一種用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)活疫苗的方法，尤其是涉及一種用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣 管炎活疫苗的方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性喉氣管炎（AILT)是一種接觸性呼吸道傳染病，病原為喉氣管炎病毒，可 感染不同年齡的雞。目前發(fā)病年齡有提前的趨勢，最早可見20日齡的雞群發(fā)病，呈地方流 行性，發(fā)病率高達(dá)90%以上，死亡率10~40%。對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有較嚴(yán)重的危害性。
[0003] 雞傳染性喉氣管炎病毒（AILTV)屬于皰疹病毒屬α亞科，其生物學(xué)特性和基因 結(jié)構(gòu)與人的單純皰疹病毒（HSV)較相似，如基因結(jié)構(gòu)特征、分子量大小、同源特性等特點。 AILTV與HSV具有如此多的相似之處，使得較多學(xué)者針對HSV本身的特性進(jìn)行AILTV的生物 學(xué)方面的探索。
[0004] 目如，對AILT的防控主要以疫苗的免疫接種為主，其中弱毒疫苗應(yīng)用的效果最為 理想。但在實際應(yīng)用中，弱毒疫苗所用病毒存在毒力偏強(qiáng)，易于返祖，對雞易形成潛伏性感 染的弊端；在疫苗的實際生產(chǎn)中，主要使用SPF雞胚進(jìn)行ILT活疫苗的生產(chǎn)，而自2006年起 農(nóng)業(yè)部規(guī)定所有的禽用活疫苗及幾個豬用活疫苗等全部使用SPF胚后，使得SPF雞胚接受 了較大的挑戰(zhàn)，其雞胚使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其供給能力，SPF胚供應(yīng)存在豁口；對SPF雞胚的 質(zhì)量監(jiān)測方面也存在一定的缺陷，這是因為是通過檢測SPF雞群的微生物結(jié)果來判定，但 由于檢測仍不成熟，使得監(jiān)測仍存在困難，從而導(dǎo)致SPF胚的純凈性存在一定的問題，無法 得到用戶的全面認(rèn)可；另外由于SPF雞群飼養(yǎng)水平處于發(fā)展階段，SPF雞群的培育，飼養(yǎng)人 員日常操作管理等方面都存在不確定因素，導(dǎo)致SPF胚批間的差異性的存在成為必然。SPF 雞胚存在如此多的缺點，不得不讓我們?nèi)で笮碌呐囵B(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷、提供了一種用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗 的方法，它可以解決目前生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗方面存在的問題，
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的。
[0007] -種用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，其選用細(xì)胞系代替雞胚進(jìn)行 雞傳染性喉氣管炎病毒液的增殖，步驟如下：
[0008] (1)篩選雞傳染性喉氣管炎病毒培養(yǎng)細(xì)胞系：根據(jù)雞傳染性喉氣管炎病毒生物學(xué) 特性，選取ΒΗΚ-21細(xì)胞、Vero細(xì)胞、DFl細(xì)胞、原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)、雞胚肝細(xì)胞或雞 胚腎細(xì)胞，前兩種細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，后四種細(xì)胞使用Μ199培養(yǎng)液，分別進(jìn)行 所述病毒的培養(yǎng)，得病毒株適應(yīng)性細(xì)胞；
[0009] (2)篩選細(xì)胞的克隆純化：對步驟⑴中所得的病毒株適應(yīng)性細(xì)胞用8%胎牛血清 培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為2個細(xì)胞/ml，加入48孔細(xì)胞板中，0. 3ml/孔進(jìn)行細(xì)胞克隆培 養(yǎng)，選取細(xì)胞生長均一、輪廓清晰、透亮，細(xì)胞內(nèi)無雜質(zhì)的細(xì)胞孔進(jìn)行消化凍存?zhèn)溆茫?br>[0010] ⑶制苗細(xì)胞的傳代、培養(yǎng)：
[0011] (4)病毒株的克隆、培養(yǎng)：采用步驟（2)中的克隆細(xì)胞進(jìn)行病毒株的蝕斑克隆培 養(yǎng)，共克隆四次，一次克隆分別選取三個最小蝕斑，分別進(jìn)行后三次的克隆，最終分別繁殖 克隆三個毒株，篩選出毒力最弱、免疫原性最強(qiáng)的制苗毒株，并對所述毒株進(jìn)行適應(yīng)性培 養(yǎng)；
[0012] (5)制苗用毒液的制備：用M199培養(yǎng)液對步驟（4)制苗毒株進(jìn)行稀釋，接種于長 滿單層的制苗細(xì)胞中，于培養(yǎng)箱中吸附，待吸附后棄去稀釋液，補(bǔ)加細(xì)胞維持液，進(jìn)行病毒 的培養(yǎng)，最終收獲細(xì)胞懸液備用；
[0013] (6)疫苗的配制及分裝：收獲步驟（5)中的制苗毒液，加入保護(hù)劑，充分混勻，定量 分裝；
[0014] ⑵凍干。
[0015] 上述用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，步驟（1)中，所述雞傳染性 喉氣管炎病毒為K317株。
[0016] 上述用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，步驟（2)中，所述細(xì)胞生長 液為M199,所用血清為8~12 %胎牛血清，培養(yǎng)PH為7. 0~7. 4 ;所述細(xì)胞經(jīng)3~5次單 克隆培養(yǎng)處理，條件為，細(xì)胞：細(xì)胞孔=2 :1。
[0017] 上述用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，步驟（3)中，細(xì)胞傳10~15 代。
