本發(fā)明涉及水蛭素制藥的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)的進(jìn)步和工業(yè)的發(fā)展，外傷所致肌腱損傷極為常見(jiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年因創(chuàng)傷和過(guò)量運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌腱損傷超過(guò)32萬(wàn)例。肌腱損傷及手術(shù)修復(fù)后發(fā)生的粘連，尤其是手外傷引起的肌腱粘連，會(huì)嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)，成為臨床亟待解決的難題。如何降低肌腱損傷及術(shù)后粘連的發(fā)生率，盡快恢復(fù)其滑動(dòng)功能，同時(shí)又不影響肌腱本身的愈合，成為近年研究的焦點(diǎn)。

肌腱粘連與肌腱愈合有著重要聯(lián)系，肌腱愈合過(guò)程中形成粘連的原因包括：①外源性愈合中，因成纖維細(xì)胞由周?chē)M織向肌腱斷端生長(zhǎng)，形成肌腱與周?chē)M織的粘連，這是粘連形成的主要因素。②由于炎性反應(yīng)導(dǎo)致局部組織滲出增多，機(jī)化后加重肌腱的粘連。③肌腱細(xì)胞自身增殖過(guò)程中與周?chē)M織形成粘連。外源性愈合所產(chǎn)生的瘢痕則會(huì)引起粘連形成，并影響肌腱滑動(dòng)。所以通過(guò)抑制腱鞘中的成纖維細(xì)胞的增殖，來(lái)抑制損傷肌腱的外源性愈合，從而防治外傷后肌腱粘連，成為治療的重要突破點(diǎn)。成纖維細(xì)胞是肌腱組織的基本功能單位，主要合成和分泌Ⅰ型膠原，維持肌腱組織的新陳代謝。

一般認(rèn)為，肌腱在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中伴隨著各類生長(zhǎng)因子的釋放與參與。細(xì)胞生長(zhǎng)因子是由細(xì)胞分泌的具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，是細(xì)胞因子的一類，具有調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞趨向性移動(dòng)、創(chuàng)傷細(xì)胞分裂激活、新生血管形成和細(xì)胞間質(zhì)合成的作用。與肌腱損傷修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括：TGFβ1、bFGF、MMP-2、MMP-9、BMP-12等。TGFβ1已被證實(shí)能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腱鞘成纖維細(xì)胞I型膠原、纖維結(jié)合素及a-SMA的表達(dá),揭示了TGFβ1通過(guò)干擾TGFβ/Smads信號(hào)通路以及抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化促進(jìn)肌腱粘連產(chǎn)生的機(jī)制,明確了其在肌腱愈合及粘連產(chǎn)生中發(fā)揮了重要的作用。龐久玲等通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48例瘢痕疙瘩、40例增生性瘢痕及40例正常皮膚組織中TGFβ1的表達(dá)，證實(shí)TGFβ1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織。而另一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF的作用卻與之相反，大量的研究顯示，bFGF能顯著促進(jìn)鞘內(nèi)肌腱的愈合，抑制肌腱粘連，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。Oryan等對(duì)兔屈肌腱損傷后修補(bǔ)模型局部注射bFGF，發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程，抑制肌腱粘連和增強(qiáng)肌腱細(xì)胞的增殖和成熟，增加膠原蛋白的分泌，改進(jìn)膠原纖維的聚合和排列方式，改善損傷后肌腱的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能。盛加根等研究發(fā)現(xiàn)，局部單次使用bFGF及5-氟尿嘧啶在有效促進(jìn)雞屈肌腱愈合的同時(shí)能減輕肌腱粘連。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一族含鋅或其他金屬離子的內(nèi)源性多肽酶，又稱為明膠酶。在已經(jīng)了解的MMPs中MMP-2是膠原及基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，此外還可以降解V、VII型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白等。MMP-2主要分布在成纖維細(xì)胞的周?chē)?，與瘢痕組織愈合早期細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝關(guān)系密切。瘢痕粘連增生的早期，MMP-2分泌增加能促進(jìn)基質(zhì)分解，利于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞遷移，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。為此，作為監(jiān)測(cè)肌腱粘連的重要指標(biāo)，為揭示肌腱粘連的機(jī)制，細(xì)胞生長(zhǎng)因子TGFβ1、bFGF和MMP-2被廣泛關(guān)注。

