專利名稱：一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
牛傳染性鼻氣管炎infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR)是由牛傳染性 鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus, IBRV)引起牛發(fā)生的一種急 性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎、竇炎和上呼吸道炎癥為特征。還可引起 母牛生殖系統(tǒng)損害、出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎，以及發(fā)生腸炎和小牛腦炎，有時發(fā)生眼結(jié)膜炎和角膜 炎，對奶牛的產(chǎn)奶量、公牛的繁殖力及使役牛的使役力均有較大的影響，而且急性的IBR呼 吸道感染可繼發(fā)牛致命性細菌性肺炎，是造成養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因之一。近年來隨著奶牛數(shù)量的迅速增長，牛群中流產(chǎn)病例增多，而且有些病例布魯氏菌 病檢查為陰性，有的還出現(xiàn)生殖器皰疹。這些癥狀提示牛群中存在IBR，牛群中假如存在 IBR的潛伏感染，則很難將其根除，將對養(yǎng)牛業(yè)造成極大的危害。一旦感染IBRV，病毒可潛 伏于三叉神經(jīng)節(jié)或薦神經(jīng)節(jié)造成潛伏感染或散毒，病?？山K身帶毒，給本病的防治帶來很 大的困難。由于畜牧業(yè)的集約化發(fā)展和人們生活水平的提高，我國養(yǎng)牛業(yè)的規(guī)模不斷擴大， 牛的數(shù)量也迅猛增加，但由于某些重大傳染病不能根治，如牛呼吸道病毒群，包括牛皰疹病 毒-I型(BHV-I)、牛副流感病毒(BPIV3)、牛呼吸道綜合癥病毒(BRSV)和牛病毒性腹瀉病 毒(BVDV)等，其流行和危害有增無減，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。另外，世界貿(mào)易組織 對進出口的牛及其制品具有嚴格地檢疫政策，以控制牛病的發(fā)生和流行。我國的動植物檢 疫法中也明確規(guī)定，凡進出口的牛及制品必須進行IBRV的檢測。因此，盡快啟動牛的重大 疾病的根除和控制計劃勢在必行，用疫苗免疫接種是預(yù)防和控制的重要措施。美國及歐洲很多國家通過疫苗免疫接種，對牛傳染性鼻氣管炎的流行起到很好的 控制作用，但也存在免疫效果差、抗體陽性率低及活疫苗散毒等問題。我國在這方面的研究 比較落后，未見疫苗研制成功報告。本發(fā)明通過無菌采集IBR流產(chǎn)胎牛的肝、脾、心、腎、胎 盤、肺病料，接種犢牛睪丸細胞進行病毒分離，并且對所分離病毒進行血清學(xué)、分子生物學(xué) 以及理化特性鑒定，確定為牛傳染性鼻氣管炎病毒，并將其制成油乳劑滅活疫苗，臨床試驗 結(jié)果證明，2頭份劑量即可使免疫?？贵w陽性率達到100%，具有良好的免疫效果，且滅活 疫苗不存在散毒的危險，可以用來預(yù)防控制牛傳染性鼻氣管炎地方性流行，具有重要的應(yīng) 用價值，填補了我國該方面研究的空白。同時，本發(fā)明也為牛傳染性鼻氣管炎基因工程疫苗 的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗及其制備方法，用于解決牛傳染 性鼻氣管炎地區(qū)性流行的疫苗預(yù)防控制問題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗，其特征在于所述病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒， Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，簡稱IBRV，系從牛傳染性鼻氣管炎流行地區(qū) 分離鑒定。上述牛傳染性鼻氣管炎疫苗，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒對乙醚、氯仿和胰蛋白 酶敏感；不耐酸堿，用0. lmol/L NaOH和0. lmol/L HCl溶液將病毒液分別調(diào)到pH3，pH9和 pHll，37°C作用lh，即可將病毒滅活；可被IBRV陽性血清中和，中和抗體滴度為2_7 9 ；TCID50 值為 1(Γ6.65/100 μ 1，1(Γ3.35/20 μ 1。上述牛傳染性鼻氣管炎疫苗，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒可以用IBRV特異性引 物經(jīng)PCR擴增出339bp的gB基因的高保守區(qū)序列，所述的IBRV特異性引物序列為PBl 5' -GGC TCT ACC GCA CGG GCA CCT CT-3'；PB2 5' -GCG GCT CTC GTC TCG CAG CAT TT-3'。一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，制備方法包含如下步驟a.病毒分離無菌采集IBR流產(chǎn)胎牛的肝、脾、心、腎、胎盤、肺，剪碎、研磨，隨后加 入5倍量Hanks (內(nèi)含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，制成乳劑后移入IOml離心管 中，反復(fù)凍融三次。