[0018] 上述用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，步驟（5)中，制苗毒液采用 PH值為7. 4~7. 6的100% M199營養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，以Ig尿囊膜中加入1ml所述營養(yǎng)液的 方式獲得ILT病毒原液，最終以0. 5~1%接種量接種；病毒吸附的時間為1~2小時；所 述制苗細(xì)胞維持液為97% M199營養(yǎng)液和3 %胎牛血清，PH值為7. 4~7. 6。
[0019] 上述用細(xì)胞系生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗的方法，步驟(6)中，所述保護(hù)劑為 10 %~15%的脫脂牛奶蔗糖。
[0020] 本發(fā)明為克服現(xiàn)有AILT活疫苗制備上存在的不足，通過大量的實驗研究，成功篩 選出ILTV適應(yīng)性細(xì)胞系進(jìn)行ILT活疫苗的制備，并應(yīng)用于生產(chǎn)，成功替代現(xiàn)有使用雞胚的 生產(chǎn)方式。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果如下：
[0021] (1)通過有限稀釋法和優(yōu)等細(xì)胞篩選法，對篩選的病毒適應(yīng)性細(xì)胞一一雞胚肝細(xì) 胞進(jìn)行克隆純化、傳代培養(yǎng)，最終篩選出病毒適應(yīng)性好，細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)良，并可連續(xù)傳10~15 個代次的傳代雞胚肝細(xì)胞；
[0022] (2)通過蝕斑純化技術(shù)和有限稀釋法的有效結(jié)合，篩選出免疫原性好，毒力低，不 易返祖并穩(wěn)定增殖的制苗毒。
[0023] (3)用傳代細(xì)胞生產(chǎn)雞傳染性喉氣管炎活疫苗，降低了生產(chǎn)成本，減少了疫苗免疫 副反應(yīng)問題，縮小了批間差異性，保證了疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定，并為實現(xiàn)所述病毒的規(guī)模化培養(yǎng) 奠定了基礎(chǔ)。
[0024] 實驗表明，本發(fā)明克隆方法僅通過3次克隆便可獲得無細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)、透亮、圓潤、 輪廓清晰的細(xì)胞，而現(xiàn)有方法需要克隆7次，可見本方法縮短了克隆時長，并在克隆中具有 高活性及高幾率的克隆幾率。
【附圖說明】
[0025] 圖1是不同細(xì)胞系培養(yǎng)雞傳染性喉氣管炎病毒的培養(yǎng)細(xì)胞圖
[0026] 圖2是本發(fā)明的技術(shù)路線圖
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0028] AILTV K317株由中國獸藥監(jiān)察所提供。
[0029] BHK_21、Vero、DFl三種細(xì)胞均購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0030] CEF、雞胚肝、雞胚腎三種細(xì)胞均由申請人制備。
[0031] BHK-21和Vero細(xì)胞的培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)液，CEF、DF1、雞胚肝、雞胚腎細(xì)胞采用 M199培養(yǎng)液，細(xì)胞生長液中添加了 8%~12%的胎牛血清，細(xì)胞維持液中添加了 3%~5% 的胎牛血清。
[0032] 實施例1篩選病毒適應(yīng)性細(xì)胞
[0033] 1細(xì)胞的選取
[0034] AILTV與HSV同屬于皰疹病毒屬α亞科，特性有較多的相似之處，據(jù)相關(guān)報道HSV 可在BHK細(xì)胞、Vero細(xì)胞等多種細(xì)胞中生長良好，為篩選AILTV適應(yīng)性細(xì)胞，本發(fā)明選擇 ΒΗΚ-21和Vero細(xì)胞進(jìn)行AILTV的繁殖。DF1、原代CEF細(xì)胞、雞胚肝和腎細(xì)胞的選擇主要根 據(jù)ILTV宿主特異性強(qiáng)的培養(yǎng)特性進(jìn)行選擇。
[0035] 2細(xì)胞的制備及傳代
[0036] CEF、雞胚肝、雞胚腎三種細(xì)胞是雞胚原代細(xì)胞，分別用去除眼球的整個雞胚、剪碎 的雞胚肝、搗碎的雞胚腎經(jīng)2. 5%胰酶（100單位/ml的雙抗，PH為7. 5~7. 8)消化，加入 M199生長液制備；DFl、BHK-21、Vero細(xì)胞經(jīng)0. 25%胰酶分散消化傳代，分別加入細(xì)胞生長 液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0037] 3病毒的適應(yīng)培養(yǎng)
[0038] 將AILTV接種于長滿單層的CEF、DF1、雞胚肝、雞胚腎、BHK-21、Vero細(xì)胞瓶中，同 時設(shè)空白對照，吸附1~2h后補(bǔ)加細(xì)胞維持液，置于5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察病變 情況，培養(yǎng)至第4天，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融，保存?zhèn)溆?。采用收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物重復(fù)上 述步驟進(jìn)行接種，共傳10代。
[0039] 4觀察及測定結(jié)果
[0040] 細(xì)胞接種病毒后進(jìn)行CPE觀察，同時采用PCR和免疫熒光法（IFA)跟蹤檢測，最終 對P8~PlO代培養(yǎng)物進(jìn)行滴度測定，結(jié)果如表1所示。
[0041] 表1病毒適應(yīng)性培養(yǎng)測定及觀察結(jié)果
[0042]
[0043] 注釋："一"為沒有測出數(shù)值。
[0044] 5 結(jié)論
[0045] 對選擇的六種細(xì)胞進(jìn)行病毒適應(yīng)性篩選，通過細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、CPE的觀察、PCR 和IFA的檢測及病毒滴度的測定，最終篩選出有CPE病變、IFA和PCR檢測為陽性，并測得 具有穩(wěn)定病毒滴度的病毒適應(yīng)性細(xì)胞一一雞胚