本發(fā)明涉及一種牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由屬于黃病毒科、瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種病毒性傳染病，主要侵害牛、羊、鹿、耗牛、豬等動物，各年齡牛均易感。臨床主要表現(xiàn)為腹瀉，急、慢性黏膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，免疫抑制，懷孕母畜流產(chǎn)或產(chǎn)生畸形胎兒等。1946年Olafson等在美國首次發(fā)現(xiàn)該病，以發(fā)熱、腹瀉和咳嗽為特征，稱為牛病毒性腹瀉。Ramsey和Chiverst于1953年首先發(fā)現(xiàn)了黏膜病(Mucosal disease，MD)，1971年美國獸醫(yī)協(xié)會將其統(tǒng)一命名為牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVD/MD)。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，是造成全球養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要病原。上世紀(jì)80年代初，李佑民等首次在流產(chǎn)胎兒的脾臟中分離并鑒定出BVDV，證明該病在我國的存在。血清學(xué)調(diào)查表明，BVD在我國呈上升趨勢。

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由屬于皰疹病毒科、水痘病毒屬的牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，又稱為“壞死性鼻炎”或“紅鼻病”。IBRV即牛I型皰疹病毒(BoHV-1)，能夠在牛體內(nèi)侵害多種系統(tǒng)的組織和器官，臨床癥狀表現(xiàn)為高熱，病牛體溫可達(dá)40℃以上、食欲降低、呼吸困難、流鼻液、上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎，病毒還可侵害生殖道。病毒感染能夠誘發(fā)產(chǎn)奶量下降和流產(chǎn)，并導(dǎo)致肉用牛和康復(fù)牛的生長緩慢，給養(yǎng)牛業(yè)造成極大的損失。該病最早于上世紀(jì)50年代在美國的科羅拉多州被發(fā)現(xiàn)，Madin在1956年首次從病牛體內(nèi)分離得到IBRV。1980年，周泰沖等首次在我國從新西蘭引進(jìn)的奶牛中分離鑒定了IBRV，之后廣東、廣西、河北、河南、內(nèi)蒙古、新疆、山東、青海、黑龍江等全國各地的黑白花、本地黃牛、牦牛和水牛均有IBR感染的報道。血清學(xué)調(diào)查顯示，IBR在我國牛群中廣泛流行，且呈明顯上升趨勢。

牛副流感(Bovine parainfluenza，BP)是由屬于副黏病毒科、呼吸道病毒屬的牛副流感3型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)引起的一種急性呼吸道疾病，其引起的病癥為牛副流行性感冒，又稱“運輸熱”，是一種急性接觸性傳染病，BPIV3對牛的致病力不強(qiáng)，但在繼發(fā)細(xì)菌、支原體及外界誘因的聯(lián)合作用下，則可產(chǎn)生嚴(yán)重呼吸道癥狀，甚至可引起病牛的死亡。BP與BVD、IBR一起構(gòu)成了牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的主要病原。目前，BRDC是引起世界范圍內(nèi)的飼養(yǎng)牛發(fā)病和死亡的主要原因，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。BP在世界上許多國家流行，我國于2008年在黑龍江首次分離到BPIV3，研究表明，BPIV3在我國抗體陽性率高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目在于采用一種牛腎細(xì)胞(MDBK)繁殖牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感3型病毒，進(jìn)而將此三種病毒作為抗原制備成預(yù)防BVD、IBR和BP的三聯(lián)滅活疫苗。

本發(fā)明的技術(shù)方案

1.一種牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該滅活疫苗含有牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒及牛副流感3型病毒的滅活抗原。

2.本發(fā)明所述的牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述滅活抗原是牛病毒性腹瀉病毒L株、牛傳染性鼻氣管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株的滅活病毒，該三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為CGMCC No.13787、CGMCC No.13786、CGMCC No.13788。

3.本發(fā)明所述的牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于該方法步驟包括：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：將牛腎細(xì)胞系(MDBK)采用貼壁培養(yǎng)或者懸浮培養(yǎng)或者微載體培養(yǎng)的的方式進(jìn)行傳代和培養(yǎng)；

