雙基因缺失的副豬嗜血桿菌及其構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的雙基因缺失株，菌株保藏號(hào)為：CCTCC?NO:M2013460。本發(fā)明主要是利用現(xiàn)代基因工程原理和分子生物學(xué)手段對(duì)Hps潛在的毒力因子aroA基因和omp2基因進(jìn)行缺失，構(gòu)建Hps不含抗性標(biāo)記的雙基因缺失菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及致病力等進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研制新型高效可提供高交叉保護(hù)效力的基因工程活疫苗打下基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雙基因缺失的副豬嗜血桿菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]副豬嗜血桿菌病是近年來(lái)嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜腦炎等，發(fā)病率一般為10-15%，死亡率可達(dá)50%以上，引起了人們的日益重視。該病的致病菌副豬嗜血桿菌(Hps)的血清型復(fù)雜多樣，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn (KRG)瓊脂擴(kuò)散血清分型方法，至少可將Hps分為15個(gè)血清型，另有20%以上的分離株血清型不可定。己有的資料表明，Hps具有明顯的地方性特征，基于某個(gè)或某些特定血清型菌株的全菌體制備的滅活疫苗在不同血清型之間所產(chǎn)生的交叉保護(hù)率很低，急待研制具有高效交叉保護(hù)力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是當(dāng)前多數(shù)傳染病的研究熱點(diǎn)。
[0003]目前關(guān)于Hps的致病機(jī)理尚不清楚，aroA基因和omp2基因被認(rèn)為是Hps的潛在毒力基因，在其它細(xì)菌中有較深的研究報(bào)道。aroA基因是細(xì)菌芳香族氨基酸代謝通路中一個(gè)非常重要的酶，該酶活性的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力降低等生物學(xué)變化，已被應(yīng)用于多種細(xì)菌的缺失弱毒疫苗的構(gòu)建。omp2在流感嗜血桿菌定殖中發(fā)揮重要作用，且已被證實(shí)與人的粘蛋白的特定成分結(jié)合，是細(xì)菌侵入機(jī)體過(guò)程中一個(gè)重要的因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要是利用現(xiàn)代基因工程原理和分子生物學(xué)手段對(duì)Hps潛在的毒力因子aroA基因和omp2基因進(jìn)行缺失，構(gòu)建Hps不含抗性標(biāo)記的雙基因缺失菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及致病力等進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研制新型高效可提供高交叉保護(hù)效力的基因工程活疫苗打下基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，構(gòu)建一種副豬嗜血桿菌的變異株，用于制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病滅活疫苗。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于雙基因缺失的副豬嗜血桿菌的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的又一目的在于雙基因缺失的副豬嗜血桿菌在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0008]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的雙基因缺失株，菌株保藏號(hào)為=CCTCCN0:M2013460。該菌株于2013年9月29日由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心接受保藏，并于2013年10月9日檢測(cè)存活，該菌株保藏名稱(chēng)為副豬嗜血桿菌⑶-1;保藏中心地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編為430072。
[0010]一種雙基因缺失的副豬 嗜血桿菌的構(gòu)建方法，其步驟如下:[0011]A)基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建:參照GenBank中aroA、omp2基因的序列，從HlO中擴(kuò)增了 aroA和omp2基因的上下游片段。將得到的上下游片段，連接到攜帶蔗糖敏感基因(SacB)的自殺性質(zhì)粒pEM0C2上，構(gòu)建缺失了第394131-394631位核苷酸的aroA基因的重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ aroA和第181258-181643位核苷酸的omp2基因的重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ omP2 ；
[0012]B)接合轉(zhuǎn)移與副豬嗜血桿菌單基因缺失株的構(gòu)建:以轉(zhuǎn)化了上述重組自殺性質(zhì)粒pEM AaroA的大腸桿菌β 2155為供體菌，血清5型菌株HlO為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，進(jìn)行第一次PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中，鑒定正確的接合子在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生，涂布含10%蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并進(jìn)行第二次PCR鑒定，確定發(fā)重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失，從而構(gòu)建出aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸的單基因缺失株HS02 ；
