本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種副豬嗜血桿菌四價(jià)滅活疫苗。
背景技術(shù)：
：豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)是豬Glasser's病的病原體，引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。國外對HPS流行病學(xué)調(diào)查表明，臨床病豬的分離率高達(dá)20％左右。隨著我國集約化豬場的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病的發(fā)生呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是近年來嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的細(xì)菌性傳染病之一。副豬嗜血桿菌至少有15個(gè)血清型，不同國家或地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型不同，不同血清型的致病性和免疫學(xué)特性差異顯著。目前，已經(jīng)證實(shí)副豬嗜血桿菌在我國絕大多數(shù)豬場存在和流行。美國、日本、加拿大、德國、澳大利亞、丹麥、西班牙等養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達(dá)的國家均已對本國的副豬嗜血桿菌流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，表明副豬嗜血桿菌的分離率高達(dá)20％左右，而且流行的血清型通常都毒力較強(qiáng)，如血清型4型、5型和13型。日本、美國和西班牙的血清型以4型和5型最為流行；而丹麥和澳大利亞的分離菌株主要為血清5型和13型為主；德國主要是血清2型和4型。各國的流行調(diào)查結(jié)果顯示，各國流行血清型各有差別，具有差異性。近年來，我國學(xué)者對不同地區(qū)的副豬嗜血桿菌進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，綜合報(bào)道的研究結(jié)果顯示血清4型、5型、12型和13型是目前我國最為流行的血清型。我們對全國不同地區(qū)的副豬嗜血桿菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究，結(jié)果表明當(dāng)前給我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來危害的副豬嗜血桿菌的優(yōu)勢血清型為4型、5型、12型和13型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種副豬嗜血桿菌四價(jià)滅活疫苗，從而用于預(yù)防由4、5、12、13型副豬嗜血桿菌引起的豬副嗜血桿菌病。本發(fā)明副豬嗜血桿菌四價(jià)滅活疫苗，其中抗原為滅活的副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株；其中4型YBH04株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5479、5型YBH05株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5480；13型YBH13株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5501；副豬嗜血桿菌YBH12(HaemophilusparasuisYBH12)株，于2016年11月10日保藏在中國武漢、武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016636。上述的副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株是使用甲醛溶液進(jìn)行了滅活；上述滅活疫苗中YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13菌株的數(shù)量優(yōu)選為2.5-3.0×109CFU/ml。本發(fā)明從優(yōu)勢流行菌株中篩選出免疫原性良好的副豬嗜血桿菌4型YBH04株、5型YBH05株、12型YBH12株和13型YBH13株作為疫苗制備菌株，分別接種于TSB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活，加入201佐劑混合乳化制成；用于預(yù)防由4、5、12、13型副豬嗜血桿菌引起的豬副嗜血桿菌?。淮艘呙缇哂邪踩院?、免疫效力高且免疫期長等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明所使用的抗原菌株的信息如下：一、副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株的篩選1.流行病學(xué)調(diào)查自2008年以來，我們對副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，并對部分豬場進(jìn)行跟蹤調(diào)查。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清4、5、12、13型是目前流行血清型。而4、5、13型均已篩選出適宜的制苗菌株，而且三價(jià)滅活疫苗已有研制；但副豬嗜血桿菌血清12型的菌株還未進(jìn)行篩選。2.細(xì)菌分離采集疑似病豬的肺臟、胸腹腔積液、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織等病料，接種TSA培養(yǎng)基，于5％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行培養(yǎng)并鑒定。3.細(xì)菌鑒定3.1形態(tài)觀察取疑似菌落，涂片后革蘭氏染色鏡檢，觀察其細(xì)菌形態(tài)。3.2生化特性鑒定取疑似菌落按常規(guī)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、衛(wèi)星生長試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖。同時(shí)用HPS12型國際參考菌株作對照菌株，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。3.3PCR鑒定根據(jù)副豬嗜血桿菌16SrRNA序列設(shè)計(jì)引物，引物為(F：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’，R：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT–3’)。對分離到的疑似HPS分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)為822bp大小的片段。