本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
雞新城疫(ND)俗稱雞瘟，是由雞新城疫病毒引起的雞的一種高度接觸性、急性、烈性傳染病，具有很高的發(fā)病率和病死率，世界各地多有發(fā)生，且一旦爆發(fā)將給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊。
H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發(fā)病率高，但死亡率低。主要表現(xiàn)僅為輕度呼吸道癥狀，采食量減少，產(chǎn)蛋率可從90％降至20％以下，甚至絕產(chǎn)，對商品肉雞可導致30％左右死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。更重要的是，H9N2亞型AIV可以穿越宿主障礙感染哺乳動物包括人，也有機會在人類大流行，給人類健康帶來了嚴重的威脅。
禽I群腺病毒是家禽常見的感染病原體，呈世界性分布，目前發(fā)現(xiàn)所有年齡的家禽均易感，只是鑒于家禽的品種、年齡所形成的致病力不同。目前發(fā)現(xiàn)禽I群腺病毒對雞具有強致病性，主要病變表現(xiàn)為包涵體肝炎及心包積液-肝炎綜合征，該病可直接引發(fā)養(yǎng)雞場20～40天齡雞只出現(xiàn)30％以上的死亡率，此外其臨床上也常常與傳染性支氣管炎病毒，呼腸孤病毒，H9亞型禽流感病毒等并發(fā)感染，導致種蛋雞出現(xiàn)明顯呼吸道病，關(guān)節(jié)炎，及嚴重的產(chǎn)蛋下降及畸形蛋等問題。因此目前該病已經(jīng)成為嚴重影響?zhàn)B雞場生產(chǎn)性能的重大疫病之一。其中，禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究熱點，其具備高致病性，可直接引發(fā)的心包積液-肝炎綜合征(或安卡拉病)，該病于1987年首發(fā)于巴基斯坦，在不到一年的時間內(nèi)殃及整個巴基斯坦肉雞養(yǎng)殖企業(yè)，之后在科威特、伊朗、前蘇聯(lián)，日本，中南美洲及墨西哥等地具有發(fā)生，甚至該病在鴿子也曾大面積爆發(fā)。
目前針對雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯(lián)疫苗不斷推出，可避免需要多次應(yīng)用相應(yīng)的單項滅活疫苗引起的手續(xù)繁瑣、使用不便、防疫成本較高等問題。如公開號為CN 105664150 A的中國專利申請“一種雞新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三聯(lián)滅活疫苗”中所述三聯(lián)疫苗的制備方法為分別將雞新城疫、禽流感病毒接種雞胚收獲抗原，將禽腺病毒接種雞肝細胞收獲抗原，然后將各自抗原混合，再進行抗原的濃縮滅活、成品乳化。但所述的禽腺病毒以原代雞肝細胞進行培養(yǎng)，制備繁瑣、易污染、難以到達高效轉(zhuǎn)染，不利于實驗操作。因此，有必要提供一種優(yōu)化病毒培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高抗原效價，提高成品疫苗免疫效果的雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯(lián)疫苗的制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化病毒培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高抗原效價，提高成品疫苗免疫效果的雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯(lián)疫苗的制備方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案為如下：
本發(fā)明提供一種雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟：
(1)將禽腺病毒4型病毒接種于LMH細胞，于37℃、5％CO2培養(yǎng)，直至細胞出現(xiàn)明顯病變時終止培養(yǎng)，將病變細胞凍融，離心后收集上清液得到病毒原液，然后進行超濾濃縮即為禽腺病毒4型制苗病毒液；
(2)將雞新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亞型分別接種于雞胚尿囊腔，分別收獲雞新城疫和禽流感H9亞型的雞胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液，然后分別進行超濾濃縮即為雞新城疫制苗病毒液和禽流感H9亞型制苗病毒液；
(3)將上述三種病毒的制苗病毒液進行滅活后，等體積混合，乳化制成乳劑型滅活疫苗。
進一步地，上述步驟(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制備具體為：
①細胞的制備：將LMH細胞用胰酶-EDTA消化液進行消化分散傳代，加入DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2培養(yǎng)至細胞單層后，再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接種；
②禽腺病毒4型的接種和培養(yǎng)：將禽腺病毒4型毒種按終體積1:200接種到步驟①制備的細胞，并在37℃吸附30～60分鐘后吸棄病毒液，加入細胞維持液，于37℃、5％CO2培養(yǎng)58±2小時，直至細胞病變CPE達到80％以上時，收集細胞毒液；
③制苗病毒液的制備：將收集的細胞毒液于-20℃反復凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液用50K中空纖維柱將其進行濃縮后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液；
其中，所述步驟①中胰酶-EDTA消化液為含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
所述的DMEM培養(yǎng)液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)雙抗和0.5～2.5％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸，所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。
所述步驟②中的細胞維持液為包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)雙抗、1～3％(v/v)脂質(zhì)體復合物和1～2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，所述的雙抗為含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素溶液。
進一步地，所述步驟②中的細胞維持液還包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