[0013]C)副豬嗜血桿菌雙基因缺失株的構(gòu)建:用轉(zhuǎn)化了上述重組自殺性質(zhì)粒pEMAomP2的大腸桿菌β 2155為供體菌，上述單基因缺失株HS02為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，進(jìn)行第一次PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中，鑒定正確的接合子在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生，涂布含10%蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并進(jìn)行第二次PCR鑒定，確定發(fā)重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失，從而構(gòu)建構(gòu)建aroA基因缺失第394131-394631位基因和omp2基因缺失181258-181643雙基因缺失的菌株。
[0014]上述構(gòu)建方法中，步驟B)接合轉(zhuǎn)移與副豬嗜血桿菌單基因缺失株的構(gòu)建過(guò)程中，第一次PCR鑒定時(shí)，所用的上游引物為SEQ ID N0:5，下游引物為SEQ ID N0:6;第二次PCR鑒定上游引物為SEQ ID N0:7，下游引物為SEQ ID N0:8。
[0015]上述構(gòu)建方法中，步驟C)副豬嗜血桿菌雙基因缺失株的構(gòu)建中，第一次PCR鑒定時(shí)，上游引物為SEQ ID N0:9，下游引物為SEQ ID NO: 10，第二次PCR鑒定上游引物為SEQID N0:7，下游引物為 SEQ ID N0:8。
[0016]上述構(gòu)建方法中，所述基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建具體步驟如下:
[0017]DHps的增殖及其基因組的提取:取凍干保存的副豬嗜血桿菌接種于TSB振搖培養(yǎng)過(guò)夜；再取菌液劃線于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板，于37 °C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜；取上述菌液至EP管中，離心后棄上清，倒置EP管于吸水紙上吸干管中殘余水分；沉淀重懸于TE中，加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小時(shí)；加入NaCl溶液、10% SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K，48_52°C水浴中作用2_4h ;用槍頭將混合液均分到兩個(gè)新的EP管中，加入與菌液等體積的酚、氯仿以及異戊醇的混合液抽提兩次；抽提后用異丙醇于_15°C以下的冰箱中沉淀，離心后棄上清，用預(yù)冷的乙醇洗滌兩次；室溫干燥后，用含20yg/mLRNAase的TE溶解DNA，用于PCR反應(yīng)中作模板；
[0018]2)核酸物質(zhì)的膠回收純化:上述DNA注入瓊脂糖凝膠的梳空內(nèi)，放入電泳槽中電泳15-20min ;在紫外燈下切下所需的目的片段，然后放入離心管中，加入等倍凝膠體積的Binding Buffer,把混合物置于55°C~65°C水浴中溫浴凝膠完全融化；將DNA-瓊脂糖溶液轉(zhuǎn)移到HiBindDNA柱子中，并把HiBindDNA柱子裝入收集管內(nèi)，室溫下離心處理，棄去濾液；將空柱子重新套回收集管中，離心甩干柱子中殘余的液體；把柱子裝在離心管上，加入洗脫液或滅菌水到柱子的膜中央上，離心后得到的溶液即純化的DNA產(chǎn)物；
[0019]3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:采用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；
[0020]4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:將上述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞加入純化的DNA產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)溶物，冰浴后于37-45°C的水浴中熱激后；快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻；加入SOC培養(yǎng)基，于搖床上搖動(dòng)細(xì)胞使細(xì)菌復(fù)壯；取復(fù)壯的菌液平鋪到含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，待液體被完全吸干之后于35-42°C倒置培養(yǎng)；
[0021]5)質(zhì)粒的制備:將步驟4)中導(dǎo)致培養(yǎng)后的腸桿菌接種于含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，搖床中振搖培養(yǎng)；將菌液分裝到EP管中，室溫下離心后棄掉上清，收集菌體；加入Sollution I /RNase混合液,充分重懸管底的細(xì)胞沉淀；往細(xì)胞懸液中加入Sollution II,顛倒EP管3-6次，往混合液中加入Sollution III，顛倒數(shù)次至混勻，直到形成白色絮狀沉淀；室溫下連續(xù)離心處理，棄去濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，室溫下離心以甩干柱子；將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，往DNA結(jié)合膜中央加入Elution Buffer或無(wú)菌雙蒸水，室溫下靜置，離心，管底的洗脫液即所需的質(zhì)粒溶液；
[0022]6)重組質(zhì)粒的鑒定:采用PCR快速鑒定法或常規(guī)常規(guī)鑒定法多上述質(zhì)粒溶液進(jìn)行鑒定，挑選鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子接種于含抗生素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，然后用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，抽提出來(lái)的質(zhì)粒溶液用限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化，消化后于
0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察酶切產(chǎn)生的條帶；
