專利名稱：一種缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生命科學領域，是一種治療腫瘤的缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方案。
惡性腫瘤嚴重危及人類的生命健康。目前對惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對極大多數(shù)腫瘤的治療療效仍不十分理想，對于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等，因此，研究選擇性殺滅腫瘤細胞而不影響正常細胞的治療方案對腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細胞的治療方案主要依賴于腫瘤細胞的特異性標記，其療效也決定于該腫瘤標記是否嚴格限制于腫瘤細胞內(nèi)。
近年來，這些腫瘤細胞上的病毒蛋白已作為免疫治療的特異性靶目標，但由于在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中，為逃避免疫監(jiān)控，腫瘤細胞發(fā)生很多變化，如很多腫瘤細胞MHC 1類基因表達及抗原提呈能力下調(diào)，缺乏免疫細胞刺激的第二信號，因而不能有效激活細胞毒T細胞來殺滅腫瘤細胞，因此在臨床上免疫治療療效并十分不理想。
本發(fā)明的目的在于提供一種E1b 55Kda蛋白基因新型突變的缺陷型腺病毒及其構(gòu)建的新方法。
基因治療是近年興起的惡性腫瘤的治療方案的一種新的方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種，病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細胞，同時具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點。腺相關病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞的能力，能持久的表達。與此相反，非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達時間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺病毒是目前腫瘤基因治療的最常見病毒載體，已廣泛地應用于人體基因治療方案中，具有容易生產(chǎn)及純化的特點，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞，無致癌性。腺病毒的某些病毒蛋白具有抗腫瘤作用，如E1a具有對HER-2/neu過度表達腫瘤起抑制作用，包括下調(diào)HER-2/neu基因表達，降低致瘤性，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，誘導腫瘤細胞凋亡及增強腫瘤的化療敏感性等多種作用。目前常用的腺病毒載體系統(tǒng)其E1(包括E1a及E1b)缺失，從而使該腺病毒缺乏E1a抗腫瘤的作用。
本發(fā)明的缺陷型腺病毒是E1b 55Kda蛋白基因部分缺失并在缺失部位插入終止密碼子，2809-3329bp缺失，該缺失部位插入DNA片段TAATGAGTAACTAA，該DNA片段中含有兩個終止密碼子，分別是TAA及TGA。
本發(fā)明的缺陷型腺病毒與化學治療藥物如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等、生物毒素如蛇毒素、單克隆抗體如抗肝癌細胞抗體等一起可以組成復合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。
本發(fā)明的缺陷型腺病毒構(gòu)建方法是將兩個腺病毒載體轉(zhuǎn)染給會產(chǎn)生重組的細胞，使兩個腺病毒載體中一個E1b 55Kda蛋白基因的2809-3329bp缺失，在其缺失部位插入終止密碼子，即插入DNA片段TAATGAGTAACTAA，該DNA片段中含有兩個終止密碼子，分別是TAA及TGA。
人類腺病毒有6個不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。下面以腺病毒C亞屬5型Ad5作為例證。
腺病毒系統(tǒng)是由兩個載體組成，一個載體提供腺病毒的左臂部分，另一個載體提供右臂，這兩個載體至少有500nt的同源重組區(qū)，然而其轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生重組腺病毒，載體系統(tǒng)質(zhì)粒pXC1，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3區(qū)Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3區(qū))。
本發(fā)明在插入連接頭兩端附近位置中合成的聚合酶鏈式反應的引物是CTG GCC AAT ACC AAC CTT AATA TGA GCT CAC AAT GCT TC本發(fā)明將該缺陷型腺病毒轉(zhuǎn)染至E1轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞株293或E1轉(zhuǎn)化的人胚胎視網(wǎng)膜細胞株911，能有效地制成具有抗腫瘤腺病毒。
本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供一種E1b 55Kda蛋白基因新型突變的缺陷型腺病毒，經(jīng)動物實驗證明該腺病毒可用于治療多種腫瘤。
2.本發(fā)明提供一種E1b 55Kda蛋白基因新型突變的缺陷型腺病毒的構(gòu)建方法。該方法可用于構(gòu)建新型缺陷型腺病毒，該方法易為操作人員掌握，并可用于構(gòu)建多種新型缺陷型腺病毒，為基因治療疾病建立了良好的基礎。
3.動物實驗證明該重組腺病毒能選擇性殺滅腫瘤細胞而不影響正常細胞的治療，為今后用于人類腫瘤治療打下了基礎。
