本發(fā)明涉及生物制品技術領域，進步涉及DNA疫苗研發(fā)技術，具體涉及一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用。

背景技術：

Ⅰ群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感。可以通過水平和垂直兩種途徑傳播。雖然感染雞的12個血清型之間及血清型內(nèi)部的毒力各有不同，但12個血清型均能誘發(fā)包涵體肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)的主要臨床癥狀為產(chǎn)蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細胞中見核內(nèi)包涵體。FAV-4具有明顯的致病年齡段，對雛雞的致病力最強，可通過接觸水平傳播及垂直傳播。1987年在巴基斯坦臨近卡拉奇的安哥拉首先報道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的幾個邦、厄瓜多爾、秘魯、智利、中南美洲、俄羅斯和孟加拉國等國相繼發(fā)現(xiàn)該病。如今，世界各地都有HHS的蹤影，遍及拉丁美洲、中東和亞洲的一些國家。

通過對Ⅰ群禽腺病毒的流行病學調(diào)查，該病在我國雞群中發(fā)病率較高，且呈逐年上升趨勢。發(fā)病的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。特別是2010年以后發(fā)病呈現(xiàn)增加趨勢，在全國范圍內(nèi)均有流行。臨床表現(xiàn)包涵體肝炎(IBH)、心包積水肝炎綜合征(HHS)。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，Ⅰ群禽腺病毒的發(fā)病率給飼養(yǎng)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。關于該病的防治，國外已有預防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今國內(nèi)尚無疫苗可用，導致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。

目前，F(xiàn)AV-4接種雞胚或原代雞腎臟細胞肝細胞來接種制備疫苗。雞胚繁殖病毒毒價低，病毒需要高倍濃縮，成本高昂；而原代肝腎細胞制備繁瑣、易污染、不易轉(zhuǎn)染，且在制備細胞過程中易混入雞胚成纖維細胞(CEF)，不利于實驗操作。所以急需新型的疫苗。DNA疫苗的出現(xiàn)，開拓了FAV疫苗研究的新方法。DNA疫苗能同時誘導體液免疫和細胞免疫，對不同血清亞型毒株具有交叉保護，還具有嵌合免疫、多重免疫及聯(lián)合免疫等優(yōu)點。

Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形態(tài)，毒粒直徑為70-90nm，無囊膜，呈球形，二十面體對稱結(jié)構。病毒粒子具有252個殼粒，240個非頂角殼粒為六鄰體，12個頂角殼粒為五鄰體，每個五鄰體有2條纖維突起。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用，以解決現(xiàn)有技術的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗對Ⅰ群4型禽腺病毒免疫效果不佳的技術問題。

本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中抗原物質(zhì)的免疫原性較低。

本發(fā)明要解決的再一技術問題是現(xiàn)有技術中Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗對疾病的防疫范圍較為局限。

為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

作為優(yōu)選，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是在其天然表達基因基礎上以雞偏嗜密碼子替換其中的雞稀有密碼子所得的產(chǎn)物。

作為優(yōu)選，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。

作為優(yōu)選，所述抗原是通過以下方法制備的：

1)分別以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段為引物，以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-FAV4C；

2)將FAV-4-C基因的核苷酸序列優(yōu)化至SEQ ID No.2所示狀態(tài)，合成該基因到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-optiFAV4C；

3)將重組載體pMD-18T-optiFAV4C與pCAGGS用EcoR I和Sma I雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pCAGGS，然后16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物在宿主細胞中擴增。

作為優(yōu)選，所述將連接產(chǎn)物在宿主細胞中擴增，具體包括以下操作：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種到2ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒后用雙酶切進行鑒定，即得到作為抗原的質(zhì)粒pCAGoptiFAV4C。

作為優(yōu)選，步驟3)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟4)：使用商品名為Endofree的質(zhì)粒大提試劑盒對重組質(zhì)粒pCAGoptiFAV4C進行提取純化。

同時，本發(fā)明提供了一種上述疫苗用于預防雞心包積水肝炎綜合征的應用。

本發(fā)明提供了一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用，該技術方案基于實驗手段研究發(fā)現(xiàn)研究表明纖維突起具有良好的免役原型，據(jù)此以4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端基因作為抗原物質(zhì)，并在其天然序列的基礎上進行了密碼子優(yōu)化，克隆入真核表達載體pCAGGS中，構建了DNA疫苗pCAGoptiFAV4C。本發(fā)明研究的禽腺病毒DNA疫苗采用了基因工程發(fā)酵的方法制備抗原，成本低，抗原純凈，使用安全。

