體水平始終≤4，結(jié)果見附圖1。