(2)毒種繁殖：將牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒及牛副流感3型病毒作為生產(chǎn)種毒共同接種在牛腎細(xì)胞上，并通過細(xì)胞繁殖獲得制備疫苗用病毒抗原；

(3)抗原滅活：將制備的病毒液使用滅活劑進(jìn)行滅活；

(4)配苗：加入相應(yīng)的佐劑或者直接將滅活好的抗原進(jìn)行配苗。

本發(fā)明具體實施方式

1.BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的分離鑒定

(1)本發(fā)明所用毒株BVDV-L株于2010年分離自疑似發(fā)病牛的糞便，接種MDBK細(xì)胞后可產(chǎn)生細(xì)胞病變，能被BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，BVDV IFA熒光抗體檢測陽性，參照規(guī)程SN/T1905-2007，針對BVDV 5’-UTR設(shè)計特異性引物，引物序列如下：

BVDV-P1：5’-AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT-3’20(序列1)

BVDV-P2：5’-TCTGCAGCAC CCTATCAGG-3’19(序列2)

RT-PCR后擴(kuò)增出288bp特異性片段。

(2)IBRV-J1株于2011年分離自疑似發(fā)病牛的鼻拭子，接種MDBK細(xì)胞30h即可產(chǎn)生細(xì)胞病變，能被IBRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，參照規(guī)程SN/T 1918-2007，設(shè)計了擴(kuò)增IBRV gB、gE基因的特異性引物，引物序列如下：

gB-P1：5’-TACGACTCGT TCGCGCTCTC-3’20(序列3)

gB-P2：5’-GGTACGTCTC CAAGCTGCCC-3’20(序列4)

gE-P1：5’-GCTTCGGTCG ACACGGTCTT-3’20(序列5)

gE-P2：5’-CTTTGTCGCC CGTTGAGTCG-3’20(序列6)

提取DNA后PCR分別擴(kuò)增出491bp(gB基因)、271bp(gE基因)的特異性片段。

(3)BPIV3-S株分離自疑似發(fā)病牛的鼻拭子，接種MDBK細(xì)胞能產(chǎn)生細(xì)胞病變，根據(jù)病毒N蛋白設(shè)計特異性引物(參照文獻(xiàn)牛副流感病毒3型的分離鑒定和間接ELISA方法建立及初步應(yīng)用，劉鵬，2010)，引物序列如下：

BPIV3-P1：5'-GAGAAAGACC CAGGAAGACA GA-3'22(序列7)

BPIV3-P2：5'-ACACCCATCG CATAACTCCA GA-3'22(序列8)

提取RNA后RT-PCR可擴(kuò)增出704bp的特異性片段。

2.抗原制備

為解決BVDV、IBRV、BPIV3適應(yīng)轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK(來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)過程中出現(xiàn)的一系列問題，本發(fā)明提供了利用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)、微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的方法。

(1)利用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)細(xì)胞制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)培養(yǎng)細(xì)胞：首先復(fù)蘇種細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK到細(xì)胞瓶中，生長48小時左右，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:3的比例進(jìn)行傳代。加細(xì)胞生長液(含有10％(v/v)的小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，pH值為7.0)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，細(xì)胞長滿90％～100％時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。

2)繁殖毒種：取生長良好的上述MDBK細(xì)胞，用PBS洗2～3次，將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分別按照(V/V)0.1％、0.1％、0.2％的接毒量進(jìn)行接種。加入維持液(含2％(V/V)的小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，pH值為7.0)進(jìn)行培養(yǎng)。28～36小時細(xì)胞80％出現(xiàn)CPE時將轉(zhuǎn)瓶置于-20℃反復(fù)凍融2～3次，收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種。

(2)利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)細(xì)胞復(fù)蘇及馴化：從液氮罐中取出保存的MDBK細(xì)胞，置37℃水浴鍋內(nèi)快速融化，1000r/rmin離心1min，棄去凍存液，用含8％～10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)48小時左右，用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:5的比例進(jìn)行傳代。48小時后將細(xì)胞再次消化，收集細(xì)胞接種于250ml三角瓶中，置于37℃、100轉(zhuǎn)/分振蕩懸浮培養(yǎng)。調(diào)節(jié)pH值在6.8～7.4之間。待細(xì)胞增加至一定量時，轉(zhuǎn)入專用懸浮培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞訓(xùn)化，定期觀察，直到細(xì)胞團(tuán)塊消失，細(xì)胞96h內(nèi)生長到2～4×10⁶個/ml。