進一步地，所述的脂質(zhì)體復合物為內(nèi)部包含過氧化氫酶的復合物，所述的脂質(zhì)體復合物的制備包括以下步驟：
(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超聲處理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液；
(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150～200nm，得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。
其中，上述pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中含0.2～0.6％(m/v)過氧化氫酶。
進一步地，上述三種病毒的制苗病毒液在進行滅活前需進行病毒含量測定，其中，禽腺病毒4型病毒含量測定為：取濃縮后的病毒液用DMEM細胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度重復5孔，同時設(shè)立陰性對照細胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，補加細胞維持液0.3mL于37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時，觀察細胞病變，計算TCID50。
雞新城疫病毒和禽流感H9亞型病毒含量測定為：取濃縮后的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結(jié)束后利用Reed-Muench方法計算離心收獲的上清液的EID50。
進一步地，將三種病毒的制苗病毒液按等體積混合后，使0.1ml水相中雞新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亞型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。
進一步地，上述三種病毒的制苗病毒液的滅活采用0.1％福爾馬林滅活，滅活時間為12～24小時。
其中，禽腺病毒4型病毒滅活檢驗為：取滅活檢驗的樣品，用DMEM營養(yǎng)液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設(shè)立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對照，分別接種于48孔LMH細胞單層細胞，每組重復接種5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現(xiàn)細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格。
雞新城疫、禽流感H9亞型滅活檢驗為：將滅活的病毒液接種10～11日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，置于36～37℃繼續(xù)孵育，不必翻胚。每天照胚兩次，棄去24小時之內(nèi)的死亡雞胚，孵育至4天，收獲尿囊液測定其血凝價(HA)，HA＜1:4即為滅活合格。
進一步地，所述的乳化制成乳劑型滅活疫苗包括以下步驟：
(1)油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，然后加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪拌邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌，制成油相；
(2)水相制備：取滅活后的雞新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亞型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；
(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化機進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即得乳劑型滅活疫苗；
(4)分裝：將制備的乳劑型滅活疫苗按照每瓶250mL進行分裝。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
(1)采用本發(fā)明提供的三聯(lián)滅活疫苗免疫動物后抗體產(chǎn)生快，效價高，降低了疫病的發(fā)生及蔓延，對雞新城疫病毒、禽流感病毒H9亞型和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保護作用。且安全性良好，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)，穩(wěn)定有效，成品在2～8℃長時保存不會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，保護期長。
(2)與傳統(tǒng)使用雞胚法或原代雞肝腎細胞培養(yǎng)禽腺病毒4型病毒比較，本發(fā)明采用LMH傳代細胞培養(yǎng)禽腺病毒4型增殖，利用Reed-Muench方法測定其TCID50可以穩(wěn)定達到107.0-107.5/0.1mL，所得的禽腺病毒4型增殖的病毒滴度提高達10倍以上，并且得到的抗原高度澄清，容易進行濃縮處理，適合進行高抗原滴度的優(yōu)質(zhì)滅活疫苗生產(chǎn)。
(3)本發(fā)明通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)液的配方，創(chuàng)造性地添加過氧化氫酶脂質(zhì)體復合物和硫辛酸，使接毒后的LMH細胞在低含量新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中仍能保持良好的生長狀態(tài)，避免細胞過早出現(xiàn)死亡，從而提高制毒疫苗的效價，并在較短的培養(yǎng)時間58±2小時，即可收獲滴度較高的病毒液，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
具體實施方式
以下通過具體實施方式進一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。
實施例1 脂質(zhì)體復合物的制備：
(1)稱取0.2g磷脂酰膽堿、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超聲處理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4含0.5％(m/v)過氧化氫酶的磷酸鹽緩沖溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液；
(3)使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體懸浮液的粒徑至150nm，得到內(nèi)部包含有過氧化氫酶的脂質(zhì)體。
實施例2 禽腺病毒4型制苗病毒液的制備和病毒含量測定