實施例例一、腺病毒E1b蛋白基因部分缺失及在缺失區(qū)插入終止密碼子載體的構(gòu)建pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。應用內(nèi)切酶Bgl II將該載體在3329bp中切開，然后用內(nèi)切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，應用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段對3’凹端補平，即為pXC.1載體中缺失2809bp-3329bp區(qū)域(具體方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。
合成兩個DNA寡核苷酸片段做一個連接頭，其DNA寡核苷酸序列為01 TAATGAGTAACTAA02 TTAGTTACTCATTA將兩個DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復性，復性后應用T4噬菌體多核苷酸激酸進行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭與缺失2809-3329bp區(qū)域的pXC.1載體片段進行連接，命名為pXC-del E1b(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。在插入連接頭兩端附近位置中合成引物，分別為03 CTG GCC AAT ACC AAC CTT A04 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC對pXC-del E1b進行聚合酶鏈式反應(PCR)進行體外擴增(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，其PCR產(chǎn)物進行測序。結(jié)果顯示CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTIGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，這表明pXC-delE1b為pXC.1載體中缺失了2809-3329區(qū)域并在該區(qū)域中插入TAATGAGTAACTAA。
將本發(fā)明的缺陷型病毒轉(zhuǎn)染至E1轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞株293或E1轉(zhuǎn)化的人胚胎視網(wǎng)膜細胞株911細胞，本發(fā)明例將其轉(zhuǎn)染293細胞，293細胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞而成，它含有及表達5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-del E1b與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10或pBHGE3通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。pBHG10及pBHGE3購于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，該腺病毒命名為CNHK201及CNHK202，具體方法參見GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版。
例二.病毒的產(chǎn)生及基因組結(jié)構(gòu)重組腺病毒方法參見例一內(nèi)容。其名稱見下病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒 含Ad5右臂質(zhì)粒Ad5-del Elb E3CNHK201 pXC-del E1bPBHG10Ad5-del E1b CNHK202 pXC-del E1bPBHGE3腺病毒在293細胞中大量繁殖，應用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版)。其插入序列通過測序證實。Ad5-del E1b E3(CNHK201)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b(CNHK202)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
權(quán)利要求
1.一種缺陷型腺病毒，腺病毒的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失并在缺失部位插入終止密碼子，其特征為腺病毒2809-3329bp缺失，該缺失部位插入DNA片段TAATGAGTAACTAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺陷型腺病毒，其特征是該重組腺病毒可以與下列化合物之一組成復合物(1).化學治療藥物(2).生物毒素.(3).單克隆抗體.
3.一種缺陷型腺病毒的構(gòu)建方法，構(gòu)建后轉(zhuǎn)染至細胞，其特征是(1).將兩個腺病毒載體中一個E1b 55Kda蛋白基因2809-3329bp部分缺失及缺失區(qū)插入終止密碼子TAATGAGTAACTAA；(2).將上述兩個腺病毒載體轉(zhuǎn)染至重組細胞；(3).分離上述重組腺病毒。
4.根椐權(quán)利要求3所述的缺陷型腺病毒的構(gòu)建方法，其特征是將其重組后腺病毒轉(zhuǎn)染至E1轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞株293或E1轉(zhuǎn)化的人胚胎視網(wǎng)膜細胞株911細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種E1b55Kda蛋白基因新型突變的缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法,通過缺失突變聯(lián)合終止密碼子使該腺病毒載體E1b55Kda蛋白功能缺失,而保留腺病毒E1a、E1b、19Kda蛋白及其他腺病毒蛋白的功能。由于腺病毒E1a及其它病毒蛋白具有多種抗腫瘤作用,因此該缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)可用于多種腫瘤的治療。
文檔編號A61K35/76GK1254719SQ99124030
公開日2000年5月31日 申請日期1999年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日
發(fā)明者錢其軍, 岑信棠, 吳孟超, 車小燕 申請人:錢其軍, 岑信棠, 吳孟超, 車小燕