在藥物防治肌腱粘連得攻堅(jiān)戰(zhàn)中，中藥及中藥提取物因?yàn)槠滹@著的效果而受到大量研究。黃仲玉等臨床應(yīng)用海桐皮為君藥的中藥組方熏洗聯(lián)合行氣活血、舒筋利節(jié)的手法治療手部肌腱修復(fù)術(shù)后粘連，臨床結(jié)果顯示療效確切，能夠迅速消除腫痛，促進(jìn)指體功能的恢復(fù)。趙治偉等研究川芎嗪注射液及丹紅注射液與可吸收生物膜聯(lián)合應(yīng)用預(yù)防肌腱及組織粘連的有效性，證實(shí)預(yù)防肌腱粘連的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用吸收生物膜。

川芎嗪、當(dāng)歸及丹參注射液等常規(guī)的活血中藥制劑被大量用于研究，療效明確，但仍不足以十分有效的解決術(shù)后肌腱粘連。為此，我們將研究目標(biāo)鎖定在另一味傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，水蛭，及其被廣泛用于其他醫(yī)學(xué)疾病的藥物天然水蛭素。水蛭是一味傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有記載，《本草綱目》曰其:“入肝經(jīng)血分”?！吨袊?guó)藥典》記載水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癓等功效。其活性成分天然水蛭素(Hirudin)是從醫(yī)用水蛭唾液中提取的凝血酶抑制劑，是一種抗凝血蛋白質(zhì)，由65個(gè)或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約7000，被認(rèn)為是目前已知的最強(qiáng)效的凝血酶抑制劑之一。但是其作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不至于抗凝，國(guó)內(nèi)外對(duì)水蛭素突出的藥理、臨床等方面的研究得到深入的開(kāi)展,認(rèn)為其還具有抗血栓形成、抗纖維化等多方面的用途。水蛭素抑制細(xì)胞增生的作用被廣泛關(guān)注。李開(kāi)通等通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)水蛭素能夠抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，從而為燒傷愈合的患者減少瘢痕攣縮提供新途徑。郭睿等通過(guò)檢測(cè)水蛭素對(duì)人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞中bFGF、TGFβ1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)水蛭素能抑制bFGF、TGFβ1分泌，由此抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖并進(jìn)一步抑制瘢痕粘連的形成。

中藥及中藥制劑治療肌腱粘連，不僅能開(kāi)拓臨床診療思路，更能有效的防治肌腱粘連，同時(shí)能合理的降低醫(yī)療費(fèi)用。天然水蛭素作為一種活血化瘀的傳統(tǒng)中藥，近來(lái)被廣泛應(yīng)用于研究抑制各種成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別應(yīng)用于燒傷后的瘢痕愈合有十分顯著的療效。而天然水蛭素抑制肌腱長(zhǎng)纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)從而防治肌腱粘連的機(jī)制及療效有待我們進(jìn)一步發(fā)掘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供水蛭素用于制備治療術(shù)后肌腱粘連的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用兔趾深屈肌腱細(xì)胞體外培養(yǎng)，確定不同濃度的水蛭素對(duì)動(dòng)物肌腱成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用，以及不同濃度的天然水蛭素對(duì)肌腱成纖維細(xì)胞TGFβ1、bFGF、MMP-2表達(dá)水平的影響。TGFβ1是纖維化促進(jìn)因子，在肌腱愈合早期的外源性愈合中，能誘導(dǎo)肌腱成纖維細(xì)胞I型膠原（ColⅠ）、纖維結(jié)合素及a-SMA的過(guò)分表達(dá)，是目前已知的與病理性瘢痕關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，促進(jìn)肌腱細(xì)胞膠原合成的同時(shí)增加了術(shù)后瘢痕粘連組織的形成。bFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族原型，可通過(guò)與成纖維細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，下調(diào)病理性瘢痕組織中I型前膠原mRNA表達(dá)，提高膠原酶mRNA水平，刺激膠原酶合成，減少硫酸軟骨素粘多糖產(chǎn)生，抑制纖維素合成，防止過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而防止肌腱粘連。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）中的一種，是外基質(zhì)中膠原及基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，此外還可以降解V、VII型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白等。MMP-2分布在瘢痕粘連組織的各層，以成纖維細(xì)胞周?chē)娜旧蠲黠@，與粘連組織早期的細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝關(guān)系密切，是促進(jìn)創(chuàng)面過(guò)度修復(fù)形成肌腱瘢痕粘連的關(guān)鍵因素。瘢痕組織增生早期，MMP-2分泌增加促進(jìn)基質(zhì)分解，利于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞遷移，能促進(jìn)肌腱的愈合。本發(fā)明過(guò)不同濃度的天然水蛭素對(duì)TGFβ1、bFGF、MMP-2的表達(dá)作用的影響，確定了其預(yù)防肌腱粘連的作用及其機(jī)制。