2)反應(yīng)器放大培養(yǎng)細(xì)胞：將馴化好的MDBK細(xì)胞接種至2L生物反應(yīng)器，提高轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分，充分懸浮細(xì)胞，降低轉(zhuǎn)速至50～80r/rmin，加入消泡劑(體積比0.1％)，培養(yǎng)72h，細(xì)胞密度達(dá)到2-4×10⁶個/ml，更換15L反應(yīng)器，降低轉(zhuǎn)速至40～60r/rmin，加入低血清懸浮培養(yǎng)基(含1％小牛血清)培養(yǎng)，使細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml，更換150L反應(yīng)器，以轉(zhuǎn)速150r/rmin，充分懸浮細(xì)胞，加入0.1％消泡劑，培養(yǎng)48～72h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml，放大至1000升反應(yīng)器。

3)繁殖毒種：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml時，將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分別按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量進(jìn)行接種，加入無血清專用懸浮培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每隔3小時取樣，檢測細(xì)胞形態(tài)，12～16小時收獲病毒液，采用高壓均質(zhì)機(jī)將收獲的病毒液進(jìn)行壓力破碎，釋放病毒粒子。

(3)利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)：復(fù)蘇種細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK到細(xì)胞瓶中，生長48h左右，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:3的比例進(jìn)行傳代。細(xì)胞長滿90％～100％時，用PBS洗滌2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集細(xì)胞并計數(shù)，每升培養(yǎng)基中加入3～5克微載體Cytodex I(購自GE公司)，按照每個微載體添加15～20個細(xì)胞的比例進(jìn)行細(xì)胞接種。

2)生物反應(yīng)器培養(yǎng)接種細(xì)胞：向生物反應(yīng)器中加入細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司DMEM高糖培養(yǎng)基，血清濃度為8％～10％)，微載體投放量為3～5g/L，調(diào)節(jié)各項指標(biāo)，溶氧量為35％、溫度為36.7℃、攪拌速度為50～60r/min、pH為7.15～7.40；每個微載體上細(xì)胞數(shù)達(dá)到150個以上時，排出反應(yīng)器中培養(yǎng)基，用PBS洗滌收集在容器中的微載體，并排出PBS，反復(fù)2～3次。

3)接毒、收毒：將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量分別加入到生物反應(yīng)器中，改變攪拌速度進(jìn)行均勻接種，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基(含2％血清DMEM高糖培養(yǎng)基)，進(jìn)行病毒繁殖，控制反應(yīng)器中培養(yǎng)條件：溶氧量為25％、溫度為36.7℃、攪拌速度為60r/min、pH為7.4。培養(yǎng)結(jié)束后分別收集病毒液。

(4)病毒液滅活

制備的病毒液按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行純凈性檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體，且每毫升BVDV-L株病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀，IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒含量不低于10^8.33TCID₅₀。使用甲醛或BEI滅活，檢驗合格后，進(jìn)行乳化配苗。

將檢驗合格的BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒，分別置于不同容器內(nèi)，加入一定工作濃度的甲醛或BEI，30℃～37℃，滅活24～36小時，取樣按10％接種量接種MDBK細(xì)胞，盲傳三代，進(jìn)行滅活檢測。

(5)乳化配苗

將分別制得BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒滅活抗原按比例混合，使得每劑量疫苗中，滅活前三種抗原含量BVDV-L株不低于10^7.5TCID₅₀/ml，IBRV-J1株、BPIV3-S株不低于10^8.33TCID₅₀/ml。將抗原緩緩注入佐劑中，按抗原：佐劑體積比1:1進(jìn)行混合乳化，配制成三聯(lián)滅活疫苗。

3.疫苗成品檢驗

(1)無菌檢驗按現(xiàn)行《《中國獸藥典》附錄(中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011年，本發(fā)明稱《中國獸藥典》)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。