以3000r/min離心lOmin，取上清液過濾除菌。用Hanks液稀釋10倍、 100倍、1000倍，分別接種長成致密單層且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代細胞，連續(xù)傳代35-50 代分離得到。b.病毒鑒定用特異性的抗IBRV標準陽性血清與分離病毒進行中和試驗，IBRV標 準陽性血清對分離株的中和抗體滴度為2_81 ；提取分離病毒DNA模板，用IBRV特異性引物 經(jīng)PCR擴增出339bp的gB基因的高保守區(qū)序列，證實分離的病毒為IBRV。c.病毒繁殖將毒種接種長成致密單層且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代細胞，適時收 獲，測定效價，效價達到106_5TCID5cZO. Iml的毒液用于制苗。d.滅活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使終濃度達到2%。，滅活12小時，按4%加 入吐溫-80，與含有硬脂酸鋁、6%司班-80熬制而成的白油按體積比1 2混合，經(jīng)高 速剪切乳化機10000轉(zhuǎn)/分鐘乳化15分鐘制成油乳劑滅活疫苗。上述牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，適用于所有牛傳染性鼻氣管炎分離毒株的 疫苗制備。上述牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，在疫苗制備過程中可加入任意免疫增強 佐劑。本發(fā)明從牛傳染性鼻氣管炎流產(chǎn)胎牛采集病料，接種犢牛睪丸原代細胞連續(xù)傳代 分離病毒，鑒定證明分離病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒，并將其制備成油乳劑滅活疫苗，可 用于地區(qū)性牛傳染性鼻氣管炎的預(yù)防控制。
具體實施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例做進一步的說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于 限制本發(fā)明范圍。實施例1牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法1.病毒分離無菌采集IBR流產(chǎn)胎牛的肝、脾、心、腎、胎盤、肺，用滅菌的Hanks液 漂洗數(shù)次后剪碎、研磨。隨后加入5倍量Hanks (內(nèi)含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，制成乳劑后移入IOml離心管中，反復(fù)凍融三次。以3000r/min離心lOmin，取上清液 過濾除菌。用Hanks液稀釋10倍、100倍、1000倍，置-20°C保存?zhèn)溆?。挑選長成致密單層 且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代細胞，棄營養(yǎng)液，用Hanks液輕洗細胞3次，分別按原液、10倍、 100倍、1000倍四個梯度加入處理好的病料上清液，加入量為細胞培養(yǎng)液的1/10，37°C吸附 Ih,加入維持液，37°C繼續(xù)培養(yǎng)并逐日觀察并記錄細胞病變(CPE)，培養(yǎng)7 后收毒，反復(fù)凍 融3次后繼續(xù)傳代，一直傳代到出現(xiàn)細胞病變，此時當(dāng)細胞出現(xiàn)75%的細胞病變時收毒，反 復(fù)凍融3次后繼續(xù)傳代，連續(xù)傳代至第50代。病料懸液接種犢牛睪丸細胞后盲傳至第7代時，接種后的細胞變圓、變暗，中心部 位細胞脫落，形成典型的IBRV細胞病變。繼續(xù)傳代，細胞病變規(guī)律，出現(xiàn)細胞病變時間變 短，24h即出現(xiàn)病變，4 細胞病變最明顯，7 細胞完全脫落，最終將病毒傳代至第50代。 測定各代次病毒TCID5tl，35-50代次病毒TCID5tl基本趨于一致，效價為106 5TCID5(1/0. 1ml，作 為生產(chǎn)用毒種。2.病毒鑒定用特異性的抗IBRV標準陽性血清與分離病毒進行中和試驗，IBRV標 準陽性血清對分離株的中和抗體滴度為2_81 ；提取分離病毒DNA模板，用IBRV特異性引物 經(jīng)PCR擴增出339bp的gB基因的高保守區(qū)序列，證實分離的病毒為IBRV。3.病毒繁殖將毒種按量接種長成致密單層且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代 細胞，37°C、10轉(zhuǎn)/小時轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，當(dāng)病變達到75-80%時適時收獲，測定效價，效價達到 l(f5TCID5Q/0. Iml的毒液用于制苗。4.滅活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使終濃度達到2%0，滅活12小時，按4%加 入吐溫-80，與含有硬脂酸鋁、6%司班-80熬制而成的白油按體積比1 2混合，經(jīng)高 速剪切乳化機10000轉(zhuǎn)/分鐘乳化15分鐘制成油乳劑滅活疫苗。該疫苗經(jīng)物理性狀檢測，劑型為油包水，粘度適中，穩(wěn)定性良好，疫苗在4°C放置1 年；37°C放置21天，均未見分層。安全檢驗1.用10頭份劑量肌肉注射1月齡犢牛，觀察14天，未見由疫苗注射引起的局部及 全身不良反應(yīng)。2.用10頭份劑量肌肉注射產(chǎn)前1月懷孕母牛，未見由疫苗注射引起的局部及全身 不良反應(yīng)和流產(chǎn)。效力檢驗用1頭份劑量肌肉注射12月齡奶牛，免疫后21-35天采血測抗體，抗體 陽性率為95%。實施例2免疫效果試驗1.材料1. 1牛傳染性鼻氣管炎油乳劑滅活疫苗1. 2牛傳染性鼻氣管抗體陰性成年奶牛2.方法選取牛傳染性鼻氣管抗體陰性成年奶牛70頭，隨機分為4組，3個組作為免疫組， 1個組作為對照組。免疫組分別肌肉注射實施例1制備的牛傳染性鼻氣管炎油乳劑滅活疫 苗1頭份、2頭份、4頭份；對照組不免疫，免疫后35天，分別采血測抗體。分組及免疫方法 見表1。
