專(zhuān)利名稱(chēng)：犬五聯(lián)(犬狂犬、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用犬副流感病毒、犬瘟熱病毒、狂犬病毒、細(xì)小病毒、腺病毒制成的為病毒性抗原的醫(yī)藥制品。
犬狂犬病、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒性腸炎、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎和犬副流感是犬群中常見(jiàn)的六大傳染病，其中有的疫病發(fā)病率與死亡率高達(dá)50-100％，嚴(yán)重影響了軍犬警犬的發(fā)展和名貴犬品種的保種以及民間守門(mén)防盜犬的生命安全。國(guó)外美、英、法、日、俄等國(guó)在70年代就已開(kāi)始研制預(yù)防以上六種犬傳染病的單項(xiàng)活疫苗，到80年代后期，在四聯(lián)(無(wú)狂犬)苗的基礎(chǔ)上研制成功了包括鉤端螺旋體菌素在內(nèi)的犬五聯(lián)苗。60年代中期我國(guó)雖有獸用狂犬病羊腦滅活苗，但因工藝復(fù)雜、劑量大、副作用強(qiáng)烈、成本高，很難滿(mǎn)足全國(guó)各地防疫需要。1983年農(nóng)科院中國(guó)獸藥監(jiān)察所從國(guó)外引進(jìn)了狂犬ERA弱毒株，并和有關(guān)廠家協(xié)作試制成功了獸用狂犬病活疫苗。尤其是犬瘟熱迄今我國(guó)仍無(wú)源于我國(guó)本土制苗的種子毒，且用國(guó)外種毒制備的疫苗與我國(guó)野毒抗原性仍有偏移，結(jié)果導(dǎo)致了部分用苗單位的動(dòng)物保護(hù)不確實(shí)。
本發(fā)明的目的是采用獲自我國(guó)病犬體內(nèi)分得的野毒并經(jīng)致弱馴化的犬瘟熱弱毒株為對(duì)象，以及和從國(guó)外引進(jìn)的狂犬病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五聯(lián)苗，并加適當(dāng)耐熱穩(wěn)定劑而制成。該五聯(lián)苗安全性可靠、免疫效果好、且針對(duì)性強(qiáng)，適合我國(guó)病犬疾病的預(yù)防，可用于預(yù)防狂犬病、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎和犬副流感六種傳染病；且制苗工藝科學(xué)，程序可操作性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益可觀，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的犬五聯(lián)(犬狂犬、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。其生產(chǎn)工藝主要流程是種毒分離鑒定→細(xì)胞上傳代馴化→變溫變速擴(kuò)增→收毒→安全、效力檢驗(yàn)→濃縮→測(cè)定毒價(jià)→按比例配苗→加穩(wěn)定劑→分裝→凍干→成品檢驗(yàn)→貼簽包裝。其中作為制苗用種毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836為國(guó)內(nèi)多數(shù)現(xiàn)行制苗的毒種，犬細(xì)小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均由從國(guó)外引進(jìn)的SoLovary公司出品的犬四聯(lián)苗中分離鑒定篩選而得，其特別之處在于本發(fā)明中的犬瘟熱病毒弱毒株為在我國(guó)西北地區(qū)病犬體內(nèi)分得的一株野毒，經(jīng)在種源有異的細(xì)胞上傳代馴化、克隆擴(kuò)增、誘變減毒、篩選而得，經(jīng)鑒定，此毒株馴化譜清晰(見(jiàn)表)遺傳穩(wěn)定性可靠、與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)毒株SH-CDVOnder-stepoot株具有共同抗原性。因此，該犬瘟熱病毒弱毒毒株系制備活疫苗的最佳候選毒株。
在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中本發(fā)明提供了一種變溫變速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)新工藝。經(jīng)理論探討可能在35℃培養(yǎng)的病毒，隨著增殖不斷釋放在培養(yǎng)液中，該病毒因?qū)馍丶胞}離子抵抗力較脆弱，使病毒在液體里不斷滅活，這樣就降低了單位體積內(nèi)的毒價(jià)，如果待病變達(dá)30％時(shí)，將溫度降至22℃增高轉(zhuǎn)速，待病變形成80-90％時(shí)收毒，這樣可提高毒價(jià)33％左右，平均TCID50可提高3倍。
本發(fā)明還提供了采用培養(yǎng)物物理性?xún)鋈跐饪s新技術(shù)。將馴化后病毒苗液半成品冷凍后，再將凍結(jié)的毒液移至室溫下，令其自然融化，抽棄上層約1/3或1/2的區(qū)帶液體，將剩余毒液進(jìn)行濾過(guò)，所得濾液即為制苗用濃縮性原苗。
本發(fā)明還提供了一種新的耐熱穩(wěn)定劑配方，用于保護(hù)疫苗的抗原性，見(jiàn)表II。