(2)安全性試驗

1)替代動物試驗：試驗選用1.5～2.0kg的健康家兔6只，其中免疫組4只，對照組2只，免疫組家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml，對照組家兔各腿部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物1.0ml，連續(xù)觀察7天并每天下午定點測量體溫，應(yīng)不出現(xiàn)死亡及不良反應(yīng)，無臨床異常表現(xiàn)，體溫正常。選用350～400g健康雌性豚鼠6只，其中免疫組4只，對照組2只，免疫組豚鼠各頸部皮下注射疫苗0.5ml，對照組豚鼠各頸部皮下注射細(xì)胞培養(yǎng)物0.5ml，連續(xù)觀察7天，應(yīng)不出現(xiàn)死亡及不良反應(yīng)，無臨床異常表現(xiàn)。

2)本體動物試驗：試驗選用6月齡以上BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感牛4頭，其中免疫組2頭，對照組2頭，免疫組牛各頸部肌肉注射疫苗4.0ml，對照組牛各頸部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物4.0ml；選用2月齡BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感犢牛4頭，其中免疫組2頭，對照組2頭，免疫組犢牛各頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，對照組犢牛各頸部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物4.0ml。連續(xù)觀察14天，應(yīng)不出現(xiàn)死亡及不良反應(yīng)，無臨床異常表現(xiàn)，體溫正常。

(3)效力試驗

1)中和抗體檢測法：試驗選用350～400g健康雌性豚鼠8只(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)，其中免疫組5只，對照組3只，免疫組豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0ml，對照組豚鼠各腿部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物1.0ml，21天后同樣方式加強(qiáng)免疫，二免后21天心臟采血測定中和抗體水平，應(yīng)至少4只豚鼠的BVDV、IBRV、BPIV3中和抗體效價≥1:64。

2)牛體免疫攻毒法：試驗選用2～3月齡BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感牛30頭，其中免疫組15頭，攻毒對照組15頭，免疫組牛各頸部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同樣方式加強(qiáng)免疫，二免后21天將免疫牛隨機(jī)分為BVDV、IBRV及BPIV3組，每組5頭。BVDV組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行BVDV強(qiáng)毒攻毒，每頭牛左右鼻孔、口腔、頸部兩側(cè)肌肉各注射2.0ml BVDV強(qiáng)毒株；IBRV組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行IBRV強(qiáng)毒攻毒，每頭牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml IBRV強(qiáng)毒株；BPIV3組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行BPIV3強(qiáng)毒攻毒，每頭牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml BPIV3強(qiáng)毒株。攻毒后連續(xù)觀察14天，每天上午定點測量體溫，觀察臨床癥狀并采集鼻拭子進(jìn)行病原檢測與病毒分離。BVDV、IBRV及BPIV3攻毒對照牛均應(yīng)至少3頭發(fā)病，免疫組牛均應(yīng)至少4頭保護(hù)。

附圖說明

圖1家兔體溫趨勢圖，圖中顯示安檢家兔的體溫變化在正常范圍之內(nèi)。

圖2牛體溫趨勢圖，圖中顯示安檢牛的體溫變化在正常范圍之內(nèi)。

圖3犢牛體溫趨勢圖，圖中顯示安檢犢牛的體溫變化在正常范圍之內(nèi)。

本發(fā)明涉及的生物材料資源信息

本發(fā)明制苗用毒株:牛病毒性腹瀉病毒L株、牛傳染性鼻氣管炎病毒J1株及牛副流感3型病毒S株均為本發(fā)明在我國國內(nèi)分離獲得，該三株病毒已于2017年03月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為CGMCC No.13787、CGMCC No.13786、CGMCC No.13788。牛腎細(xì)胞系(MDBK)購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(保藏編號：CL21，請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p166)。