附圖說(shuō)明

圖1為各濃度水蛭素（1，2，3，4，5，6，7，8，9和10U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞增殖活性抑制率的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線。

圖2為各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞TGFβ1表達(dá)結(jié)果圖。

圖3為各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF表達(dá)結(jié)果圖。

圖4為各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF表達(dá)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

1.材料

1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)成年雌性新西蘭兔5只,體重3～4kg,由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2、主要試劑天然水蛭素（廣西科康生物科技有限責(zé)任公司）；胰酶、I型膠原酶(Worthington公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Amresco公司)；二甲基亞砜(DMSO，Amresco公司)；TGFβ1、bFGF和MMP-2的ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3、主要儀器恒溫C02培養(yǎng)箱(CBl50型，Binder分司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)；電子天平(ABl04-S型，MettlerToledo公司)；電熱恒溫水浴槽(DK一600型，上海醫(yī)療器械五廠)；臺(tái)式離心機(jī)(800型，上海手術(shù)器械廠)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX800型，Bio-Tek公司)。

2.方法

2.1、兔肌腱成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

普通級(jí)成年雌性新西蘭兔5只(體重3～4kg,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),用氯胺酮肌注麻醉,無(wú)菌切取前肢中趾趾深屈肌腱,共10條,采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。用0．05％洗必泰溶液浸泡5min，生理鹽水漂洗3次，置于0．25％胰酶4℃冷消化18h，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，DMEM清洗，充分剪碎，加入0.2％I型膠原酶，37℃孵育1h，用吸管反復(fù)吹打組織塊，分散細(xì)胞，100目篩過(guò)濾消化液，收集濾過(guò)的細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清液；用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將沉淀的細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度。以5x105／ml的密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3d換液一次；細(xì)胞融合至80％～90％時(shí)按常規(guī)方法接種。實(shí)驗(yàn)選用第4-5代細(xì)胞。

2.2、天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞增殖活性的抑制作用

這里需要說(shuō)明的是水蛭素的單位U。本實(shí)驗(yàn)室是用凝血酶直接滴定法來(lái)測(cè)定。水蛭素的一個(gè)抗凝血酶活力單位U是指在37℃下，使一個(gè)單位的凝血酶失活所需水蛭素的量。實(shí)驗(yàn)按照水蛭素濃度分為四組：對(duì)照組（0U/ml）；1U/ml組；10U/ml組；50U/ml組。每組6孔。先每孔加入lxl04個(gè)細(xì)胞，37℃、5％C02條件下孵育12h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液600μl，其余各組每孔加入含對(duì)應(yīng)濃度水蛭素的DMEM培養(yǎng)液600μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔各加5mg／ml的MTT溶液40ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，加入300ulDMSO，振蕩15min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)490nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(OD值)。

各濃度水蛭素（1，2，3，4，5，6，7，8，9和10U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞增殖活性抑制率的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線如圖1所示。如圖，隨著水蛭素劑量增加，其對(duì)對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞增殖活性抑制率逐漸增強(qiáng)。

