本發(fā)明屬于微生物學和免疫學領域，具體涉及胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗。

背景技術：

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一種高度傳染性、致死性的呼吸道疾病。該病原菌血清型較多，可感染各年齡段豬，且分布范圍廣，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失。

現(xiàn)有技術中，每種血清型的APP滅活疫苗只能保護同一血清型的APP菌株攻擊，顯著提高了疫苗防疫成本。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗，不僅能夠完全保護同一血清型胸膜肺炎放線桿菌的攻擊，而且能夠?qū)ζ渌逍吞峁┝己玫慕徊婷庖弑Ｗo，顯著降低了疫苗防疫成本。

本發(fā)明的目的采用如下技術方案實現(xiàn)：

胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗，含有胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株菌影。

在本發(fā)明中，所述疫苗中的菌數(shù)至少為1×10⁹CFU/mL。

在本發(fā)明中，所述疫苗是將菌影懸浮液與礦物油按照體積比為1:2.5-3.5混合、乳化后獲得的。

在本發(fā)明中，所述菌影是將胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株采用NaOH處理后得到。

優(yōu)選的技術方案中，NaOH處理時的溫度為30-40℃。

優(yōu)選的技術方案中，所述菌影采用如下方法制備：將培養(yǎng)12-24h的胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株采用緩沖液懸浮，得到濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的活菌懸浮液；在所述活菌懸浮液中加入2-4mg/ml的NaOH溶液處理40-80min，離心取沉淀，得到菌影；所述活菌懸浮液與NaOH溶液的體積比為1:1。

優(yōu)選的技術方案中，所述菌影采用如下方法制備：將培養(yǎng)24-72h的胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株采用緩沖液懸浮，得到濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的活菌懸浮液；在所述活菌懸浮液中加入3.5-6.5mg/ml的NaOH溶液處理55-80min，離心取沉淀，得到菌影；所述活菌懸浮液與NaOH溶液的體積比為1:1。

優(yōu)選的技術方案中，培養(yǎng)48-72h的胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株采用4.5-6.5mg/ml的NaOH溶液處理；培養(yǎng)24-48h的胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株采用3.5-5.5mg/ml的NaOH溶液處理。

有益效果：本發(fā)明胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗具有良好的免疫保護效力，可以刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體，不僅能完全保護同一血清型菌株的攻擊，而且能夠?qū)ζ渌逍吞峁┝己玫慕徊婷庖弑Ｗo，顯著降低了防疫成本。本發(fā)明利用單一的化學試劑替代傳統(tǒng)方法來制備胸膜肺炎放線桿菌菌影，提供了一種新的胸膜肺炎放線桿菌菌影制備方法，取得了良好的效果，并且操作簡單、快速而高效，顯著降低了生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1最小抑菌濃度的NaOH溶液不同處理時間對培養(yǎng)12h菌液裂解率的影響。

圖2最小抑菌濃度的NaOH溶液不同處理時間對培養(yǎng)24h菌液裂解率的影響。

圖3最小抑菌濃度的NaOH溶液不同處理時間對培養(yǎng)48h菌液裂解率的影響。

圖4最小抑菌濃度的NaOH溶液不同處理時間對培養(yǎng)72h菌液裂解率的影響。

圖5APP血清1型Shope株菌影掃描電鏡觀察，其中圖5(B)是未處理的細菌，圖5(A)是經(jīng)NaOH處理制備的菌影。

具體實施方式

下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1制備胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株菌影

1.細菌的培養(yǎng)

由于APP血清1型Shope株培養(yǎng)72h后，生長已經(jīng)進入衰亡期，繁殖越來越慢，菌體易發(fā)生腫脹或衰變，菌液中存在大量死亡細菌，NaOH與之反應后菌體極易發(fā)生皺縮。因此，本發(fā)明研究如何將培養(yǎng)時間分別12h、24h、48h、72h的細菌制備成菌影。

將APP血清1型Shope株(邱索平，何孔旺，劉中勇，林志雄，陳文。豬胸膜肺炎放線桿菌PCR快速分型系統(tǒng)的建立及應用。中國動物檢疫，2011，28(8)：41-45)從凍存管中接入含有0.01％(質(zhì)量百分濃度)NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的THB培養(yǎng)基，在37℃條件下培養(yǎng)14-18h，然后按照接種量為2％接入含有0.01％(質(zhì)量百分濃度)NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的THB培養(yǎng)基，在37℃、振蕩條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為12h、24h、48h、72h，分別取菌液。