3.4血清學(xué)特性鑒定采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對副豬嗜血桿菌分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。4.毒力試驗(yàn)將分離的10株血清12型副豬嗜血桿菌分別腹腔注射8～10周齡健康易感仔豬各5頭，3.0ml/頭(活菌量均約為5.0×109CFU)，另取5頭不攻毒作為對照。連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)豬的發(fā)病及死亡情況。5.免疫原性根據(jù)毒力試驗(yàn)結(jié)果，將篩選的毒力較強(qiáng)的YBH12株分離菌株菌液分別調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價(jià)滅活疫苗，肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬采血并分離血清，使用微量凝集方法測定血清的抗體效價(jià)；并分別用本菌株進(jìn)行腹腔注射攻毒(活菌量均約為6.0×109CFU)。觀察試驗(yàn)豬的發(fā)病及死亡情況，比較不同菌株對豬的免疫原性。試驗(yàn)結(jié)果表明，微量凝集抗體為5/5大于等于1:32；免疫組為5/5保護(hù)，對照組為5/5發(fā)病。6.交叉攻毒保護(hù)根據(jù)毒力試驗(yàn)結(jié)果，將篩選的毒力較強(qiáng)的YBH12株分離菌株菌液調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價(jià)滅活疫苗，腿部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬分別用分離的10株同型菌株進(jìn)行攻毒(6.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗(yàn)仔豬的發(fā)病及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，YBH12株疫苗制備的單價(jià)滅活疫苗，能抵御YBH12株及其他9株分離株的攻擊，攻毒保護(hù)率均為5/5，具有較好的交叉攻毒保護(hù)力。本發(fā)明的副豬嗜血桿菌四價(jià)滅活疫苗中使用的其它三個(gè)副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)菌株為YBH04、YBH05、和YBH13株；其中4型YBH04株(2009年從山東省某豬場病死豬的關(guān)節(jié)液中分離)和5型YBH05株(2008年從山東省平度某豬場病死豬的關(guān)節(jié)液中分離)，13型YBH13株(2009年從山東省濟(jì)南某豬場病死豬的心臟中分離)。4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)分別為：CGMCCNo.5479、CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501；12型YBH12株已于2016年11月10日保藏在中國武漢、武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2016636。2毒株特點(diǎn)2.1形態(tài)及生化特性副豬嗜血桿菌菌株YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌均為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)(從單個(gè)的球桿菌到長的、細(xì)長的、以至絲狀的菌體)。接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陽性，溶血性試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性，能呈現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖。2.2培養(yǎng)特性副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株在含0.01％輔酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中呈均勻一致的混濁生長；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，形成直徑0.3～2.0mm、圓形、光滑、濕潤、無色透明的露珠樣菌落。2.3血清型應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定，副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌分別為HPS4、5、12、13型。2.4菌株毒力腹腔注射8～10周齡健康易感仔豬，能使至少4頭及以上仔豬發(fā)病的各菌株的攻毒量分別是YBH04株約為5.0×109CFU/頭，YBH05株約為5.0×109CFU/頭、YBH12株約為6.0×109CFU/頭、YBH13株約為6.0×109CFU/頭。2.5免疫原性取3～5周齡健康易感仔豬30頭，隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F、G、H八組，每組5頭，A、B、C、D組為免疫組，E、F、G、H組為非免疫對照組。A、B、C、D組分別頸部肌肉注射YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株單價(jià)201佐劑滅活疫苗，2.0ml/頭(抗原含量為0.5×109CFU/ml)。免疫后21日按相同方法和劑量進(jìn)行二免，二免后14日攻毒。A、E組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；B、F組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；C、G組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)；D、H組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)。觀察14日，免疫組豬均應(yīng)至少4頭保護(hù)，對照組豬均應(yīng)至少4頭發(fā)病。副豬嗜血桿菌四價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，主要是：1采用發(fā)酵罐分別對四株菌種進(jìn)行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時(shí)加入消泡劑，通入高壓蒸汽進(jìn)行滅菌，待其溫度降至37～38℃時(shí)，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二級(jí)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個(gè)培養(yǎng)過程通過調(diào)節(jié)進(jìn)氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)12～14小時(shí)后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹檢驗(yàn)。