[0023]7)菌株H10aroA 、omP2基因前后壁的克隆:參照Hps SHO165中aroA基因及上游和下游序列分別設(shè)計(jì)aroA前臂的上游引物SEQ ID N0:1、下游引物SEQ ID N0:2和aroA后臂的上游引物SEQ ID N0:3、下游引物SEQ ID NO:4，分別擴(kuò)增aroA基因的前臂和后臂，其中前臂的上游引物SEQ ID NO:1上加入酶切位點(diǎn)Not I，下游引物SEQ ID N0:2上加入酶切位點(diǎn)Bgl II ;后臂的上游引物SEQ ID N0:3加入酶切位點(diǎn)Bgl II，下游引物SEQ ID N0:4加入酶切位點(diǎn)Sal I。前臂的上游引物SEQ ID NO:1位于aroA的上游基因ppc上，下游引物SEQ ID N0:2位于aroA基因的上游，PCR擴(kuò)增出的片段Λ aroA_UP大小為710bp，橫跨ppc基因和aroA基因；后臂的上游引物Δ aroA-3位于aroA基因的下游,下游引物AaroA-^i于aroA基因的下游基因cspD上，擴(kuò)增出的片段AaroA-DN大小為1281bp ;PCR擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化之后，與PMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T- Δ aroA-UP和pMD18_T- Δ aroA-DN ;平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落經(jīng)PCR鑒定，質(zhì)粒pMD18-T-AaroA-UP用引物SEQ ID NO:1/SEQ ID NO: 2反應(yīng)，pMD18-T-AaroA-DN用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4反應(yīng)，PCR結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，PMD18-T-Λ aroA-UP先用Not I和Bgl II雙酶切鑒定，再用Not I和Sal I雙酶切鑒定；PMD18-T-AaroA-DN用Bgl II和Sal I雙酶切鑒定；酶切產(chǎn)生正確片段的克隆子測(cè)序；
[0024]8)中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD18-T- Δ aroA、pMD18_T_ Δ ompP2的構(gòu)建及鑒定:步驟7)中測(cè)序正確的克隆子抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒pMD18-T-AaroA-UP經(jīng)Bgl II和Sal I雙酶切回收線性 pMD18-T- Δ aroA-UP,質(zhì)粒 pMD18_T_ Δ aroA-DN 經(jīng) Bgl II 和 Sal I 雙酶切之后回收Δ aroA-DN,再將有著相同黏性末端的線性pMD18_T_ Δ aroA-UP與Λ aroA-DN用T4連接酶連接起來(lái)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，構(gòu)建成中間質(zhì)粒pMD18-T-AaroA ;平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落經(jīng)PCR鑒定，用引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:4反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子抽提質(zhì)粒用Not I和Sal I雙酶切鑒定；酶切產(chǎn)生正確片段的克隆子測(cè)序；
[0025]9)重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜΔ aroA、ρΕΜ Δ omP2的構(gòu)建:測(cè)序正確的克隆子抽提質(zhì)粒，并用Not I和Sal I雙酶切，回收片段Λ aroA-UP-DN，自殺性pEM0C2同樣用Not I和Sal I雙酶切，回收大片段，再將Λ aroA-UP-DN與pEM0C2用T4連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ aroA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌β 2155，涂布含有Cm和DAP的LB平板，挑取長(zhǎng)出來(lái)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:4反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性的菌落抽提質(zhì)粒Not I和Sal I雙酶切鑒定。
[0026]步驟5)中，室溫下連續(xù)離心處理具體步驟為:室溫下離心Imin ;將濾液重新過(guò)一次HiBind DNA結(jié)合柱；棄掉濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，加入HB Buffer，室溫下離心Imin,棄去濾液；將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管,加入DNA Wash Buffer,室溫下離心lmin，棄去濾液；重復(fù)上述步驟一次，棄去濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管。[0027]一種利用上述雙基因缺失的副豬嗜血桿菌制備的預(yù)防副豬嗜血桿菌病的疫苗。
[0028]所述疫苗含有a含有aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的雙基因缺失副豬嗜血桿菌。
[0029]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明利用現(xiàn)代基因工程原理和分子生物學(xué)手段對(duì)Hps潛在的毒力因子aroA基因和omp2基因進(jìn)行缺失，構(gòu)建Hps不含抗性標(biāo)記的雙基因缺失菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及致病力等進(jìn)行探討，為進(jìn)一步研制新型高效可提供高交叉保護(hù)效力的基因工程活疫苗打下基礎(chǔ)；本發(fā)明通過(guò)雙基因缺失株對(duì)豚鼠的免疫試驗(yàn)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)，雙基因缺失的弱毒菌株HS03在豚鼠中的免疫效力優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗。