對上述不同培養(yǎng)時間收獲的菌液進行如下處理：菌液在4～8℃、9000rpm條件下離心15min，棄上清，用無菌pH 7.4的PBS緩沖液(PBS緩沖液是含有3.2mM Na₂HPO₄、0.5mM KH₂PO₄、1.3mM KCl和135mM NaCl的水溶液)洗滌三次后重懸，將不同培養(yǎng)時間收獲的菌液均調(diào)整至菌數(shù)為1×10⁸CFU/mL和1×10⁹CFU/mL。

2.NaOH的抑菌試驗

用含有0.01％(質(zhì)量百分濃度)NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的THB培養(yǎng)基稀釋起始濃度為30mg/ml的NaOH溶液，將其濃度分別調(diào)至30mg/mL、25mg/mL、20mg/mL、17.5mg/mL、15mg/mL、12.5mg/mL、10mg/mL、7.5mg/mL、5mg/mL和2.5mg/mL。在96孔微量培養(yǎng)板(8行×12列)中檢測不同濃度的NaOH溶液對不同培養(yǎng)時間、不同濃度菌液的抑制作用。每孔中加入100μL菌液和100μLNaOH溶液，然后在37℃孵育24h，讀取OD₆₀₀值。NaOH溶液濃度的考察范圍為30mg/mL、15mg/mL、12.5mg/mL、10mg/mL、8.75mg/mL、7.5mg/mL、6.25mg/mL、5mg/mL、3.75mg/mL、2.5mg/mL；菌液培養(yǎng)時間的考察范圍為12h、24h、48h和72h；菌液濃度的考察范圍為1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL。陰性對照孔加200μL含有0.01％NAD的THB培養(yǎng)基；陽性對照孔加100μL菌懸液和100μL含有0.01％NAD的THB培養(yǎng)基。

3.最小抑菌濃度的判定

判定標準：孵育24h后，某條件(此處條件是指培養(yǎng)時間和濃度)菌液采用NaOH溶液處理后的OD₆₀₀值與同樣條件菌液的陽性對照孔的OD₆₀₀值相比無升高，達到上述效果的NaOH溶液的最低濃度為該條件菌液的NaOH最小抑菌濃度。不同培養(yǎng)時間的不同濃度菌液所對應的NaOH最小抑菌濃度如表1所示。結(jié)果表明，處理前細菌培養(yǎng)時間越長，對應的NaOH最小抑菌濃度值越高；處理時菌液濃度的高低對其最小抑菌濃度值沒有影響，相同培養(yǎng)時間的不同濃度菌液對應的NaOH最小抑菌濃度相同。

表1 NaOH對APP血清1型Shope株的最小抑菌濃度

結(jié)合OD₆₀₀值和電鏡觀察結(jié)果，可見NaOH最小抑菌濃度不僅能夠抑制細菌的生長繁殖，并且在裂解細胞時最大程度的避免了細胞因破損嚴重而導致菌數(shù)的減少；若NaOH濃度過高，會引起細菌外膜破損嚴重甚至完全裂解，失去細菌的形態(tài)；若NaOH濃度過低，則達不到能夠水解蛋白的濃度，起不到裂解作用，細菌保持原有的成分與活性。

4.菌影制備時NaOH溶液的處理時間

將不同培養(yǎng)時間(12h、24h、48h和72h)的不同濃度菌液(1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL)與對應的最小抑菌濃度NaOH溶液等體積混合，考察37℃孵育不同時間(15，30，45，60，75min)對制備菌影的影響，用無菌PBS緩沖液代替NaOH溶液與菌液混合作為對照。取100μL經(jīng)NaOH處理的菌液和加入PBS緩沖液的對照菌液涂于THB(含0.1‰NAD)固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，數(shù)活菌數(shù)，實驗平行重復3次取平均值。

制備菌影中NaOH處理的最短時間判定標準：通過平板活菌計數(shù)檢測NaOH處理后細菌的存活情況，未能檢測到活菌存在的最短處理時間為NaOH制備菌影的最短處理時間。

不同培養(yǎng)時間的不同濃度菌液與其對應的最小抑菌濃度NaOH作用，制備菌影所需最短時間如表2所示。結(jié)果表明，處理前菌液培養(yǎng)時間越長、菌液濃度越高，制備菌影的時間越長。