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機(jī)離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過48小時(shí)。根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌泥分別重懸于適量滅菌的生理鹽水中，均稀釋至1.6×1010CFU/ml，分別計(jì)量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時(shí)，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，其余菌液置2～8℃保存，不超過14日。將滅活的副豬嗜血桿菌4、5、12、13型抗原液等量混合，作為水相。2疫苗制備水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘，制備滅活疫苗。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1：一、疫苗制備1生產(chǎn)用種子制備1.1生產(chǎn)菌種的復(fù)蘇及一級(jí)種子繁殖分別將YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株凍干菌種溶解，劃線接種于TSA培養(yǎng)基，置5％CO2、37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，分別選取單個(gè)典型菌落密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)；分別挑取菌苔接種于TSB培養(yǎng)基，37℃150r/min振蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。-15℃以下保存，應(yīng)不超過30日。1.2二級(jí)種子繁殖將一級(jí)種子按3％～5％比例接種TSB培養(yǎng)基中，37℃150r/min振蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)，鏡檢純粹后，作為二級(jí)種子。2～8℃保存，應(yīng)不超過24小時(shí)。2制苗用培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。3制苗用菌液的制備3.1菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵罐分別對四株菌種進(jìn)行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時(shí)加入消泡劑，通入高壓蒸汽進(jìn)行滅菌，待其溫度降至37～38℃時(shí)，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二級(jí)種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個(gè)培養(yǎng)過程通過調(diào)節(jié)進(jìn)氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)12～14小時(shí)后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹檢驗(yàn)。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機(jī)離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過48小時(shí)。3.2滅活根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌泥分別重懸于適量滅菌的生理鹽水中，均稀釋至1.6×1010CFU/ml，分別計(jì)量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時(shí)，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，其余菌液置2～8℃保存，不超過14日。4半成品檢驗(yàn)4.1純粹檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。4.2活菌計(jì)數(shù)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行計(jì)數(shù)。4.3滅活檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。5疫苗制備5.1水相配制將檢驗(yàn)合格的YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株菌液等量混合。5.2油相MONTANIDETMISA201VG佐劑(以下簡稱201佐劑)。5.3乳化水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。6分裝定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。二、疫苗的安全試驗(yàn)1對最小使用日齡的單劑量和單劑量重復(fù)試驗(yàn)用21日齡健康易感仔豬15頭，分成3組，每組5頭。A、B組每頭頸部肌肉注射201501批疫苗2.0ml，B組在一次免疫后14日再免疫一次。C組為不免疫對照組。觀察14日，觀察仔豬的注射部位有無紅腫、硬結(jié)等不良反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，仔豬單劑量免疫和單劑量重復(fù)免疫的精神、飲食正常，注射部位無紅腫、硬結(jié)等不良反應(yīng)。2對仔豬、懷孕母豬和種公豬的超劑量注射的安全性試驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)室試制的3批疫苗(201501、201502、201503批)分別取21日齡仔豬、產(chǎn)前6-7周齡懷孕母豬、1-3年種公豬各5頭，每頭頸部肌肉注射4.0ml/頭，觀察14日，觀察仔豬的注射部位有無紅腫、硬結(jié)等不良反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，超劑量免疫仔豬、懷孕母豬和種公豬的精神、飲食正常，注射部位無紅腫、硬結(jié)等不良反應(yīng)。