表1分組及免疫方法
權(quán)利要求
1.一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗，其特征在于所述病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒， Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，簡稱IBRV，系從牛傳染性鼻氣管炎流行地區(qū) 分離鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛傳染性鼻氣管炎疫苗，其特征在于所述牛傳染性鼻氣管炎 病毒對乙醚、氯仿和胰蛋白酶敏感；不耐酸堿，用0. Imol/LNaOH和0. lmol/L HCl溶液將病 毒液分別調(diào)到pH3，pH9和pHll，37°C作用lh，即可將病毒滅活；可被IBRV陽性血清中和，中 和抗體滴度為 2_7.9 ；TCID5tl 值為 10_6·65/100 μ 1，10_3·35/20 μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛傳染性鼻氣管炎疫苗，其特征在于所述牛傳染性鼻氣管炎 病毒可以用IBRV特異性引物經(jīng)PCR擴增出339bp的gB基因的高保守區(qū)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛傳染性鼻氣管炎疫苗，其特征在于所述的IBRV特異性引物 序列為PBl 5' -GGC TCT ACC GCA CGG GCA CCT CT-3'；PB2 5' -GCG GCT CTC GTC TCG CAG CAT TT-3'。
5.一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，其特征在于所述制備方法包含如下步驟a.病毒分離無菌采集IBR流產(chǎn)胎牛的肝、脾、心、腎、胎盤、肺，剪碎、研磨，隨后加入5 倍量Hanks (內(nèi)含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，制成乳劑后移入IOml離心管中， 反復(fù)凍融三次。以3000r/min離心lOmin，取上清液過濾除菌。用Hanks液稀釋10倍、100 倍、1000倍，分別接種長成致密單層且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代細胞，連續(xù)傳代35-50代分 離得到。b.病毒鑒定用特異性的抗IBRV標準陽性血清與分離病毒進行中和試驗，IBRV標準 陽性血清對分離株的中和抗體滴度為2_81 ；提取分離病毒DNA模板，用IBRV特異性引物經(jīng) PCR擴增出339bp的gB基因的高保守區(qū)序列，證實分離的病毒為IBRV。c.病毒繁殖將毒種接種長成致密單層且形態(tài)完好的犢牛睪丸原代細胞，適時收獲， 測定效價，效價達到106_5TCID5tlA). Iml的毒液用于制苗。d.滅活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使終濃度達到2%0，滅活12小時，按4%加入吐 溫-80，與含有硬脂酸鋁、6%司班-80熬制而成的白油按體積比1 2混合，經(jīng)高速剪 切乳化機10000轉(zhuǎn)/分鐘乳化15分鐘制成油乳劑滅活疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，其特征在于所述疫苗制備 方法適用于所有牛傳染性鼻氣管炎分離毒株的疫苗制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛傳染性鼻氣管炎疫苗制備方法，其特征在于所述疫苗制備 過程中可加入任意免疫增強佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛傳染性鼻氣管炎疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，用于解決牛傳染性鼻氣管炎地區(qū)性流行的疫苗預(yù)防控制問題。該疫苗通過從感染牛傳染性鼻氣管炎病毒的母牛流產(chǎn)胎兒組織分離病毒、繁殖傳代、效價檢測、滅活乳化等步驟制備而成，可以用于地區(qū)性牛傳染性鼻氣管炎流行的預(yù)防控制。
文檔編號A61P31/20GK102049043SQ20091007113
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者劉愛玲, 夏雪林, 申宏旺, 馬麗偉 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司