表2制備APP菌影中采用最小抑菌濃度NaOH溶液處理的最短時間

5.菌影的保存

NaOH處理后，菌液在4～8℃、9000rpm條件下離心15min，棄上清，用無菌pH 7.4的PBS緩沖液反復洗滌三次后重懸，4℃保存至使用。

實施例2胸膜肺炎放線桿菌血清1型Shope株菌影的制備效果

按照實施例1中方法將培養(yǎng)12h、24h、48h、72h的APP血清1型Shope株調(diào)整為兩種濃度菌液(1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL)。將各條件(培養(yǎng)時間、濃度)菌液采用與其對應的最小抑菌濃度NaOH溶液在37℃處理15、30、45、60、75min，離心，取沉淀采用無菌pH 7.4的PBS緩沖液反復洗滌三次后重懸。菌液與NaOH溶液體積比為1:1。對照菌液是在100μL各條件菌液中加入100μL含有0.01％NAD的THB培養(yǎng)基。檢測各處理條件下細菌的裂解率，同時進行掃描電鏡(ScanningElectronMicroscope，SEM)觀察。

1.裂解率

按照如下公式計算裂解率：裂解率＝(1-NaOH處理后菌液的CFU/對照菌液的CFU)×100％。

如圖1-4所示，各條件(培養(yǎng)時間、濃度)的菌液在其對應最小抑菌濃度NaOH溶液的作用下，60min內(nèi)裂解率均可達到100％；處理前細菌培養(yǎng)時間越短，菌液濃度越小，裂解完全的時間就越短。

培養(yǎng)時間為12h，濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的菌液，采用2.5mg/mLNaOH溶液處理45～75min，菌體的裂解率達到100％。培養(yǎng)時間為24h，濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的菌液，采用3.75mg/mL NaOH溶液處理45～75min，菌體的裂解率達到100％。培養(yǎng)時間為48h，濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的菌液，采用5mg/mLNaOH溶液處理60～75min，菌體的裂解率達到100％。培養(yǎng)時間為72h，濃度為1×10⁸CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的菌液，采用6.25mg/mLNaOH溶液處理60～75min，菌體的裂解率達到100％。

2.掃描電鏡觀察

分別取經(jīng)NaOH處理制備的菌影和未處理的菌體，以終濃度為2.5％的戊二醛在4℃固定12h，經(jīng)多步乙醇脫水，丙酮脫水等常規(guī)步驟處理后用掃描電鏡進行觀察。結(jié)果如圖5所示，與未處理的細菌(圖5(B))相比，經(jīng)NaOH處理制備的菌影(圖5(A))，外膜孔道明顯，菌體保留完整的細胞外膜結(jié)構(gòu)，外膜中仍然包含脂多糖和肽聚糖等結(jié)構(gòu)，這些細胞表面結(jié)構(gòu)能夠被機體巨噬細胞和抗原遞呈細胞識別，進而刺激機體產(chǎn)生免疫保護反應。

在上述實驗中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間為12、24、48、72h的APP血清1型Shope株采用與其對應的最小抑菌濃度NaOH溶液處理15-75min，當裂解率達到100％時，細菌均形成了菌影，外膜孔道明顯，菌體保留完整的細胞外膜結(jié)構(gòu)，外膜中仍然包含脂多糖和肽聚糖等結(jié)構(gòu)。由于培養(yǎng)至12-24h的APP血清1型Shope株生長處于穩(wěn)定期，細菌繁殖速度漸趨下降，活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，細胞膜結(jié)構(gòu)形態(tài)完好；且菌液培養(yǎng)時間短，很大程度上節(jié)約菌影處理前的時間，提高了制備的效率；因此，細菌在處理前培養(yǎng)12-24h是制備菌影的最佳階段。

實施例3胸膜肺炎放線桿菌菌影疫苗的免疫效力試驗

1.疫苗制備

(1)對照疫苗的制備

將APP血清1型Shope株、3型S1421株、5a型K17株、7型WF83株(邱索平，何孔旺，劉中勇，林志雄，陳文。豬胸膜肺炎放線桿菌PCR快速分型系統(tǒng)的建立及應用。中國動物檢疫，2011，28(8)：41-45)菌液分別采用甲醛滅活，然后將滅活菌液與礦物油按照體積比為1：3混合、乳化，得到血清型1型、3型、5a型、7型菌株的油乳劑滅活苗(分別縮寫為S1滅活苗、S3滅活苗、S5a滅活苗、S7滅活苗)。各滅活苗的菌數(shù)均為1×10⁹CFU/mL。

