專利名稱：禽腺病毒復(fù)制非必須片段的篩選及其基因工程產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腺病毒最早發(fā)現(xiàn)于1953年，由于它們傾向于感染上皮細(xì)胞而被命名為腺病毒(Adenovirus，Adv)。腺病毒屬于腺病毒科(Adenoviridae)，在自然界中分布廣泛。根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)特性和宿主范圍可劃分為兩個(gè)屬哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)和禽腺病毒屬(Aviadenovirus)。
腺病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在感染過程中可以產(chǎn)生大量的病毒DNA，是真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的良好模型，腺病毒宿主范圍廣泛，感染率高，易于培養(yǎng)和純化；在腺病毒基因組特定區(qū)域插入外源基因，不影響病毒復(fù)制而能使外源基因良好表達(dá)；腺病毒作為活疫苗使用，比較安全。目前腺病毒基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的特征也已研究得相當(dāng)清楚，特別是一些人腺病毒和動(dòng)物腺病毒載體的構(gòu)建成功及其在臨床上的成功應(yīng)用，使得腺病毒作為載體的研究更受到普遍的重視。
構(gòu)建腺病毒載體包括將外源DNA插入腺病毒基因組中，通常插入的同時(shí)缺失E1區(qū)或E3區(qū)。人腺病毒E1區(qū)缺失病毒能在293細(xì)胞中增殖，對(duì)于病毒的存活而言，E1或E3區(qū)的缺失并不影響包裝信號(hào)。此外，在相應(yīng)細(xì)胞系的輔助下，還出現(xiàn)了纖維蛋白基因的缺失性載體，甚至是缺失所有的病毒編碼基因的載體。由于腺病毒的復(fù)制能力具有較強(qiáng)的種類特異性，因此為了避免應(yīng)用不適合的載體，需要構(gòu)建不同種類的腺病毒載體。動(dòng)物腺病毒載體的構(gòu)建主要基于人腺病毒載體的構(gòu)建。目前研究得較多的動(dòng)物腺病毒主要有牛、犬、鼠、豬等。其中豬腺病毒3型(PAV-3)為基礎(chǔ)的載體已在臨床中得到應(yīng)用。Monteil等將含有偽狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因的復(fù)制缺陷腺病毒重組子臨床應(yīng)用于新生仔豬，結(jié)果證實(shí)能產(chǎn)生中和抗體，且不受母抗的影響，對(duì)仔豬的保護(hù)達(dá)16周之久。Hammond JM等將含有豬瘟gp55(E2)的重組豬腺病毒(rPAV)用一劑量免疫新生仔豬后，也能產(chǎn)生有限的保護(hù)作用。
禽類腺病毒至少有10個(gè)血清型，其中雞胚致死孤兒病毒(CELO)即禽腺病毒1型、禽腺病毒10型、鵝源腺病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒等均已完成物理圖譜的構(gòu)建、全序列分析或重要序列的分析，為構(gòu)建禽類腺病毒表達(dá)性載體打下了基礎(chǔ)。代表血清I型禽腺病毒的CELO病毒是研究得相對(duì)比較透徹的，其基因組全長(zhǎng)為438048bp，目前已完成了全序列的測(cè)定工作。
Anne-Isabelle Michou等利用病毒在E.coli內(nèi)的同源重組技術(shù)構(gòu)建了CELO病毒載體。其研究結(jié)果鑒定了一系列的病毒復(fù)制必需區(qū)和右末端的一個(gè)復(fù)制非必需區(qū)，篩選出了AIM46 CELO載體，該載體應(yīng)用于禽類疫苗的研究開發(fā)，更重要的是鑒定了起反式作用的區(qū)域，為建立輔助細(xì)胞系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同樣，CELO載體也與Ad5載體一樣能轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此也表明了發(fā)展CELO載體用于人類基因治療的潛力。Francois A等利用點(diǎn)突變技術(shù)確定了CELO病毒的復(fù)制非必需區(qū)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了復(fù)制型CELO病毒載體。該載體可攜帶編碼IBDV蛋白的cDNA，并能作為雞的疫苗使用。Sheppard M等將IBDV的VP2基因置于FAV-10主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的下游，然后插入病毒基因組右末端99.5mu處的NotI位點(diǎn)(該位點(diǎn)在基因組上是唯一的)，構(gòu)建成了基因組無缺失、含有外源基因的重組FAV-10病毒。該重組病毒接種SPF雞可產(chǎn)生抗體反應(yīng)，能有效抵抗IBDV的感染。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于研究開發(fā)我國(guó)適于家禽免疫的可復(fù)制性病毒活載體，研制相關(guān)基因工程疫苗，以期在控制禽類重要傳染病方面發(fā)揮作用。