附圖
為犬五聯(lián)疫苗的工藝流程簡(jiǎn)圖。
下面將結(jié)合(附圖)實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。
從國(guó)外引進(jìn)的Solovary公司制作的犬四聯(lián)苗中，分離篩選出增殖性良好的CPV-XN1、CAV2-XN3、和CPIV-XN4毒株，另外還通過(guò)離體異種細(xì)胞交叉?zhèn)鞔?，獲得我國(guó)唯一的CPV-112毒株，狂犬病毒ERA-836則系國(guó)內(nèi)現(xiàn)行制苗弱毒株。用于培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)用SPF雞胚自行制備，BHK21株地鼠腎細(xì)胞，非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero，F(xiàn)81株貓腎細(xì)胞系和MDCK株狗腎細(xì)胞系，均由農(nóng)業(yè)部中監(jiān)所或衛(wèi)生部藥品檢定所提供。將ERA-836、CPV-XN1、CPV-XN112，CAV2-XN2和CPIV-XN4分別在BHK21、F81CFF、MDCK和Vero細(xì)胞上培養(yǎng)。
其過(guò)程分別為
①CDV-XN112雞胚絨毛尿囊膜上盲傳5代→雞胚成纖維細(xì)胞上連傳47代→三次蝕斑克隆篩選種毒→MDCK細(xì)胞上傳40代→雞胚成纖維細(xì)胞上傳20代。傳至90代時(shí)，該毒株對(duì)犬即失去致病性。
②CPV-XN1在F81上傳1-5代。即為制苗用犬細(xì)小病毒性腸炎疫苗種毒，③CAV2-XN3在MDCK上傳2-5代，即為犬肝炎與喉氣管炎疫苗種子毒。
④CPIV-XN4在Vero增養(yǎng)7天即為犬副流患種子毒。
⑤ERA-836前期由蘭州獸醫(yī)生物藥廠提供，后期在BHK21細(xì)胞上培養(yǎng)制備而得。
在培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)病毒的CPE達(dá)30％時(shí)，就將培養(yǎng)瓶由35℃、轉(zhuǎn)速8-9轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)移至22℃、轉(zhuǎn)速14轉(zhuǎn)/分條件下，以提高單位體積內(nèi)的毒價(jià)。
培養(yǎng)過(guò)程完成后測(cè)定疫苗的安全性、效力及病毒抗原滴度，然后將裝有單種疫苗的培養(yǎng)瓶在-30℃下冷凍12小時(shí)，然后將培養(yǎng)瓶移至室溫下，待瓶?jī)?nèi)毒液自然融化后，抽棄上層約1/2-1/3液體，下層的毒液即為濃縮后的疫苗液，換算效價(jià)后，可將ERA-636、CPV-XN1，CDV-XN112，CAV2-XN3和CPIV-XN4培養(yǎng)液按0.15、0.40、0.15和0.15ml的比例混合均勻，將此弱毒苗液與耐熱穩(wěn)定劑等量混合，充分搖勻，銅網(wǎng)過(guò)濾后，定量分裝于瓶中，每瓶2ml，置可自動(dòng)壓塞的凍干機(jī)中凍干升華，最后測(cè)定其真空度含水量，并做三檢后于低溫或4-8℃保藏。
將疫苗作無(wú)菌、安全與效力測(cè)定。(見(jiàn)表III)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、針對(duì)性強(qiáng)生產(chǎn)犬五聯(lián)苗中所用的犬瘟熱弱毒株為從我國(guó)病犬體內(nèi)分得，與進(jìn)口的四株毒株按適當(dāng)比例配比適于我國(guó)病犬六種傳染病犬狂犬病、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒性腸炎、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎、犬副流感的預(yù)防，確系我國(guó)病犬傳染病預(yù)防首選特效藥品。
2、保護(hù)性好此犬五聯(lián)苗中所用的耐熱穩(wěn)定性配方速溶性好，耐熱性強(qiáng)，外觀可與進(jìn)口疫苗相比美。
3、毒價(jià)效力高生產(chǎn)工藝中采用轉(zhuǎn)溫轉(zhuǎn)速培養(yǎng)及冷凍濃縮兩種新工藝，使疫苗中平均毒價(jià)提高1～2倍左右，且保持原抗原滴度的穩(wěn)定性，可保持五種弱毒病毒粒子的完整性。值得一提的是該工藝還可剔除苗液中的小牛血清，避免犬體接種后所產(chǎn)生的異種蛋白性過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，使單位體積內(nèi)病毒含量成倍地提高。
本發(fā)明生產(chǎn)工藝科學(xué)，設(shè)備要求不高、可適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，因而此犬五聯(lián)苗高效價(jià)廉，有利于在我國(guó)普遍推廣應(yīng)用。