本發(fā)明制備的Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，利用血清學方法和免疫攻毒法評估疫苗的免疫效果，結(jié)果顯示，本發(fā)明中制備的DNA疫苗對禽能夠提供有效的免疫保護，具有很好的商品化開發(fā)前景。與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明的DNA疫苗既擁有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重組疫苗才有的同時誘導體液免疫和細胞免疫應答的特點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明具體實施方式中各組受試雞免疫后雞體內(nèi)在不同時間段的抗體水平圖。其中空白對照組為每羽受試雞肌注0.2ml生理鹽水；DNA疫苗組為每羽受試雞肌注0.2ml DNA疫苗，其中質(zhì)粒含量為30ug。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

實施例1

1.1纖維蛋白C-末端基因克隆與序列分析：

設計合成一對引物：

引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTT 3’；

引物2：5’AAACTCGAGTTATGTAAAGGGAATGG 3’。

FAV-4強毒株分離自發(fā)病肉雞。

以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD-18T載體(TaKaRa公司)上，構建pMD-18T-FAV4C；利用雙脫氧鏈終止法進行序列測定，結(jié)果顯示，從FAV-4基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因如SEQ ID No.1所示。根據(jù)雞偏嗜密碼子將基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的FAV-4-C基因如SEQ ID No.2所示，合成該基因到pMD-18T載體上，構建pMD-18T-optiFAV4C。

1.2DNA疫苗重組工程菌的構建：

將pMD-18T-optiFAV4C與pCAGGS用EcoR I和Sma I雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pCAGGS，然后16℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種到2ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒后用雙酶切進行鑒定，獲得質(zhì)粒pCAGoptiFAV4C。對重組表達質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，并進行測序，確定基因序列及讀碼框的準確性。

1.3 Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗的制備：

使用Endofree質(zhì)粒大提試劑盒對重組表達質(zhì)粒DNA疫苗pCAGoptiFAV4C進行提取純化，按使用說明進行。

1.4疫苗安全檢測

用14日齡SPF雞10只，每只腿部肌肉分點注射疫苗1.0ml(頸后部兩側(cè)皮下各注射0.5ml)，觀察14日，觀察是否由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。結(jié)果顯示，疫苗免疫的所有試驗雞精神、采食及飲水均未見異常，注射部位均無紅腫反應。

1.5疫苗免疫效果檢測

血清學方法將14日齡SPF雞隨機分為2組，第1組10只，注射pCAGoptiFAV4C，30μg/只，腿部肌肉兩點注射，首次免疫后21日采用相同劑量和途徑加強免疫。第2組10只作對照。接種后7日至2個月，每只雞分別采血，分離血清，用瓊擴試驗檢測免疫雞和對照雞的Ⅰ群4型禽腺病毒抗體，記錄血清的抗體水平。疫苗免疫組一免后21日及以后瓊擴抗體均≥8/10陽性，對照組雞全部為陰性，取測得的各組血清抗體平均效價繪制圖1。

免疫攻毒法將14日齡SPF雞隨機分為3組，第1組10只，注射pCAGoptiFAV4C，30μg/只，腿部肌肉兩點注射，首次免疫后21日采用相同劑量和途徑加強免疫。第2組10只作對照。二免后14日，所有免疫雞和對照雞，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒病毒液(約含105.5TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。觀察并詳細記錄免疫雞和對照雞的發(fā)病情況。攻毒保護結(jié)果，疫苗免疫雞攻毒后觀察14日，保護數(shù)均不少于9只；對照雞攻毒7日內(nèi)全部發(fā)病，死亡8只，死亡雞(死亡后剖檢)及發(fā)病雞(攻毒后7日剖檢)剖檢病理變化：均出現(xiàn)典型的心包積水、肝臟腫大病變。

實施例2

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：

所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是在其天然表達基因基礎上以雞偏嗜密碼子替換其中的雞稀有密碼子所得的產(chǎn)物。

實施例3

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：

所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。

所述抗原是通過以下方法制備的：

1)分別以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段為引物，以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-FAV4C；

2)將FAV-4-C基因的核苷酸序列優(yōu)化至SEQ ID No.2所示狀態(tài)，合成該基因到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-optiFAV4C；

3)將重組載體pMD-18T-optiFAV4C與pCAGGS用EcoR I和Sma I雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pCAGGS，然后16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物在宿主細胞中擴增。

