專利名稱：牛傳染性鼻氣管炎病毒重組毒株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種^aftft， ；W^及一種^f專染性鼻氣管，毒^a,， i^^a^a餅勾
~法。本發(fā)明還涉及^^且 *{乍為判專染性鼻氣管^^^^ 、 itft訊翁iJ^作為病毒載體用于
外源基因表達(dá)的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)，又稱牛皰疹病毒1型(化W77e力eipesWiT/s t，e 7)，可引起的牛的以上呼吸道炎癥為特征的急性接觸性傳染病。在臨床上表現(xiàn)多種病 型，如上呼吸道黏膜炎癥、膿皰性外陰陰道炎、龜頭炎、結(jié)膜炎、幼牛腦膜腦炎、乳 房炎、流產(chǎn)等。IBRV在牛多種細(xì)胞如鼻甲、氣管、腎、睪丸、肺、皮膚細(xì)胞和兔、豬、 狗、綿羊、山羊、馬和人二倍體腎細(xì)胞(WI-38)培養(yǎng)物中生長(zhǎng)良好，并產(chǎn)生細(xì)胞病變， 感染細(xì)胞有核內(nèi)包涵體。病毒核酸為線性雙股麗A，基因組全長(zhǎng)為135 301nt， G + C 含量為72%，編碼區(qū)占84%。病毒編碼30 40種結(jié)構(gòu)蛋白，其中有l(wèi)l種為糖蛋白。 IBRV gE基因全長(zhǎng)為1728bp，編碼575個(gè)氨基酸殘基，為病毒復(fù)制的非必需基因。 由牛傳染性鼻氣管炎病毒感染引起的牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是引發(fā)養(yǎng)牛業(yè)重大
經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。本病最初在歐洲發(fā)生，1930年以前隨著牛的輸出而傳到美國(guó)，
曾作為牛生殖器官感染癥而蔓延，1955年Miller在美國(guó)首次報(bào)道，1956年Madin等
分離到病毒，1964年Huck確認(rèn)了本病毒屬于皰疹病毒。本病呈世界性分布，主要經(jīng)
濟(jì)損失在于延緩育肥牛的生長(zhǎng)和增重及奶牛產(chǎn)奶量下降和流產(chǎn)等，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害極大。
由IBRV引發(fā)的呼吸道疾病在美國(guó)每年可造成5億美元的經(jīng)濟(jì)損失，在北美則高達(dá)10
億美元。我國(guó)于1980年從新西蘭進(jìn)口牛中發(fā)現(xiàn)本病，隨后在國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的農(nóng)牧場(chǎng)及
奶牛場(chǎng)發(fā)現(xiàn)均有不同程度的感染和發(fā)病。國(guó)內(nèi)陳永澗(1982)、崔言順(1999)、楊春
明(2003)、肖定漢(2004)、朱遠(yuǎn)茂等(2005)等對(duì)我國(guó)部分地區(qū)牛只進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)査，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)牛只的IBR抗體陽(yáng)性率從O. 12%到66. 7%不等。而肖定漢等(2005)對(duì) 14個(gè)牛場(chǎng)在1991-1995和1996-1999年間進(jìn)行的調(diào)查表明，IBR血清抗體陽(yáng)性率從 8.03%(114頭)升高到65.4%(557頭)。近年在進(jìn)口牛只檢疫中，廣東出入境檢疫局羅 瓊等(2005)檢測(cè)了 5000多只澳大利亞進(jìn)口種牛，其中1505頭血清樣品呈現(xiàn)IBR抗 體陽(yáng)性，并有兩頭分離到病毒。由此可知，國(guó)內(nèi)無(wú)IBRV感染的牛場(chǎng)受內(nèi)(國(guó)內(nèi)部分地 區(qū)感染牛)和外來(lái)(攜帶病毒的進(jìn)口牛只)的雙重壓力，該病的防治形勢(shì)不容樂(lè)觀。 在IBR陽(yáng)性率不斷升高的情況下，使用IBR疫苗來(lái)防控本病的重要性已日漸突出。
Madin等于1956年首次分離出IBRV后，同年就報(bào)道了第一個(gè)減毒活疫苗，充分 體現(xiàn)了用疫苗防控IBR的重要性，至今已開(kāi)發(fā)出了多種常規(guī)的活苗和滅活苗。但這些 常規(guī)疫苗都存在致潛伏感染、散播病毒、無(wú)法區(qū)別野生毒與疫苗毒等缺點(diǎn)，已逐步被 安全性更好的基因缺失標(biāo)記疫苗所替帶。盡管現(xiàn)有疫苗的免疫效果令人不太滿意，但 一般說(shuō)來(lái)，疫苗可阻止臨床癥狀的出現(xiàn)和減少感染后病毒的排出。使用傳統(tǒng)的弱毒疫 苗或滅活疫苗的缺點(diǎn)是不能區(qū)別疫苗接種和自然感染所誘生的抗體，這樣會(huì)干擾以血 清學(xué)檢測(cè)來(lái)消滅本病的防制措施的實(shí)施。而利用缺乏特定糖蛋白的基因缺失和亞單位 疫苗，則可以解決這一問(wèn)題。歐洲已于1995年開(kāi)發(fā)出了 gE基因缺失疫苗，利用 gE-ELISA可區(qū)分自然感染和疫苗免疫牛。
牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)TK基因缺失苗于1984年首先在美國(guó)報(bào)道(Kit等， 1990)，采用鼻內(nèi)、肌肉及靜脈內(nèi)試用接種均無(wú)致病性，其唯一的缺點(diǎn)是疫苗病毒仍具 有潛伏感染性。1994年澳大利亞學(xué)者Smith構(gòu)建了一株BHV-1的TK基因缺失苗，肌 肉接種和靜脈接種后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫原性，且無(wú)明顯的副作用。同年荷蘭 學(xué)者van Engelenburg等構(gòu)建了 IBRV gE單基因和gE、 TK雙基因缺失毒株，首次證實(shí) 了gE單基因缺失就可在很大程度上降低IBRV的毒力，且病毒增殖滴度未見(jiàn)下降，但 gE和TK雙基因缺失毒株增殖滴度有一定下降。其中IBRV gE基因缺失毒株成了歐洲 后來(lái)生產(chǎn)并應(yīng)用的IBRV gE基因缺失疫苗，也就是說(shuō)歐洲主要是使用IBRV gE基因缺 失疫苗。此后，美國(guó)的Belknap等(1999)構(gòu)建了 gE、 gG和US2三基因缺失毒株， 免疫與攻毒試驗(yàn)表明該毒株可使?fàn)倥．a(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。目前已有多種IBRV單基
因、雙基因乃至三基因缺失疫苗的問(wèn)世，如美國(guó)己普遍使用IBRV TK基因缺失疫苗， 荷蘭于1998年5月在全國(guó)范圍內(nèi)啟動(dòng)撲滅計(jì)劃，推廣使用IBRVgE基因缺失疫苗。此 外，歐洲的比利時(shí)也使用了 IBRVgE基因缺失疫苗，啟動(dòng)了 IBR撲滅計(jì)劃(Ackerma皿 等，2006)。牛傳染性鼻氣管炎病毒的第一代基因缺失疫苗是TK基因缺失疫苗，而第 二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力較TK基因缺失疫苗又得到進(jìn)一步 降低，同時(shí)可以建立相應(yīng)的血清學(xué)鑒別診斷方法。目前，IBRV gE基因缺失疫苗在歐 洲己獲得廣泛應(yīng)用(貓Dr匿n Little-羅den Hurk，2006)。
我國(guó)于1980年發(fā)現(xiàn)IBR后，中國(guó)獸藥監(jiān)察所周泰沖等(1981)研制了IBR弱毒
凍干疫苗，所用種毒為IBRVBartha-Nu/67，是由中國(guó)獸藥監(jiān)察所于1978年從匈牙利
引進(jìn)的IBRV弱毒。該種毒是目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行IBR病毒中和試驗(yàn)所用的病毒，是國(guó)內(nèi)進(jìn)行
IBR研究的一個(gè)參考毒株。用IBRVBartha-Nu/67制備的弱毒疫苗接種黑白花小乳牛2
周后，中和抗體滴度可達(dá)1:8以上，符合匈牙利IBR弱毒疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。中國(guó)農(nóng)
業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所李崇華等(1988)禾lj用從四川牦牛體內(nèi)分離的IBR85-Y毒株
制備了 IBR油乳劑滅活苗，免疫牦牛后用ELISA可測(cè)到較高水平的抗體。但這些疫苗
都未投入使用。這些都是國(guó)內(nèi)早期IBR傳統(tǒng)疫苗的研究。
在借鑒國(guó)外研究的基礎(chǔ)上，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所張桂紅等(1998)
構(gòu)建了 IBRV TK基因缺失毒株，在TK基因缺失部位插入了 LacZ表達(dá)盒，用PCR可鑒
別TK基因缺失毒株與野生型毒株。牛傳染性鼻氣管炎病毒的TK基因缺失疫苗是第一
代基因缺失疫苗，而第二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力較TK基因
缺失疫苗又得到進(jìn)一步降低，同時(shí)可以建立相應(yīng)的血清學(xué)鑒別診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種牛傳染性鼻氣管 ，毒(IBRV)重i且轉(zhuǎn)移載體，該重組轉(zhuǎn)移載體將gE基因的大部分序列缺失。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 ——禾中4^[專染性鼻氣管ife^毒(// /ectj'ows /wT/7'"e r/ i/ ot_rac/ ej't/s k"tas ， IBRV) H且轉(zhuǎn)移載體，包括啟動(dòng)子、牛傳染性鼻氣管^ 因、終止子等，該重組轉(zhuǎn)移載體中g(shù)E 基因包括起始密碼子ATG在內(nèi)的1134bp被缺失，在缺失了 gE基因的位置插入有LacZ 表達(dá)盒。