三、疫苗微量凝集抗體效價(jià)和攻毒保護(hù)相關(guān)試驗(yàn)用本課題組實(shí)驗(yàn)室試制的豬副豬嗜血桿菌病四價(jià)滅活疫苗(以下簡稱“滅活苗”)，分別按0.5ml/頭、1ml/頭、2ml/頭不同劑量免疫3周齡健康易感仔豬，進(jìn)行最小免疫劑量試驗(yàn)及抗體與攻毒保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)。最小免疫劑量結(jié)果顯示，1ml/頭以上的劑量組的免疫仔豬血清中HPS4、5、12、13型抗體效價(jià)均在1:32及以上，攻毒能達(dá)到4/5及以上保護(hù)，因此該疫苗的最小免疫量為1ml/頭，考慮到臨床應(yīng)用時(shí)影響因素較多，為保證疫苗的免疫效果，將滅活疫苗的免疫劑量確定為2.0ml/頭?？贵w與攻毒保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HPS4、5、12、13型的抗體效價(jià)≤1:8時(shí)，攻毒保護(hù)率為≤2/5；抗體效價(jià)為1:16時(shí)，攻毒保護(hù)率為≤3/5；抗體效價(jià)≥1:32時(shí)，攻毒保護(hù)率為4/5～5/5。因此抗體與攻毒保護(hù)之間呈正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果詳見表1-2。表1免疫豬的抗體效價(jià)表2免疫仔豬的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果四、抗體消長規(guī)律、免疫持續(xù)期及仔豬母源抗體持續(xù)期試驗(yàn)用本課題組制備的3批豬副豬嗜血桿菌病四價(jià)滅活疫苗(4型YBH04株+5型YBH05株+12型YBH12株+13型YBH13株)(批號(hào)分別為201501、201502、201503)，頸部肌肉注射3～5周齡健康易感仔豬、1～3年種公豬和產(chǎn)前6～7周懷孕母豬。仔豬首免后3周進(jìn)行二免，2.0ml/頭。仔豬于一免后21日、二免后7日、14日、1、2、4、6、7個(gè)月隨機(jī)抽取5頭采血，測定血清中HPS4、5、12、13型的抗體效價(jià)；種公豬于免疫后1、3、6、7個(gè)月，分別采血測定其抗體效價(jià)，觀察抗體水平的消長規(guī)律；母豬在產(chǎn)前6～7周進(jìn)行免疫，并于免疫后2、4、6、7個(gè)月采血檢測血清抗體，產(chǎn)仔后，分別在仔豬出生后第7、14、21、28日采血測定血清的抗體水平，并于出生后21日和28日進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，仔豬在免疫后7個(gè)月抗體仍≥1:32；種公豬免后7個(gè)月抗體仍≥1:32；母豬免疫后7個(gè)月抗體≥1:32，所產(chǎn)仔豬出生后21日抗體仍≥1:32，21日的攻毒保護(hù)率為4/5～5/5，出生后28日的抗體均小于1:32，28日的攻毒保護(hù)率為2/5～3/5。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，最終確定疫苗對仔豬和種豬的免疫期為6個(gè)月，仔豬母源抗體保護(hù)至出生后21日。詳見表3-表6。表3仔豬免疫后微量凝集抗體消長規(guī)律的測定表4產(chǎn)前6-7周懷孕母豬免疫后微量凝集抗體消長規(guī)律的測定表5仔豬母源抗體消長規(guī)律測定結(jié)果試驗(yàn)豬日齡HPS4型HPS5型HPS12型HPS13型1周齡仔豬≥1:32≥1:32≥1:32≥1:322周齡仔豬≥1:32≥1:32≥1:32≥1:323周齡仔豬≥1:32≥1:32≥1:32≥1:324周齡仔豬≤1:8≤1:16≤1:8≤1:16非免疫對照組≤1:4≤1:4≤1:4≤1:4表6被動(dòng)免疫仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果并且，用目前市場上出售的副豬嗜血桿菌疫苗進(jìn)行免疫，再用本發(fā)明使用的YBH04株、YBH05株YBH12株YBH13株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)；結(jié)果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠(yuǎn)低于本發(fā)明制備的四價(jià)疫苗效果。五、疫苗成品檢驗(yàn)1性狀外觀乳白色乳劑。劑型水包油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應(yīng)呈云霧狀擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過0.5ml。黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。2裝量檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。3無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。4安全檢驗(yàn)用3～5周齡健康易感仔豬5頭，每頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)因疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)。5效力檢驗(yàn)先用血清學(xué)方法檢驗(yàn)，血清學(xué)方法檢驗(yàn)不合格時(shí)，再用免疫攻毒法進(jìn)行檢驗(yàn)。5.1血清學(xué)方法取3～5周齡健康易感仔豬10頭，其中5頭頸部肌肉注射疫苗2.0ml/頭，其余5頭作非免疫對照。一次免疫后21日，按相同劑量和相同方法進(jìn)行二次免疫，二次免疫后14日對所有仔豬采血并分離血清，檢測HPS4、5、13型抗體效價(jià)。免疫組仔豬的血清中4、5、12、13型抗體效價(jià)均應(yīng)≥1:32，對照組仔豬的血清4、5、12、13型抗體效價(jià)均應(yīng)≤1:4。5.2免疫攻毒法取3～5周齡健康易感仔豬40頭，隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F、G、H八組，每組5頭，A、B、C、D組為免疫組，E、F、G、H組為非免疫對照組。A、B、C、D組分別頸部肌肉注射YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株單價(jià)201佐劑滅活疫苗，2.0ml/頭(滅活前細(xì)菌約含量為2.0×109CFU/ml)。免疫后21日按相同方法和劑量進(jìn)行二免，二免后14日攻毒。A、E組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；B、F組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；C、G組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)；D、H組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)。