本發(fā)明以中國(guó)雞群分離的I群禽腺病毒為材料，通過PCR方法將該病毒基因組的兩個(gè)末端L片段和r片段、ITR片段擴(kuò)增出來，克隆進(jìn)pHC粘粒載體中，并以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，插入設(shè)計(jì)好的r片段和ITR片段之間，構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFAV-eGFP，然后轉(zhuǎn)染已被野生病毒感染了的雞胚腎細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，通過無限稀釋法篩選重組病毒，獲得表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組禽腺病毒。從而確定位于基因組右末端r片段和ITR片段之間的位點(diǎn)為病毒復(fù)制非必需區(qū)，并以此為載體開發(fā)研制相關(guān)基因工程產(chǎn)品。
本發(fā)明還在于篩選獲得表達(dá)外源基因的重組禽腺病毒。
本發(fā)明還在于上述篩選獲得表達(dá)外源基因的重組禽腺病毒用于生產(chǎn)基因工程疫苗。
具體實(shí)施例1.FAVI的擴(kuò)增與病毒DNA的提取將病毒原液進(jìn)行100倍稀釋后接種9日齡SPF雞胚，37℃孵化6天后取尿囊液，做適當(dāng)處理后負(fù)染，觀察病毒形態(tài)，然后取尿囊液用蛋白酶K消化，按常規(guī)方法提取病毒基因組DNA備用。
2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的FAVI病毒全基因組序列，設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，它們分別是PL15’ggggcggccgcgatgatgtataataacct3’；PL25’gggtctagactcacgcgacatgactgtct3’
Pr15’gcgtctagaccagaaccattcttcagccg3’Pr25’gcggaattcgtaccggactgttgtgcgga3’PITR15’gcggaattcacacacggacaacttcaaag 3’PITR25’gcggtcgacgatgatgtataataacctc 3’分別擴(kuò)增I群禽腺病毒基因組左末端L片段、右末端r片段和右ITR片段。
3 PCR擴(kuò)增取0.1μg的病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用50μl的PCR體系DNA 0.1μg，10×PCRbuffer 5μl，25mM MgCl2 3μl，10mM dNTP 1μl，上游引物和下游引物各25pmol，Taq酶0.5U，加滅菌超純水至50μl，并按以下程序進(jìn)行①94℃ 5min，②94℃1min，③56℃1min，④72℃ 2min，⑤重復(fù)②-④步30個(gè)循環(huán)⑥72℃ 10min⑦4℃forever⑧end。
4.PCR產(chǎn)物的回收、連接及測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，取回收產(chǎn)物按3∶1的比例與pGEM-Teasy載體于4℃連接8hr以上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，通過X-Gal板篩選白斑，酶切鑒定，三個(gè)片段的陽性質(zhì)粒pGEM-T-L、pGEM-T-r、pGEM-T-ITR用于下一步的克隆并測(cè)序。
5 含eGFP基因FAVI轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建首先將pGEM-T-r用EcoRI、SpeI酶切，回收2kb的r片段，克隆進(jìn)已用相應(yīng)酶酶切的PHC載體中，然后再將pGEM-T-ITR中的ITR片段以EcoRI、SalI插入到已含有r片段的pHC-FAVI-r載體中，獲得載體pHC-FAVI-r-ITR，在該載體的EcoRI位點(diǎn)插入含CMV啟動(dòng)子和SV40 polyA的eGFP表達(dá)盒，獲得含有報(bào)告基因的pHC-FAVI-r-ITR-eGFP轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體，為了利于細(xì)胞內(nèi)的同源重組，最后還在pHC-FAVI-r-ITR-eGFP插入FAVI的L片段。
6 含eGFP基因重組FAVI的構(gòu)建在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代CEK至形成80％單層，以100個(gè)TCID50wt-FAVI感染CEK，37℃作用2h；同時(shí)，在2個(gè)eppendorf管中各加入100μl無血清的DMEM，然后分別加入7-8μl Lipofectin和1.5-4μg的FAVI轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA，置室溫45min，將2管混合，室溫作用15mins，加入800μl無血清的DMEM，輕輕將此轉(zhuǎn)染混合液轉(zhuǎn)移到已感染FAVI的CEK上，在37℃，5％CO2作用6h，吸去轉(zhuǎn)染液，加入含8％小牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)2-3天，每天觀察熒光直至出現(xiàn)重組病毒熒光斑。