2.3、不同濃度的天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞TGFβ1表達(dá)作用的研究

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各組標(biāo)本的TGFβ1表達(dá)含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定樣品OD值，根據(jù)樣品吸光度值計(jì)算出樣品濃度。實(shí)驗(yàn)按照水蛭素濃度分為四組：對(duì)照組（0U/ml）；1U/ml組；10U/ml組；50U/ml組。每組6孔。先每孔加入lxl04個(gè)細(xì)胞，37℃、5％C02條件下孵育12h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μl，其余各組每孔加入含對(duì)應(yīng)濃度水蛭素的DMEM培養(yǎng)液100ul。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔各加生物素化的TGFβ1抗體稀釋液（Biotin-antiTGFβ1）100μl，用封板膠紙封住，繼續(xù)培養(yǎng)1h。洗板5次，且最后1次置厚吸水紙上拍干。每孔加入辣氧根過(guò)氧化物酶（HRP)100ul,混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。再次洗板拍干。每孔加入底物顯色溶液（TMB）100μl，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。每孔加入終止液50μl，混勻后即刻用酶標(biāo)儀測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD值）。

圖2是各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞TGFβ1表達(dá)結(jié)果圖，各劑量水蛭素均可促進(jìn)兔肌腱成纖維細(xì)胞分泌TGFβ1。

2.4、不同濃度的天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF表達(dá)作用的研究

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各組標(biāo)本的bFGF表達(dá)含量，具體操作步驟同2.3步驟，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)按照水蛭素濃度分為四組：對(duì)照組（0U/ml）；1U/ml組；10U/ml組；50U/ml組。每組6孔。先每孔加入lxl0⁴個(gè)細(xì)胞，37℃、5％C02條件下孵育12h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μl，其余各組每孔加入含對(duì)應(yīng)濃度水蛭素的DMEM培養(yǎng)液100μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔各加生物素化的bFGF抗體稀釋液（Biotin-antibFGF）100μl，用封板膠紙封住，繼續(xù)培養(yǎng)1h。洗板5次，且最后1次置厚吸水紙上拍干。每孔加入辣氧根過(guò)氧化物酶（HRP)100μl，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。再次洗板拍干。每孔加入底物顯色溶液（TMB）100μl，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。每孔加入終止液50μl，混勻后即刻用酶標(biāo)儀測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD值）。

圖3是各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF表達(dá)結(jié)果圖.

2.5、不同濃度的天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞MMP-2表達(dá)作用的研究

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各組標(biāo)本的MMP-2的表達(dá)含量，具體操作步驟同2.3步驟，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)按照水蛭素濃度分為四組：對(duì)照組（0U/ml）；1U/ml組；10U/ml組；50U/ml組。每組6孔。先每孔加入lxl0⁴個(gè)細(xì)胞，37℃、5％C02條件下孵育12h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μl，其余各組每孔加入含對(duì)應(yīng)濃度水蛭素的DMEM培養(yǎng)液100μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔各加生物素化的MMP-2抗體稀釋液（Biotin-antibMMP-2）100μl，用封板膠紙封住，繼續(xù)培養(yǎng)1h。洗板5次，且最后1次置厚吸水紙上拍干。每孔加入辣氧根過(guò)氧化物酶（HRP)100μl，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。再次洗板拍干。每孔加入底物顯色溶液（TMB）100μl，混勻后避光繼續(xù)培養(yǎng)20min。每孔加入終止液50μl，混勻后即刻用酶標(biāo)儀測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD值）。

圖4為各濃度水蛭素（0.75，1.5，3和6U/ml）對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF表達(dá)結(jié)果圖。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度天然水蛭素對(duì)兔趾深屈肌腱體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定和分析，達(dá)到如下成果：

1.明確天然水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)的兔肌腱成纖維細(xì)胞增殖活性具有抑制作用；

2.明確天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞TGFβ1的表達(dá)具有抑制作用；

3.明確天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞bFGF的表達(dá)具有促進(jìn)作用；

4.明確天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞MMP-2的表達(dá)具有促進(jìn)作用；

5.初步揭示不同濃度的天然水蛭素對(duì)兔肌腱成纖維細(xì)胞促進(jìn)作用的強(qiáng)弱以及其作用機(jī)制。