本發(fā)明所要解決的另 一 個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供 一 種構(gòu)建上述牛傳染性鼻氣管炎病毒 (IBRV) ^S轉(zhuǎn)移載體的方法。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種構(gòu)建上述牛傳染性鼻氣管，毒(IBRV) ^a轉(zhuǎn)移載體的方法，包括
(1) 按照常規(guī)方法提取IBRV基因組DNA;
(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照 常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到上游同源重組臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引 物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源重組臂；
(3) 將所擴(kuò)增的上、下游同源重組臂分別克隆于T Easy載體后測(cè)序；利用限 制性內(nèi)切酶AsuII與NsiI酶切正向插入的上游同源重組臂質(zhì)粒，回收質(zhì)粒部分；同時(shí) 用HindIII與Nsil酶切正向插入的下游同源重組臂質(zhì)粒，回收相應(yīng)的下游同源重組臂 片段；先用回收的質(zhì)粒和片段進(jìn)行連接，再用Klenow大片段酶補(bǔ)平，用TJ)NA連接酶 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選出gE基因缺失1134bp的轉(zhuǎn)移載體；
(4) 將LacZ表達(dá)盒插入轉(zhuǎn)移載體上游同源重組臂的下游，將下游同源重組臂定 向插入LacZ表達(dá)盒的下游，即得。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種牛傳染性鼻氣管，毒(IBRV) ^a毒株。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種牛傳染性鼻氣管彌毒(IBRV)軍組毒株(IBRV46)，該^S毒株中牛傳染性鼻氣管炎 病毒的gE基因包括起始密碼子ATG在內(nèi)的1134bp被缺失。
將本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管ife^毒(IBRV) ^a轉(zhuǎn)移載體與IBRV基因組共轉(zhuǎn)染后， 篩選，即得。
本發(fā)明牛傳染性鼻氣管ife^毒(IBRV) ^a^a勺微生物保藏號(hào)是CGMCC NO. 2102; 分類(lèi)命名是7/Lfec"ows Zw&e 2^/7"潔力ei"s w'r蹄保藏時(shí)間是2007年7
月6日；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北
京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
本發(fā)明判專染性鼻氣管ife^毒(IBRV)塾且 *主要具有以下幾方面的鵬前景
1、 制備預(yù)防和治療傳染性鼻氣管ife^毒的;Sffi。
2、 可制備成診斷試劑，按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法或血清學(xué)方法，將gE基因缺 失毒株的感染與野毒株的感染加以區(qū)別開(kāi)來(lái)。這對(duì)流行病學(xué)的調(diào)査和傳染性鼻氣管ife^ 毒,方和治療極為觀。
3、 可以進(jìn)一步將其進(jìn)行改構(gòu)或缺失，例如，可將TK (胸苷激酶)及其它病毒非 必需基因缺失，得到突變毒株并進(jìn)一步制備成疫苗等。
5、將其作為外源基因的表達(dá)載體。
總之，本發(fā)明牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因缺失毒株(IBRV46)的成功構(gòu)建，為 IBRV gE基因缺失疫苗及鑒別診斷試劑、IBRV多基因缺失毒株構(gòu)建及疫苗與IBRV表達(dá) 外源基因重組病毒構(gòu)建等的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的 目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明利用我國(guó)從匈牙利引進(jìn)的IBRV Bartha-Nu/67弱毒株構(gòu)建了 IBRV gE基因 缺失毒株IBRV46，該毒株的gE基因編碼核苷酸包括起始密碼子ATG在內(nèi)的1134bp已 被成功缺失(gE基因全長(zhǎng)為1728bp) 。 IBRV gE基因缺失毒株IBRV46的構(gòu)建過(guò)程如下
1. IBRV基因組DNA模板的制備