觀察14日，免疫組豬均應(yīng)至少4頭保護(hù)，對照組豬均應(yīng)至少4頭發(fā)病。6甲醛殘留量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，應(yīng)符合規(guī)定。六、疫苗的作用與用途用于預(yù)防由4、5、12、13型副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病。免疫期為6個(gè)月。七、用法與用量頸部肌肉注射。仔豬：3～5周齡首免，3周后加強(qiáng)免疫1次，每次2.0ml/頭；母豬：產(chǎn)前6～7周免疫1次，每次2.0ml/頭；種公豬：每6個(gè)月免疫1次，每次2.0ml/頭。實(shí)施例21.生產(chǎn)用種子制備(1)一級(jí)種子繁殖與鑒定將YBH04、YBH05、YBH12株、YBH13株凍干菌種劃線接種于TSA瓊脂平板上，在5％～10％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h，各挑取典型菌落或菌苔，接種于100mlTSB肉湯，置37℃振蕩培養(yǎng)24～48h。各取2ml菌液經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。在-20℃下保存，不超過1個(gè)月；-70℃下保存，不超過3個(gè)月(詳見表7)。表7一級(jí)種子的制備(2)二級(jí)種子繁殖取YBH04、YBH05、YBH12株、YBH13菌株一級(jí)種子，劃線接種TSA瓊脂平板，在含5％～10％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h；各挑選典型菌落或菌苔，接種于800mlTSB肉湯中，置37℃振蕩培養(yǎng)24～48h，各取2ml菌液經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，即為二級(jí)種子。在2～8℃保存，應(yīng)不超過24h(詳見表8)。表8二級(jí)種子的制備2.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)4、5、12、13型菌液。按發(fā)酵罐容積的60％～70％加入生產(chǎn)用的半合成培養(yǎng)基20000ml，同時(shí)加入消泡劑(泡敵)進(jìn)行消毒，待其溫度降至37～38℃時(shí)，將2～8℃保存的二級(jí)種子液(單型)按2％～2.5％各400ml加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在37～38℃、攪拌轉(zhuǎn)速100～200r/min、pH7.2～7.4、罐壓0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培養(yǎng)12～14h，收獲菌液24300，按菌液體積的0.3％加入甲醛溶液672ml，37℃攪拌滅活24h，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活后的菌液置2～8℃保存。(詳見表9)。表9副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌數(shù)測定結(jié)果4.疫苗配制4.1水相配制將檢驗(yàn)合格的YBH04株、YBH05株、YBH12株和YBH13株菌液等量混合。4.2油相MONTANIDETMISA201VG佐劑(以下簡稱201佐劑)。4.3乳化水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30分鐘。4.4分裝定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。詳見表10。表10疫苗乳化和分裝疫苗成品檢驗(yàn)(1)性狀外觀乳白色乳液。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取2ml疫苗滴于清潔冷水表面呈油滴狀不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離心管中，3000r/min離心15分鐘，均無水相析出。黏度測定結(jié)果分別為25.8cP、26.2cP、26.4cP。(2)無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》方法進(jìn)行，無菌生長。(3)安全檢驗(yàn)取3～5周齡健康易感仔豬5頭，頸部肌肉注射疫苗，4.0ml/頭，觀察14日，所有試驗(yàn)豬精神、采食及飲水均未見明顯異常，注射部位和全身均無不良反應(yīng)。詳見表11。表11豬副豬嗜血桿菌病四價(jià)滅活疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果(4)甲醛殘留量測定按《中國獸藥典》方法進(jìn)行，甲醛含量為0.06％～0.07％符合規(guī)定。(5)效力檢驗(yàn)3～5周齡健康易感仔豬40頭，隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F、G、H八組，每組5頭，其中A、B、C、D組為免疫組，均頸部肌肉注射疫苗，2.0ml/頭；E、F、G、H組為非免疫對照組，均頸部肌肉注射生理鹽水，2.0ml/頭。免疫后21日按相同劑量和相同方法進(jìn)行二次免疫，二免后14日對所有仔豬采血并分離血清，檢測HPS4、5、12、13型抗體效價(jià)；采血后A、E組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；B、F組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；C、G組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量約為5.0×109CFU/頭)；D、H組試驗(yàn)豬腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)。觀察14日記錄試驗(yàn)豬的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果表明，3批疫苗用豬進(jìn)行的血清學(xué)檢測方法結(jié)果表明，3批疫苗二次免疫豬后14日，免疫組豬的4、5、12、13型的微量凝集抗體效價(jià)均≥1:32，對照組豬的抗體均≤1:4。攻毒保護(hù)結(jié)果表明，免疫組豬的攻毒保護(hù)率均為4/5～5/5，對照豬的發(fā)病率為4/5～5/5。詳見表12。表12豬副豬嗜血桿菌病四價(jià)滅活疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果注:分子注:分子指保護(hù)仔豬數(shù)，分母指攻毒仔豬總數(shù)。上述結(jié)果表明本發(fā)明制備的疫苗對豬副豬嗜血桿菌具有很好的免疫效果。當(dāng)前第1頁1 2 3