7 熒光細(xì)胞的收獲及含eGFP基因重組FAVI的傳代在出現(xiàn)熒光的培養(yǎng)皿中覆蓋營(yíng)養(yǎng)瓊脂(2×細(xì)胞培養(yǎng)維持液與1.6％瓊脂等體積混合，5ml/dish)，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)24-48hr。將細(xì)胞核中出現(xiàn)熒光的細(xì)胞及細(xì)胞集落在熒光顯微鏡下作好標(biāo)記，然后用吸管將其吸出，置于1ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次后，取上清，以不同的稀釋倍數(shù)感染24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的CEK，待出現(xiàn)熒光后，再進(jìn)行熒光挑斑。
權(quán)利要求
1.禽腺病毒復(fù)制非必須片段的篩選，其特征在于主要由以下步驟完成1)以中國(guó)雞群分離的I群禽腺病毒為材料，通過PCR方法將病毒基因組的兩個(gè)末端L片段和r片段、ITR片段擴(kuò)增出來，克隆進(jìn)載體，并以報(bào)告基因插入設(shè)計(jì)好的r片段和ITR片段之間，構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體；2)將構(gòu)建的禽腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染已被野生病毒感染了的雞胚腎細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于以PCR分別對(duì)禽腺病毒基因DNA基因組左末端L片段、右末端r片段和右ITR片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于擴(kuò)增基因組左末端L片段的上、下游引物分別是PL15′ggggcggccgcgatgatgtataataacct3′；PL25′gggtctagactcacgcgacatgactgtct3′。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于擴(kuò)增基因組右末端r片段的上、下游引物分別是Pr15′gcgtctagaccagaaccattcttcagccg3′；PL25′gcggaattcgtaccggactgttgtgcgga 3′。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于擴(kuò)增基因組右ITR片段的上、下游引物分別是PITR15′gcggaattcacacacggacaacttcaaag 3′；PITR25 gcggtcgacgatgatgtataataacctc 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟1)中載體克隆構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的方法是首先將2kb的r片段克隆進(jìn)已用相應(yīng)酶酶切的PHC載體中，然后再將ITR片段插入到已含有r片段的pHC-FAVI-r載體中，獲得載體pHC-FAVI-r-ITR，在該載體的EcoRI位點(diǎn)插入含CMV啟動(dòng)子和SV40polyA的eGFP表達(dá)盒，獲得含有報(bào)告基因的pHC-FAVI-r-ITR-eGFP轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體，為了利于細(xì)胞內(nèi)的同源重組，最后還在pHC-FAVI-r-ITR-eGFP插入FAVI的L片段。
7.如權(quán)利要求1所述篩選獲得表達(dá)外源基因的重組禽腺病毒。
8.如權(quán)利要求1所述篩選獲得表達(dá)外源基因的重組禽腺病毒生產(chǎn)基因工程疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。以中國(guó)分離的I群禽腺病毒為材料，通過PCR方法將該病毒基因組的兩個(gè)末端L片段和r片段、ITR片段擴(kuò)增出來，克隆進(jìn)pHC粘粒載體中，并以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，插入設(shè)計(jì)好的r片段和ITR片段之間，構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFAV－eGFP，然后轉(zhuǎn)染已被野生病毒感染了的雞胚腎細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組病毒，獲得表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組禽腺病毒。從而確定位于基因組右末端r片段和ITR片段之間的位點(diǎn)為病毒復(fù)制非必需區(qū)，并以此為載體開發(fā)研制相關(guān)基因工程產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1462804SQ03131899
公開日2003年12月24日 申請(qǐng)日期2003年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日
發(fā)明者秦愛建, 何秀苗, 劉岳龍, 金文杰 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)