參照Pignatti等報(bào)道的方法抽提IBRV基因組DNA，并略做改進(jìn)。用IBRV Bartha-Nu/67接種牛胎鼻甲細(xì)胞單層，待細(xì)胞出現(xiàn)80%病變后，用預(yù)冷的0. 01MpH7. 4 PBS洗兩遍細(xì)胞單層，刮取細(xì)胞后低速離心，將細(xì)胞懸浮于PBS中，置一7(TC保存?zhèn)?用。取上述懸浮細(xì)胞液lml，加入9倍DNA提取液(10mM Tris-HCl pH8. 0， 10mM EDTA pH8. 0， 0. 5% Triton X- 100)，于室溫作用20min后加入2M NaCl使終濃度至0. 2M， 4°C 3400r/min離心10min。取上清液加RNase A至100 u g/ml， Proteinase K至100 ug/ml， SDS至O. 5%， 37。C水浴30min。等量酚、酚/氯仿各抽提一次，兩倍無(wú)水乙 醇于4。C放置20min， 4°C 12000r/min離心15min。 70%乙醇洗2次，然后溶解于50 ul TE (pH8.0)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定病毒DNA含量。
2. gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
參照已發(fā)表的IBRV全基因組序列(Benebank登錄號(hào)為NC 001847)，分別設(shè)計(jì)兩 對(duì)引物，用于擴(kuò)增構(gòu)建gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體的上下游同源重組臂。擴(kuò)增上游同源重組 臂的引物為
gIF 5， -GCG CGT CGG CGA CTC AAG CCA T-3' 120234 120255 (SEQ ID N0:1); gIR 5， -GAC CGT GTC GAC CGA AGC CGA g-3， 121842 121821(SEQ ID N0:2)，擴(kuò)增片段為1609bp。
擴(kuò)增下游同源重組臂的引物為gESmalF 5' - CCC CCG GGC TTT ACG TCT TTG TGC T-3' (SEQIDN0:3)， gENsiR 5， -CCA TGC ATG GGC CGG GGC ACT
ACC T-3' (SEQIDN0:4)， 擴(kuò)增片段為1609bp。 PCR反應(yīng)條件93。C預(yù)變性3min; 95°C 45s， 65°C 45s， 72°C 3min， 30個(gè)循環(huán)后，72。C延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳， 用膠回收試劑盒回收目的片段，克隆于T Easy Vector后測(cè)序。利用限制性內(nèi)切酶AsuII 與Nsil酶切正向插入的上游同源重組臂質(zhì)粒，回收質(zhì)粒部分；同時(shí)用HindIII與Nsil 酶切正向插入的下游同源重組臂質(zhì)粒，回收相應(yīng)的下游同源重組臂片段。然后先用回 收的質(zhì)粒和片段進(jìn)行連接，再用Kl冊(cè)now大片段酶補(bǔ)平，用T4DNA連接酶連接，將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選出gE基因缺失的轉(zhuǎn)移載體，缺失1134bp。
同時(shí)構(gòu)建在gE基因缺失部分插入LacZ表達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體。構(gòu)建LacZ 表達(dá)盒所用的引物為L(zhǎng)dgEF: 5， -TTT TCg AAT gCT TCg CgA TgT ACg ggC CAg-3， ， LdgER: 5， - ATT CCC ggg gCA TCC CCA gCA TgC CTg CTA T -3，。利用pcDNA3. 1(+)作為模板，用上述引物擴(kuò)增帶有完整CMV啟動(dòng)子和poly A的 片段，將其克隆入T easy Vector后用HindIII與XbaI雙酶切，回收質(zhì)粒部分。同時(shí) 用HindIII與Xbal雙酶切pcDNA3. 1HisLacZ質(zhì)粒，回收LacZ片段，將其定向插入帶 有完整CMV啟動(dòng)子和BGA poly A片段的質(zhì)粒中，獲得LacZ表達(dá)盒。先利用AsuII與 Nsil位點(diǎn)將LacZ表達(dá)盒插入gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體上游同源重組臂的下游，然后利用 Smal與Nsil位點(diǎn)將下游同源重組臂定向插入LacZ表達(dá)盒的下游，即獲得了帶有LacZ 表達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體。
3.轉(zhuǎn)染用IBRV基因組DNA的制備