(2)S1菌影疫苗的制備

按照實施例1中方法培養(yǎng)APP血清1型Shope株，收獲培養(yǎng)12h的細菌發(fā)酵液，離心，取沉淀用無菌pH 7.4的PBS緩沖液(PBS緩沖液是含有3.2mM Na₂HPO₄、0.5mM KH₂PO₄、1.3mM KCl和135mM NaCl的水溶液)洗滌三次后重懸調(diào)整菌數(shù)為1×10⁹CFU/mL。將1×10⁹CFU/mL的菌液與2.5mg/mL的NaOH溶液等體積混合，在37℃孵育45min，然后離心，取沉淀采用無菌pH 7.4的PBS緩沖液洗滌三次后重懸，得到菌數(shù)為4×10⁹CFU/mL的菌影懸浮液。

將菌數(shù)為4×10⁹CFU/mL的菌影懸浮液與礦物油按照體積比為1：3混合、乳化，制成1型菌影疫苗(縮寫為S1菌影疫苗)。S1菌影疫苗的菌數(shù)為1×10⁹CFU/mL。

2.免疫保護試驗

將180只5周齡Balb/C小鼠分為15個小組，每個小組12只。隨機選擇3個小組作為1型攻毒組，3型、5a型、7型攻毒組分別有4個小組。1型攻毒組中的前兩個小組分別免疫S1菌影疫苗和S1滅活苗，免疫方式為腹腔免疫，免疫劑量均為0.1mL/只，一免后14d二免，第三小組為不免疫空白對照組。3型攻毒組的前三個小組分別免疫S1菌影疫苗、S1滅活苗和S3滅活苗，免疫方式為腹腔免疫，免疫劑量均為0.1mL/只，一免后14d二免，第四小組為不免疫空白對照組。5a型攻毒組的前三個小組分別免疫S1菌影疫苗、S1滅活苗和S5a滅活苗，免疫方式為腹腔免疫，免疫劑量均為0.1mL/只，一免后14d二免，第四小組為不免疫空白對照組。7型攻毒組的前三個小組分別S1菌影疫苗、S1滅活苗和S7滅活苗，免疫方式為腹腔免疫，免疫劑量均為0.1mL/只，一免后14d二免，第四小組為不免疫空白對照組。

1型、3型、5a型、7型攻毒組Balb/C小鼠均在二免后14天，采用與其組名對應的血清型菌株進行腹腔攻毒，攻毒劑量為各菌株的最小致死量。各攻毒組免疫和攻毒情況見表3-表6。

3.免疫保護結(jié)果

從表3可見，S1菌影疫苗和S1滅活苗對APP血清1型Shope株攻毒的保護率都可達100％。

表3 1型攻毒組分組、免疫及攻毒結(jié)果

從表4可見，S1菌影疫苗對異型的APP血清3型S1421株攻毒的保護率可達41.7％，不僅高于S1滅活苗對異型的保護率，也高于同型S3滅活苗的保護率。

表4 3型攻毒組分組、免疫及攻毒結(jié)果

從表5可見，S1滅活苗對異型的APP血清5a型K17株沒有交叉保護性，而S1菌影疫苗可提供66.7％的保護率，且顯著高于同型S5a滅活苗的保護率。

表5 5a型攻毒組分組、免疫及攻毒結(jié)果

從表6可見，S1滅活苗對異型的APP血清7型WF83株沒有交叉保護性，而S1菌影疫苗可提供50％的保護率，與同型S7滅活苗的保護率相當。

表6 7型攻毒組分組、免疫及攻毒結(jié)果

4.抗體滴度

上述實驗中免疫S1菌影疫苗的小組和不免疫的小組(空白對照組)于免疫后0d、7d、14d、21d、28d分別采血，分離血清，用Shopes株全菌抗原包被酶標板，進行ELISA抗體效價檢測，結(jié)果見表7。

表7 S1菌影疫苗免疫后抗體效價

從表7可見，與不免疫的空白對照組相比，S1菌影疫苗免疫后14d抗體開始轉(zhuǎn)陽，并且逐漸升高，在28d時比值可達6.4。

從以上結(jié)果可知，本發(fā)明的胸膜肺炎菌影疫苗可以刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體，不僅可完全保護同型菌株的攻擊，而且對其它幾個APP主要血清型(3型、5a型、7型)也起到良好的交叉保護作用。