(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制備：
①細胞的制備：將LMH細胞用質(zhì)量體積比為0.025％的胰酶-0.02％EDTA消化分散，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)雙抗和2.0％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2培養(yǎng)至細胞單層后，再用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接種；
②禽腺病毒4型的接種和培養(yǎng)：將禽腺病毒4型毒種按終體積1:200接種到步驟①制備的細胞，并在37℃吸附40分鐘后吸棄病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨酰胺、1.0％(v/v)雙抗、2.5％(v/v)脂質(zhì)體復合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2培養(yǎng)60小時，直至細胞病變CPE達到80％以上時，收集細胞毒液；
③制苗病毒液的制備：將收集細胞毒液于-20℃反復凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液用50K中空纖維柱將其進行濃縮后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。
(2)禽腺病毒4型病毒含量測定：
取濃縮后的病毒液用DMEM細胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度重復5孔，同時設(shè)立陰性對照細胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，補加細胞維持液0.3mL于37℃、5％CO2培養(yǎng)120小時，觀察細胞病變，計算TCID50。
對比例1、2、3禽腺病毒4型制苗病毒液的制備和病毒含量測定
對比例1禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種后，加入的細胞維持液含有過氧化氫酶，而不是過氧化氫酶脂質(zhì)體復合物，即將過氧化氫酶直接加入到細胞維持液中。
對比例2禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種后，加入的細胞維持液不含過氧化氫酶脂質(zhì)體復合物。
對比例3禽腺病毒4型制苗病毒液的制備步驟與實施例2基本相同，區(qū)別在于，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種后，加入的細胞維持液不含硫辛酸。
并觀察按對比例1-3所述的方法制備禽腺病毒4型制苗病毒液，不同時間收獲的病毒液TCID50，并與實施例2的方法制備禽腺病毒4型制苗病毒液比較，見下表1。
表1 不同時間收獲的病毒液TCID50
由對比例1可知，將過氧化氫酶直接加入到細胞維持液中，LMH細胞在較短時間內(nèi)出現(xiàn)病變，培養(yǎng)36h后，CPE比例達到65％，48h后達到95％，收獲病毒液中病毒的含量遠低于實施例2制得病毒液中病毒的含量。由對比例2可知，細胞維持液中不含過氧化氫酶脂質(zhì)體復合物，LMH細胞在最短時間內(nèi)出現(xiàn)病變，培養(yǎng)36h后，CPE比例達到85％，收獲病毒液的病毒的含量最低。由對比例3可知，細胞維持液中不含硫辛酸，LMH細胞出現(xiàn)病變的時間與對比例1相當，培養(yǎng)36h后，CPE比例達到60％，48h后達到85％。以上結(jié)果表明在細胞培養(yǎng)液中加入過氧化氫酶脂質(zhì)體復合物和硫辛酸可顯著改善LMH細胞接毒后的生長狀態(tài)，延緩其出現(xiàn)細胞病變，提高病毒疫苗的效價。
實施例3 雞新城疫制苗病毒液、禽流感H9亞型制苗病毒液的制備和病毒含量測定
(1)雞新城疫制苗病毒液的制備：
將雞新城疫毒種用滅菌PBS稀釋至10-4或10-5，接種10～11日齡雞胚，每胚尿囊腔內(nèi)接種0.2ml，置36～37℃繼續(xù)孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至96小時，全部取出，照胚，棄去死胚，將活胚氣室向上直立，置2～8℃冷卻12～24小時，將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液，吸取雞胚尿囊液置于滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價，凝集價低于1:256者應(yīng)棄去，將收獲的雞胚尿囊液置于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液，然后進行超濾濃縮即為雞新城疫制苗病毒液，亦可將雞胚尿囊液置于在2～8℃保存?zhèn)溆茫４鎽?yīng)不超過72小時。
(2)雞新城疫病毒含量測定：
取濃縮后的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結(jié)束后利用Reed-Muench方法計算離心收獲的上清液的EID50。
(3)禽流感H9亞型制苗病毒液的制備：
將禽流感H9亞型毒種用滅菌PBS稀釋至10-4或10-5，接種10～11日齡雞胚，每胚尿囊腔內(nèi)接種0.2ml，置36～37℃繼續(xù)孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至72小時，全部取出，照胚，棄去死胚，將活胚氣室向上直立，置2～8℃冷卻12～24小時，將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液，吸取雞胚尿囊液置于滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價，凝集價低于1:256者應(yīng)棄去，將收獲的雞胚尿囊液置于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液，然后進行超濾濃縮即為禽流感H9亞型制苗病毒液，亦可將雞胚尿囊液置于在2～8℃保存?zhèn)溆?，但保存?yīng)不超過72小時。
(4)禽流感H9亞型病毒含量測定：
取濃縮后的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結(jié)束后利用Reed-Muench方法計算離心收獲的上清液的EID50。
實施例4 雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒的滅活及滅活檢驗
(1)禽腺病毒4型的滅活：將病毒液導入滅活罐內(nèi)，加入福爾馬林溶液，充分混合，福爾馬林溶液的最終濃度為0.1％，37℃滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37℃開始計時)后取出，置2～8℃保存，應(yīng)不超過1個月。