本發(fā)明的積極意義

本發(fā)明涉及一種預(yù)防牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感的三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明所述疫苗其有效成分包括牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒與牛副流感3型病毒的滅活抗原；該三聯(lián)滅活疫苗是采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶、全懸浮及微載體培養(yǎng)三種方法培養(yǎng)不同的傳代細(xì)胞系，并對該疫苗制備方法中的病毒增殖、制苗工藝等進(jìn)行了優(yōu)化。疫苗安全和效力檢驗結(jié)果顯示：使用本發(fā)明的三聯(lián)滅活疫苗免疫牛后沒有任何局部和全身不良反應(yīng)，所有的牛都產(chǎn)生了免疫保護(hù)，說明本發(fā)明的疫苗安全可靠，可達(dá)到“一針三防”的目的，降低經(jīng)濟(jì)損失。

實施例

實施例1

——牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗(L株+J1株+S株)的制備

1.抗原制備

為解決BVDV、IBRV、BPIV3適應(yīng)轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK(來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)過程中出現(xiàn)的一系列問題，本發(fā)明提供了利用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)、微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株的方法。

(1)利用轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)細(xì)胞制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)培養(yǎng)細(xì)胞：首先復(fù)蘇種細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK到細(xì)胞瓶中，生長48小時左右，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:3的比例進(jìn)行傳代。加細(xì)胞生長液(含有10％(v/v)的小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，pH值為7.0)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，細(xì)胞長滿90％～100％時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。

2)繁殖毒種：取生長良好的上述MDBK細(xì)胞，用PBS洗2～3次，將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分別按照(V/V)0.1％、0.1％、0.2％的接毒量進(jìn)行接種。加入維持液(含2％(V/V)的小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，pH值為7.0)進(jìn)行培養(yǎng)。28～36小時細(xì)胞80％出現(xiàn)CPE時將轉(zhuǎn)瓶置于-20℃反復(fù)凍融2～3次，收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種。

(2)利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)細(xì)胞復(fù)蘇及馴化：從液氮罐中取出保存的MDBK細(xì)胞，置37℃水浴鍋內(nèi)快速融化，1000r/rmin離心1min，棄去凍存液，用含8％～10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)48小時左右，用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:5的比例進(jìn)行傳代。48小時后將細(xì)胞再次消化，收集細(xì)胞接種于250ml三角瓶中，置于37℃、100轉(zhuǎn)/分振蕩懸浮培養(yǎng)。調(diào)節(jié)pH值在6.8～7.4之間。待細(xì)胞增加至一定量時，轉(zhuǎn)入專用懸浮培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞訓(xùn)化，定期觀察，直到細(xì)胞團(tuán)塊消失，細(xì)胞96h內(nèi)生長到2～4×10⁶個/ml。

2)反應(yīng)器放大培養(yǎng)細(xì)胞：將馴化好的MDBK細(xì)胞接種至2L生物反應(yīng)器，提高轉(zhuǎn)速150r/min，充分懸浮細(xì)胞，降低轉(zhuǎn)速至50～80r/rmin，加入消泡劑(體積比0.1％)，培養(yǎng)72h，細(xì)胞密度達(dá)到2～4×10⁶個/ml，更換15L反應(yīng)器，降低轉(zhuǎn)速至40～60r/rmin，加入低血清懸浮培養(yǎng)基(含1％小牛血清)培養(yǎng)，使細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml，更換150L反應(yīng)器，以轉(zhuǎn)速150r/rmin，充分懸浮細(xì)胞，加入0.1％消泡劑，培養(yǎng)48～72h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml，放大至1000升反應(yīng)器。

3)繁殖毒種：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10⁶個/ml時，將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株分別按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量進(jìn)行接種，加入無血清專用懸浮培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每隔3小時取樣，檢測細(xì)胞形態(tài)，12～16小時收獲病毒液，采用高壓均質(zhì)機(jī)將收獲的病毒液進(jìn)行壓力破碎，釋放病毒粒子。

(3)利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株抗原

1)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)：復(fù)蘇種細(xì)胞牛腎細(xì)胞系MDBK到細(xì)胞瓶中，生長48h左右，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，按照體積比1:3的比例進(jìn)行傳代。細(xì)胞長滿90％～100％時，用PBS洗滌2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集細(xì)胞并計數(shù)，每升培養(yǎng)基中加入3～5克微載體Cytodex I(購自GE公司)，按照每個微載體添加15～20個細(xì)胞的比例進(jìn)行細(xì)胞接種。