所述將連接產(chǎn)物在宿主細胞中擴增，具體包括以下操作：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種到2ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒后用雙酶切進行鑒定，即得到作為抗原的重組質(zhì)粒pCAGoptiFAV4C。

步驟3)完成后繼續(xù)執(zhí)行以下步驟4)：使用商品名為Endofree的質(zhì)粒大提試劑盒對重組質(zhì)粒pCAGoptiFAV4C進行提取純化。

實施例4

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

所述抗原是通過以下方法制備的：

1)分別以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段為引物，以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-FAV4C；

2)將FAV-4-C基因的核苷酸序列優(yōu)化至SEQ ID No.2所示狀態(tài)，合成該基因到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-optiFAV4C；

3)將重組載體pMD-18T-optiFAV4C與pCAGGS用EcoR I和Sma I雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pCAGGS，然后16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物在宿主細胞中擴增。

實施例5

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津瑞普生物技術股份有限公司

<120> 種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用

<160> 4

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 天然序列

<400> 1

ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA 40

CGGATTTTCA GGTGACAGAA AACGGCCTAG CCCTAAAGGT 80

ATCTCCGACG CAGACCCCTC TCACCAGAAT AATTTCTATG 120

GGAAATAACT TGTTTGATTC TGGTTATGAG ATTTTTGCTT 160

CATGTCCGCA GAACAAAGCA GCAAAGGTTG CAGGGTATGT 200

GTATTTAACA TCGGTTGGTG GGCTTGTACA TGGGACCATT 240

CAGATTAAAG CTACTGCGGG GTATTGGTTT ACGGGGGAAA 280

ACAGCGTGCA GGAAAGTATC AGGTTTGGAT TGGTGTTGTG 320

TCCTTTTAGT GCTCGCGACC CCACTGCTAA CCTGTCAGGC 360

TGGCCAGCGC CAGTAGTGTG GAGTGGTGAT AGCAATACTC 400

CCCTATATTT TGCGGCCAAT GCCATTAGTT ATACCAATAA 440

CCGTGTAAAT CATGCAGTTA CCGGTAACTT TTACAAGGAG 480

GAAACCGAAT TGCCGGGTTA CACTCGTCAT TCTTTCTGCC 520

CTACCGGGAC CACCGGAATG AATTTTACAG GGGGTAATTT 560

GTATGTGTGT CCCTGCACTG TAAATACAGG GGCCACCACA 600

CTAAATGCCA TTTATATGGT GTTTGTGATT ACTCAATCAG 640

CTTTGGGAAC TAATTTCTTT GCTTCTAACA CCCCTCCCAA 680

CACATTCTTT TTAACTCCCC CCATTCCCTT TACATAA 717

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGAGCAGCA GCGTGCCCCU GACCCUGGCC TACGACAGCA 40

CCGACTTCCA GGTGACCGAG AACGGCCUGG CCCUGAAGGT 80

GAGCCCCACC CAGACCCCCC UGACCCGCAT CATCAGCATG 120

GGCAACAACC UGTTCGACAG CGGCTACGAG ATCTTCGCCA 160

GCTGCCCCCA GAACAAGGCC GCCAAGGTGG CCGGCTACGT 200

GTACCUGACC AGCGTGGGCG GCCUGGTGCA CGGCACCATC 240

CAGATCAAGG CCACCGCCGG CTACUGGTTC ACCGGCGAGA 280

ACAGCGTGCA GGAGAGCATC CGCTTCGGCC UGGTGCUGTG 320

CCCCTTCAGC GCCCGCGACC CCACCGCCAA CCUGAGCGGC 360

UGGCCCGCCC CCGTGGTGUG GAGCGGCGAC AGCAACACCC 400

CCCUGTACTT CGCCGCCAAC GCCATCAGCT ACACCAACAA 440

CCGCGTGAAC CACGCCGTGA CCGGCAACTT CTACAAGGAG 480

GAGACCGAGC UGCCCGGCTA CACCCGCCAC AGCTTCTGCC 520

CCACCGGCAC CACCGGCATG AACTTCACCG GCGGCAACCU 560

GTACGTGTGC CCCTGCACCG TGAACACCGG CGCCACCACC 600

CUGAACGCCA TCTACATGGT GTTCGTGATC ACCCAGAGCG 640

CCCUGGGCAC CAACTTCTTC GCCAGCAACA CCCCCCCCAA 680

CACCTTCTTC CUGACCCCCC CCATCCCCTT CACCTAA

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

AAACATATGT CGAGCTCGGT ACCTTT 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

AAACTCGAGT TATGTAAAGG GAATGG 26