禽腺病毒4型病毒滅活檢驗：取滅活檢驗的樣品，用DMEM營養(yǎng)液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設(shè)立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對照，分別接種于48孔LMH細胞單層細胞，每組重復接種5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培養(yǎng)96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現(xiàn)細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格。
(2)雞新城疫病毒和禽流感H9亞型病毒滅活參考上述禽腺病毒4型病毒滅活方法。
雞新城疫/禽流感H9亞型滅活檢驗為：將滅活的病毒液接種10～11日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，置于36～37℃繼續(xù)孵育，不必翻胚。每天照胚兩次，棄去24小時之內(nèi)的死亡雞胚，孵育至4天，收獲尿囊液測定其血凝價(HA)，HA＜1:4即為滅活合格。
實施例5 雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒三聯(lián)滅活疫苗的制備
本發(fā)明可用于配制三聯(lián)滅活疫苗的條件為：每0.1mL新城疫病毒含量不低于108.5EID50方可用于制苗；每0.1mL禽流感H9亞型病毒含量不低于107.8EID50方可用于制苗可用于制苗；每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50即可用于制苗，所述三聯(lián)滅活疫苗的制備具體為：
(1)油相制備：取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，然后加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪拌邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌，制成油相；
(2)水相制備：取滅活后的雞新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亞型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入滅菌后的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，制成水相；
(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化機進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即得乳劑型滅活疫苗；
(4)分裝：將制備的乳劑型滅活疫苗按照每瓶250mL進行分裝。
制得的0.1ml水相三聯(lián)滅活疫苗中雞新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亞型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。
實施例6 三聯(lián)滅活疫苗成品檢驗
(1)性狀
①外觀：為乳白色乳劑。
②劑型：油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴散。
③穩(wěn)定性：吸取疫苗10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)≤0.5mL。
④粘度：用出口內(nèi)徑為1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，記錄流出0.4mL所需的時間，應(yīng)不超過8秒。
(2)無菌檢驗：取成品接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管和酪胨瓊脂各兩支，每支0.2mL，一支置37℃培養(yǎng)，一支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5日，應(yīng)純粹，無菌生長。
(3)安全檢驗：用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1mL，觀察14日，結(jié)果試驗雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。
(4)甲醛含量測定：
①對照品溶液的制備：取已標定的甲醛溶液適量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。
②被測樣本的制備：用5.0mL刻度吸管量取被檢品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10mL，分次洗滌吸管，洗液并入50mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續(xù)濾液，即得。
③測定法：精密吸取對照品溶液和被檢品溶液各0.5mL，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10mL，乙酰丙酮試液10mL，置60℃恒溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘后，按紫外-可見分光光度計法，在410nm的波長處測定吸收度，計算即得。甲醛含量符合國家標準，即檢驗合格。
(5)裝量檢查：取供試品3個，使之恢復至室溫，開啟時注意避免損失。參照裝量檢查使用量取參考表，用經(jīng)標化的吸管、注射器或量筒進行裝量檢查。
實施例7 三聯(lián)滅活疫苗效力試驗：
取21日齡SPF雞70只，將四批雞新城疫、禽流感H9亞型和禽腺病毒4型三聯(lián)滅活疫苗分別以0.3mL/只胸肌注射，每批滅活疫苗15只SPF雞，剩余10只作為對照組只注射生理鹽水。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，連同對照組分別采血，測定其雞新城疫和禽流感病毒H9亞型HI抗體效價和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗體效價，結(jié)果見下表2-4。
表2 免疫后不同時間雞新城疫抗體水平
表3 免疫后不同時間禽流感病毒H9亞型抗體水平
表4 免疫后不同時間禽腺病毒4型抗體水平
結(jié)果表明，采用本發(fā)明的LMH細胞載體能培養(yǎng)出高病毒滴度的禽腺病毒4型；從SPF雞的免疫效力試驗可知，采用本發(fā)明生產(chǎn)的雞新城疫、禽流感H9亞型和禽腺病毒4型三聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞不僅能產(chǎn)生高水平的抗雞新城疫和禽流感病毒H9亞型的HI抗體而且還能產(chǎn)生高水平的禽腺病毒4型中和抗體，本發(fā)明提供的三聯(lián)滅活疫苗效力較佳。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當以權(quán)利要求所限定的范圍為準。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。