參照Morgan等(1990)報(bào)道的方法制備IBRV基因組DNA。用IBRV Bartha-Nu/67 接種牛胎鼻甲細(xì)胞單層，待細(xì)胞出現(xiàn)80%病變后，用預(yù)冷的0. 01M pH7. 4 PBS洗兩遍 細(xì)胞單層，加入細(xì)胞裂解液(lOraMTris-HC1 pH8. 0， ImM EDTA pH8. 0， lOOmMNaCl， SDS 至O. 5%， Proteinase K至200iig/ml) 4ml (100cm2玻璃培養(yǎng)瓶)作用20min。然后將 細(xì)胞裂解物加入10ml離心管中，在37。C下孵育3h。用等酚抽提l次，用等量酚/異戊 醇(24:1)抽提2次，加兩倍無(wú)水乙醇于-2(TC保存?zhèn)溆?。用于轉(zhuǎn)染時(shí)，在16。C以12 000g 離心15min，用75%乙醇洗2次，每次離心5分鐘。將上:清液倒掉，干燥15min，用 適量去離子水懸浮，于37。C下孵育lh，即可用于轉(zhuǎn)染。
4. IBRV基因組的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染
核酸一磷酸鈣沉淀的制備取2只1.5ml離心管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A 管中分別加入2MCaCl2、 IBRV基因組DNA、線性化的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，最后加去離子水 至300ul，其中CaCL終濃度為140函，IBRV基因組DNA含量為5u g，線性化的轉(zhuǎn)移 載體質(zhì)粒DNA含量為g。 B管加2XHBSP (1. 5mM Na2HP04， 10raMKCl， 280mMNaCl， 12mMGlucose， 50mM H印es， pH7. 05) 300ul。 A管各成份充分混勻后，將B管溶液緩 慢逐滴加入A管(約l一2分)，用吸管吹打6次后，在室溫下孵育30分鐘。用MEM 沖洗牛鼻甲細(xì)胞單層(60mm培養(yǎng)平皿)2次，將上述制備的核酸一磷酸鈣沉淀加到細(xì) 胞單層上吸附2h。然后加入5X胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，過(guò)夜。次日用0.01M、 pH7. 4 PBS洗培養(yǎng)平皿1次，加25%DMS0 (用1XHBSP配制)，作用4min。將DMSO吸出，用 MEM洗2次，加入含2。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待觀察到細(xì)胞病變后收取 培養(yǎng)皿，經(jīng)3次凍融后于-2(TC結(jié)凍保存。
5. IBRV gE基因缺失重組病毒的篩選與鑒定 重組病毒的篩選策略是先用帶有LacZ表達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與
IBRV基因組共轉(zhuǎn)染后，利用加X(jué)-gal底物的方法進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，首先篩選出表達(dá) LacZ基因的IBRV gE基因缺失重組病毒，即藍(lán)斑病毒。然后制備表達(dá)LacZ基因的IBRV gE基因缺失重組病毒基因組DNA，與不帶有LacZ表達(dá)盒的gE基因缺失轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染，篩選出不帶LacZ表達(dá)盒的gE基因缺失重組病毒，即白斑病毒。篩選方法如 下
用0. 2陶針式濾器將有病變的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液濾過(guò)，按1:10作倍比稀釋，接種 MDBK細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板，于37'C吸附lh，然后將病毒液吸出，每孔加0.5ml的lX 甲基纖維素。待出現(xiàn)病變后，將甲基纖維素吸出，用MEM液洗3次，然后每孔加1% 瓊脂糖(含X-gal的濃度為15(mg/ml)，在室溫下待凝固后繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)病毒蝕斑 的顏色來(lái)篩選重組病毒。用上述方法篩選到了一株gE基因缺失重組病毒，命名為IBRV
46。
用PCR對(duì)重組病毒進(jìn)行了鑒定，上游引物為5' —CgC gTg TgT CTT ggT TTC Tg - 3，，下游引物為5， 一Tgg TCg gCA AgC Tgg TgT AT - 3，，從IBRV gE基因未缺失 毒株DNA中可擴(kuò)增出長(zhǎng)為1668bp片段，從gE基因缺失的IBRV46毒株中可擴(kuò)增出約 500bp的片段，說(shuō)明gE基因已被成功缺失。用Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度，IBRV46 的TC瓜。為1077ml， gE基因未缺失弱毒株的TC瓜。為1077ml，病毒滴度未見(jiàn)下降， 符合制備疫苗的要求。
序列表
SE,NCE LISTING
<iio〉中閨農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸K研究所
<i20〉屮傳染性鼻氣管炎病毒:雖組毒株、it構(gòu)^方法及Kv:ffl
<i30> P0886 <160〉 4
<170> Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 Artificial