2)生物反應(yīng)器培養(yǎng)接種細(xì)胞：向生物反應(yīng)器中加入細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司DMEM高糖培養(yǎng)基，血清濃度為8％～10％)，微載體投放量為3～5克/升，調(diào)節(jié)各項指標(biāo)，溶氧量為35％、溫度為36.7℃、攪拌速度為50～60r/min、pH為7.15～7.40；每個微載體上細(xì)胞數(shù)達(dá)到150個以上時，排出反應(yīng)器中培養(yǎng)基，用PBS洗滌收集在容器中的微載體，并排出PBS，反復(fù)2～3次。

3)接毒、收毒：將BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株按照0.1％、0.1％、0.2％的接毒量分別加入到生物反應(yīng)器中，改變攪拌速度進(jìn)行均勻接種，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基(含2％血清DMEM高糖培養(yǎng)基)，進(jìn)行病毒繁殖，控制反應(yīng)器中培養(yǎng)條件：溶氧量為25％、溫度為36.7℃、攪拌速度為60r/min、pH為7.4。培養(yǎng)結(jié)束后分別收集病毒液。

(4)病毒液滅活

制備的病毒液按照《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純凈性檢驗，無細(xì)菌、霉菌、支原體。

病毒液病毒含量如表1。

表1病毒含量測定結(jié)果

結(jié)果顯示病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/ml，IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒含量均不低于10^8.33TCID₅₀/ml。用BEI滅活，檢驗合格后，進(jìn)行乳化配苗。

1)BEI配制：將0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH按體積比1:1混合，37℃環(huán)化1小時，生成BEI，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6。

2)滅活及檢驗：將檢驗合格的BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒，分別置于不同容器內(nèi)，加入工作濃度為0.003M的BEI，30℃，滅活24～36小時，取樣按10％接種量接種MDBK細(xì)胞，盲傳三代，進(jìn)行滅活檢測。

3)中和：滅活完全后，加入終濃度為0.03M的硫代硫酸鈉進(jìn)行中和。

(5)乳化配苗

將分別制得BVDV-L株、IBRV-J1株、BPIV3-S株病毒滅活抗原按比例混合，使得每劑量疫苗中，滅活前每毫升三種抗原含量BVDV-L株不低于10^7.5TCID₅₀，IBRV-J1株、BPIV3-S株不低于10^8.33TCID₅₀。將抗原緩緩注入206佐劑中，保持30℃，按抗原：佐劑體積比1:1進(jìn)行混合乳化，配制成三聯(lián)滅活疫苗。

實施例2

——牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗(L株+J1株+S株)的成品檢驗

1.無菌檢驗：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。上述檢驗結(jié)果見表2。

表2物理性狀、無菌檢驗結(jié)果

2.安全檢驗：

(1)替代動物檢驗：用1.5～2.0kg的健康家兔6只，其中免疫組4只，對照組2只，免疫組家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml(兩點注射，0.5ml/點)，對照組家兔各腿部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物1.0ml(兩點注射，0.5ml/點)，連續(xù)觀察7天并每天下午定點測量體溫，均健活，免疫組腿部注射部位觸摸無異樣，無流鼻液、打噴嚏等癥狀，精神、采食正常，體溫均低不高于40.0℃。選用350～400g健康雌性豚鼠6只，其中免疫組4只，對照組2只，免疫組豚鼠各頸部皮下注射疫苗0.5ml(兩點注射，0.25ml/點)，對照組豚鼠各頸部皮下注射細(xì)胞培養(yǎng)物0.5ml(兩點注射，0.25ml/點)，連續(xù)觀察7天，均健活，免疫組頸部皮下觸摸無硬塊，無流鼻液、打噴嚏等癥狀，精神、采食正常。

(2)本體動物檢驗：用6月齡以上BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感牛4頭，其中免疫組2頭，對照組2頭，免疫組牛各頸部肌肉注射疫苗4.0ml，對照組牛各頸部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物4.0ml；選用2月齡BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感犢牛4頭，其中免疫組2頭，對照組2頭，免疫組犢牛各頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，對照組犢牛各頸部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物4.0ml。連續(xù)觀察14天，均健活，頸部肌肉注射部位觸摸無異樣，無流鼻液、流眼淚、打噴嚏等癥狀，精神、采食正常，體溫均不高于40.0℃。安全檢驗結(jié)果及體溫變化見表3、圖1～3。

