本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種禽流感滅活疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
人感染禽流感，是由禽流感病毒引起的人類(lèi)疾病。禽流感病毒，屬于甲型流感病毒，根據(jù)禽流感病毒對(duì)雞和火雞的致病性的不同，分為高、中、低/非致病性三級(jí)。由于禽流感病毒的血凝素結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，一般感染禽類(lèi)，當(dāng)病毒在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生基因重配，致使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，獲得感染人的能力，才可能造成人感染禽流感疾病的發(fā)生。
肉雞生長(zhǎng)周期短，快速的體重增加使肉雞的免疫系統(tǒng)處于高負(fù)荷狀態(tài)，這要求肉雞用疫苗有更高的質(zhì)量保證，適時(shí)適度的接種疫苗是有效避免疫情的措施?，F(xiàn)有技術(shù)中，滅活疫苗多為油包水型，其制備工藝比較復(fù)雜，并且注射部位吸收較慢、抗原釋放較慢，影響機(jī)體抵抗病毒的能力、后期影響禽類(lèi)肉制品的品質(zhì)；雖然能產(chǎn)生一定水平的抗體，但是抗體產(chǎn)生的時(shí)間較晚，不適于生長(zhǎng)周期較短的肉雞。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種禽流感滅活疫苗。
為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種禽流感滅活疫苗制備方法，包括以下步驟：
1)病毒的接種，將禽流感La Sota種毒用滅菌生理鹽水作5000倍稀釋?zhuān)蚰仪粌?nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收獲，選取接種后48～120小時(shí)之間死亡且病痕明顯的雞胚，收獲尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的半數(shù)感染量測(cè)定方法，進(jìn)行病毒含量測(cè)定，病毒效價(jià)應(yīng)≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的滅活，向病毒液中加入質(zhì)量濃度為37％，終濃度為0.07％～0.15％的福爾馬林溶液，混勻，37℃搖床中180～200rpm/min滅活16～24小時(shí)；
4)乳化即得到禽流感滅活疫苗。
作為優(yōu)選，步驟4)所述的乳化包括以下操作：
水相制備：將滅活后的禽流感病毒液通過(guò)GQ管式離心機(jī)離心，棄去沉淀， 將濾過(guò)液用截留分子量為300KD的Millipore膜包進(jìn)行2～3倍濃縮，濃縮后的病毒液即為水相，使用前置于30～32℃水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱。
油相制備：取進(jìn)口MONTANIDETMISA 206VG佐劑，使用前進(jìn)行充分混勻，并置于30～32℃水浴中進(jìn)行預(yù)熱，即為油相。
將水相和油相按質(zhì)量比為1:1的比例混合，磁力攪拌裝置進(jìn)行預(yù)混合，然后采用ATS Engineering Inc公司AH100D型均質(zhì)機(jī)進(jìn)行水包油包水型疫苗的乳化，二級(jí)閥壓力20～30bar，一級(jí)閥壓力調(diào)節(jié)至400～500bar，共乳化1～2遍，制備成水包油包水型禽流感滅活疫苗，病毒含量≥108.5EID50/0.1ml。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明制備的疫苗為水包油包水型，粘度低，粒度小，易吸收，同時(shí)接種后產(chǎn)生抗體速度較快；本發(fā)明選用的佐劑在疫苗制備過(guò)程中無(wú)需要額外添加任何表面活性劑成分，制備的疫苗安全性好，避免了傳統(tǒng)油佐劑難以吸收造成的副作用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種禽流感滅活疫苗制備方法，包括以下步驟：
1)病毒的接種，將禽流感La Sota種毒用滅菌生理鹽水作5000倍稀釋?zhuān)蚰仪粌?nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收獲，選取接種后48小時(shí)之間死亡且病痕明顯的雞胚，收獲尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的半數(shù)感染量測(cè)定方法，進(jìn)行病毒含量測(cè)定，病毒效價(jià)應(yīng)≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的滅活，向病毒液中加入質(zhì)量濃度為37％，終濃度為0.07％的福爾馬林溶液，混勻，37℃搖床中180rpm/min滅活16小時(shí)；
4)乳化即得到禽流感滅活疫苗。
其中步驟4)所述的乳化包括以下操作：
水相制備：將滅活后的禽流感病毒液通過(guò)GQ管式離心機(jī)離心，棄去沉淀，將濾過(guò)液用截留分子量為300KD的Millipore膜包進(jìn)行2～3倍濃縮，濃縮后的病毒液即為水相，使用前置于30～32℃水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱。
油相制備：取進(jìn)口MONTANIDETMISA 206VG佐劑，使用前進(jìn)行充分混勻，并置于30～32℃水浴中進(jìn)行預(yù)熱，即為油相。
將水相和油相按質(zhì)量比為1:1的比例混合，磁力攪拌裝置進(jìn)行預(yù)混合，然后采用ATS Engineering Inc公司AH100D型均質(zhì)機(jī)進(jìn)行水包油包水型疫苗的乳化，二級(jí)閥壓力20～30bar，一級(jí)閥壓力調(diào)節(jié)至400～500bar，共乳化1～2遍，制備成水包油包水型禽流感滅活疫苗，病毒含量≥108.5EID50/0.1ml。
實(shí)施例2
一種禽流感滅活疫苗制備方法，包括以下步驟：
1)病毒的接種，將禽流感La Sota種毒用滅菌生理鹽水作5000倍稀釋?zhuān)蚰仪粌?nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收獲，選取接種后120小時(shí)之間死亡且病痕明顯的雞胚，收獲尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的半數(shù)感染量測(cè)定方法，進(jìn)行病毒含量測(cè)定，病毒效價(jià)應(yīng)≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的滅活，向病毒液中加入質(zhì)量濃度為37％，終濃度為0.15％的福爾馬林溶液，混勻，37℃搖床中200rpm/min滅活24小時(shí)；
4)乳化即得到禽流感滅活疫苗。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。