"00> 1
gcgcgtcggc g ictC33gcc a 21
<210〉 2
<211〉 22
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權(quán)利要求
1、一種牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus)重組轉(zhuǎn)移載體，包括啟動(dòng)子、牛傳染性鼻氣管炎病毒基因、終止子等，其特征在于所述牛傳染性鼻氣管炎病毒基因中g(shù)E基因包括起始密碼子ATG在內(nèi)的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表達(dá)盒。
2、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述^1^&#^管|^ 1&轉(zhuǎn)移載體的方法，包括-(1) 按照常規(guī)方法提取IBRV基因組DNA;(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，以IBRV基因組麗A為摸板，按照 常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到上游同源重組臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引 物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源重組臂；(3) 將所擴(kuò)增的上、下游同源重組臂分別克隆于T Easy載體后測(cè)序；利用限制 性內(nèi)切酶AsuII與NsiI酶切正向插入的上游同源重組臂質(zhì)粒，回收質(zhì)粒部分；同時(shí)用 HindIII與Nsil酶切正向插入的下游同源重組臂質(zhì)粒，回收相應(yīng)的下游同源重組臂片 段；先用回收的質(zhì)粒和片段進(jìn)行連接，再用大片段酶補(bǔ)平，用T.，DNA連接酶連接，將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選出gE基因缺失U34bp的轉(zhuǎn)移載體；(4) 將UcZ表達(dá)盒插入轉(zhuǎn)移載體上游同源重組臂的下游，將下游同源重組臂定 向插入LacZ表達(dá)盒的下游，即得。
3、 一種4^^l4鼻氣管i^^ (J/ f"ecti'o脂6ow'iie rAi加加d eitfs k/jt"s) IBRV46,^Effi^:該SS^t中4^l4^氣管J^^JgE基因包括起始密碼子ATG 在內(nèi)的1134bp被缺失。
4、 按照權(quán)承展求3的特嫩鼻氣管魏毒(Ji fec"ous Zwi/ e rM加f潔力eif j.s ra> s) ML毒株IBRV46,其微生物保藏號(hào)是CGMCC節(jié).2102。
5、 權(quán)利要求3或4的4^^ft鼻氣管^tlffi,IBRV46在制備預(yù)防、治療或診 斷4K微主鼻氣管^i^M中的鵬
6、 一種預(yù)防或治療的4^專#1*鼻氣管炎6^魚(yú)11組，，含有fe^麼求3或4^jl]Mm專染 性鼻氣管!8i^^a,IBI V46和藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
7、 權(quán)承BStlfiW^ft鼻氣管l^figl轉(zhuǎn)移載體作為外源基因的表達(dá)載體的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求3或4的牛"f與^r主鼻氣管^^Wl毒株IBRV46作為外源基因的表達(dá)載 體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)重組轉(zhuǎn)移載體，其構(gòu)建方法。本發(fā)明還公開(kāi)了用該重組轉(zhuǎn)移載體與IBRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染后所得到的重組毒株IBRV46。本發(fā)明重組轉(zhuǎn)移載體中g(shù)E基因包括起始密碼子ATG在內(nèi)的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表達(dá)盒。本發(fā)明重組毒株可用于制備預(yù)防和治療傳染性鼻氣管炎病毒的疫苗。也可制備成診斷試劑，按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法或血清學(xué)方法，將gE基因缺失毒株的感染與野毒株的感染加以區(qū)分。此外，還可以進(jìn)一步將其進(jìn)行改構(gòu)或?qū)⑵浞潜匦杌蛉笔?，得到突變毒株并進(jìn)一步制備成疫苗等。
文檔編號(hào)G01N33/571GK101353670SQ20071012986
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)茂, 王延輝, 童光志, 飛 薛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所