表3安全檢驗結(jié)果

3.效力檢驗

(1)中和抗體檢測法試驗選用350～400g健康雌性豚鼠8只(BVDV、IBRV、BPIV3血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)，其中免疫組5只，對照組3只，免疫組豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0ml(兩點注射，0.5ml/點)，對照組豚鼠各腿部肌肉注射細(xì)胞培養(yǎng)物1.0ml(兩點注射，0.5ml/點)，21天后同樣方式加強(qiáng)免疫，二免后21天心臟采血測定中和抗體水平，4只豚鼠的BVDV、BPIV3中和抗體效價＞64、5只豚鼠的IBRV中和抗體效價＞64，具體結(jié)果見表4。

(2)牛體免疫攻毒法試驗選用2～3月齡BVDV、IBRV、BPIV3抗原、抗體雙陰性(抗體陰性即血清中和抗體效價≤1:4或ELISA檢測抗體陰性)的健康易感牛30頭，其中免疫組15頭，攻毒對照組15頭，免疫組牛各頸部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同樣方式加強(qiáng)免疫，二免后21天將免疫牛隨機(jī)分為BVDV、IBRV及BPIV3組，每組5頭，各組單獨飼養(yǎng)。BVDV組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行BVDV強(qiáng)毒攻毒，每頭牛左右鼻孔、口腔、頸部兩側(cè)肌肉各注射2.0ml BVDV強(qiáng)毒株；IBRV組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行IBRV強(qiáng)毒攻毒，每頭牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml IBRV強(qiáng)毒株；BPIV3組連同攻毒對照牛5頭，共計10頭牛進(jìn)行BPIV3強(qiáng)毒攻毒，每頭牛上、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml BPIV3強(qiáng)毒株。攻毒后連續(xù)觀察14天，每天上午定點測量體溫，觀察臨床癥狀并采集鼻拭子進(jìn)行病原檢測與病毒分離。具體結(jié)果見表5～7。

表4效力(豚鼠)檢測結(jié)果

表5BVDV效力(牛)檢測結(jié)果

注：符合體溫升高、流鼻液、鼻拭子帶毒中的兩項即判為發(fā)病。

表6IBRV效力(牛)檢測結(jié)果

注：符合體溫升高、流鼻液、鼻拭子帶毒中的兩項即判為發(fā)病。

表7BPIV3效力(牛)檢測結(jié)果

注：符合體溫升高、流鼻液、鼻拭子帶毒中的兩項即判為發(fā)病。

結(jié)果表明，使用BVDV、IBRV、BPIV3三聯(lián)滅活疫苗免疫牛后，能夠有效抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，對BVDV、IBRV、BPIV3強(qiáng)毒株的保護(hù)率分別為80％、100％、80％。

序 列 表

<110> 齊魯動物保健品有限公司

<120> 牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增BVDV 5’-UTR的引物BVDV-P1

<400> 1

AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT 20（序列1）

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增BVDV 5’-UTR的引物BVDV-P2

<400> 2

TCTGCAGCAC CCTATCAGG 19 （序列2）

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增IBRV gB基因的特異性引物gB-P1

<400> 3

TACGACTCGT TCGCGCTCTC-3’20 （序列3）

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增IBRVgB基因的特異性引物gB-P2

<400> 4

GGTACGTCTC CAAGCTGCCC-3’ 20 （序列4）

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增IBRV gE基因的特異性引物gE-P1

<400> 5

GCTTCGGTCG ACACGGTCTT-3’ 20（序列5）

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增IBRV gE基因的特異性引物gE-P2

<400> 6

CTTTGTCGCC CGTTGAGTCG-3’ 20（序列6）

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增704bp的BPIV3特異性片段的引物BPIV3-P1

<400> 7

GAGAAAGACC CAGGAAGACA GA 22（序列7）

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增704bp的BPIV3特異性片段的引物BPIV3-P2

<400> 8

ACACCCATCG CATAACTCCA GA 22（序列8）

1