表I CDV-XN112株毒株馴化譜增殖 乳鼠神回 歸※傳代代次 增殖基質(zhì) 溫度 CPETCID50經(jīng)毒力 電鏡 動(dòng) 物1代雞胚絨 35℃ 非膿性※ 1-1兩相熱毛尿囊膜 蝕斑±2代雞胚絨 35℃ 10-2± 萎頓毛尿囊膜3代雞胚絨 35℃ 10-3+ 萎頓毛尿囊膜4-5代 雞胚成 33℃+10-3.510-4+ 萎頓纖維細(xì)胞6-10代 蝕斑克隆 33℃+10-410-3+ 一過(guò)型(Vero)11-30代 小斑擴(kuò)增 33℃+10-410-3.5+減食一天(Vero)31-50代 小斑擴(kuò)增 33℃+10-4.510-3+一過(guò)型(Vero)51-80代 犬MDCK 33℃+10-5.010-4+無(wú)異常細(xì)胞81-100代 犬MDCK 33℃+10-5.510-3+無(wú)異常細(xì)胞101-110代 雞胚成33℃+10-4.510-2+無(wú)異常纖維細(xì)胞
權(quán)利要求
1.犬五聯(lián)(犬狂犬、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗，其生產(chǎn)工藝主要流程是種毒分離鑒定→細(xì)胞上傳代馴化→變溫變速擴(kuò)增→收毒→安全、效力檢驗(yàn)→濃縮→測(cè)定毒價(jià)→按比例配苗→加穩(wěn)定劑→分裝→凍干→成品檢驗(yàn)→貼簽包裝。其中作為制苗用種毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836為國(guó)內(nèi)多數(shù)現(xiàn)行制苗的毒種，犬細(xì)小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均從國(guó)外引進(jìn)的SoLovary公司出品的犬四聯(lián)苗中分離鑒定篩選而得，其特征在于本發(fā)明中的犬瘟熱病弱毒株為在我國(guó)西北地區(qū)病犬體內(nèi)分得的一株野毒，經(jīng)在種源有異的細(xì)胞上傳代馴化、克隆擴(kuò)增、誘變減毒、篩選而得，經(jīng)鑒定，此毒株馴化譜清晰，遺傳穩(wěn)定性可靠、與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)毒株SH-CDV株具有共同抗原性，該犬瘟熱病毒弱毒毒株系制備活疫苗的最佳候選毒株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬五聯(lián)苗，其特征在于在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中本發(fā)明提供了一種變溫變速培養(yǎng)新工藝，即在培養(yǎng)過(guò)程中待細(xì)胞病變達(dá)30％時(shí)，將溫度調(diào)降并增高轉(zhuǎn)速，待病變形成80-90％時(shí)收毒，這樣可提高毒價(jià)33％左右，平均TCID50可提高3倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的犬五聯(lián)苗，其特征在于在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)物物理性?xún)鋈跐饪s新技術(shù)，將病毒苗液半成品冷凍后，再將凍結(jié)的毒液移至室溫下，令其自然融化，抽棄上層約1/3或1/2的區(qū)帶液體，將剩余毒液進(jìn)行濾過(guò)，所得濾液即為制苗用濃縮性原苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的犬五聯(lián)苗，其特征在于本發(fā)明還提供了一種新的耐熱穩(wěn)定劑配方，用于保護(hù)疫苗的抗原性，其配方為脫脂奶粉800～1200g，三餾水600～9000ml，蔗糖3％～10％，明膠0.1～0.4％，VC 1∶100～1∶200，谷氨酸鈉6％～10％，丁胺卡那霉素100～200萬(wàn)μ，兩性霉素3.25～6.25mg，強(qiáng)力解毒敏50～200毫升/萬(wàn)，K2HO410～13.15g，KH2PO42.0～4.48g。
全文摘要
犬五聯(lián)(犬狂犬、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。本發(fā)明采用我國(guó)病犬體內(nèi)分得的野毒并經(jīng)致弱馴化的犬瘟熱弱毒株為對(duì)象，以及和從國(guó)外引進(jìn)的狂犬病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五聯(lián)苗，并加適當(dāng)耐熱穩(wěn)定劑而制成，在制苗過(guò)程中本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)溫?cái)U(kuò)增、物理冷凍濃縮新技術(shù)、及改良的耐熱穩(wěn)定劑，使疫苗濃度高，免疫效果好，且針對(duì)性強(qiáng)，生產(chǎn)工藝科學(xué)，設(shè)備要求不高，因而此五聯(lián)苗高效價(jià)廉，有利于在我國(guó)普遍推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1137347SQ9510674
公開(kāi)日1996年12月11日 申請(qǐng)日期1995年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月22日
發(fā)明者李六金 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)