[0030]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1位副豬嗜血桿菌SH0165aroA基因及其上下游基因相對(duì)位置示意圖；
[0032]圖2為中間質(zhì)粒18T-Λ aroA-UP-DN的構(gòu)建示意圖；
[0033]圖3為自殺性質(zhì)粒ρΕΜ- Δ aroA_UP-DN的構(gòu)建示意圖；
[0034]圖4為自殺性質(zhì)粒ρΕΜ- Δ omp2-UP-DN的構(gòu)建示意圖；
[0035]圖5為單基因缺失株HS02的構(gòu)建路線圖；
[0036]圖6為aroA基因前后臂片段的擴(kuò)增結(jié)果圖，其中A為aroA前臂擴(kuò)增結(jié)果，B為aroA gene后臂擴(kuò)增結(jié)果；
[0037]圖7為aroA基因前后臂片段的克隆酶切鑒定結(jié)果圖，A為pMD18-T-AaroA-UP鑒定結(jié)果，B為pMD18_T_ Δ aroA-DN鑒定結(jié)果
[0038]圖8為質(zhì)粒18T-AaroA_UP酶切鑒定結(jié)圖果，A為pMD18-T_AaroA PCR鑒定結(jié)果，BI 為 pMD18-T-AaroA (Not I +Sal I )鑒定結(jié)果，B2 為 pMD18_T_ Λ aroA (Not I +Bgl II)R 鑒定結(jié)果，B3 為 pMD18-T- Δ aroA (Bgl II +Sal I ) R 鑒定結(jié)果；
[0039]圖9為質(zhì)粒pEM0C2- Δ aroA-UP酶切鑒定結(jié)果圖，Al_2為pEM0C2雙酶切(Not I +Sal I)結(jié)果，A3-4:為 pMD18_T_ Λ aroA 雙酶切(Not I +Sal I )結(jié)果，B1-3 為pEM0C2-AaroA 雙酶切(Not I +Sal I )結(jié)果;
[0040]圖10為omp2基因前臂片段的擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0041]圖11為omp2基因后臂片段的擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0042]圖12 為質(zhì)粒 pl8T-Aomp2 酶切鑒定結(jié)果圖，I 為 pMD18-T-Aomp2(Not I +Sal I)結(jié)果，2 為 pMD18-T-Aomp2 (Not I +Bgl II )結(jié)果，3 為 pMD18_T_ Λ 0mp2 (Bgl II +Sal I)結(jié)果;
[0043]圖13為質(zhì)粒pEM0C2-Aomp2酶切鑒定結(jié)果，1-3:pEM0C2-Δ omp2雙酶切(Not I+Sal I )結(jié)果；
[0044]圖14為質(zhì)粒pEM0C2- Δ omp2PCR鑒定結(jié)果；
[0045]圖15為擴(kuò)增Cm基因鑒定接合子電泳結(jié)果圖；
[0046]圖16為引物paroA-Ι和paroA_2PCR鑒定AaroA單交換接合子電泳結(jié)果圖；
[0047]圖17為引物paroA-Ι和paroA_2PCR鑒定Δ aroA缺失株電泳結(jié)果圖；
[0048]圖18為引物paroA-Ι和paroA_2PCR鑒定Δ aroA缺失株HS02的穩(wěn)定性電泳結(jié)果圖；
[0049]圖19為引物P omp2-l和p omp2_lPCR鑒定Aomp2單交換接合子電泳結(jié)果圖；
[0050]圖20為引物P omp2-l和p omp2_2PCR鑒定Aomp2缺失株電泳圖；
[0051]圖21為引物P omp2-l和p om p2_2PCR鑒定Δ omp2缺失株HS03的穩(wěn)定性電泳圖；
[0052]圖22為突變株和親本株的生長(zhǎng)曲線圖；
[0053]圖23為用HPS引物擴(kuò)增鑒定接種豚鼠回收的HPS后的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054]在本發(fā)明中，大腸桿菌DH5a由本試驗(yàn)室保存；PCR產(chǎn)物克隆載體pMD18_T購(gòu)自大連寶生物公司；本發(fā)明中所釆用的所有引物見(jiàn)表1。
[0055]表1:本發(fā)明所用引物
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種雙基因缺失的副豬嗜血桿菌，其特征在于:其是菌株的aroA基因缺失第394131- 394631核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的雙基因缺失株，菌株保藏號(hào)為:CCTCC NO: M2013460。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雙基因缺失的副豬嗜血桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，其步驟如下: A)基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建:參照GenBank中aroA、omp2基因的序列，從HlO中擴(kuò)增了 aroA和omp2基因的上下游片段；將得到的上下游片段，連接到攜帶蔗糖敏感基因(SacB)的自殺性質(zhì)粒pEM0C2上，構(gòu)建缺失第394131- 394631位核苷酸的aroA基因的重組自殺性質(zhì)粒pEM AaroA和缺失第181258- 181643位核苷酸的omp2基因的重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ omp2 ； B)接合轉(zhuǎn)移與副豬嗜血桿菌單基因缺失株的構(gòu)建:以轉(zhuǎn)化了上述重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ aroA的大腸桿菌β 2155為供體菌，血清5型菌株HlO為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，進(jìn)行第一次PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中，鑒定正確的接合子在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生，涂布含10%蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并進(jìn)行第二次PCR鑒定，確定發(fā)重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失，從而構(gòu)建出aroA基因缺失第394131- 394631位核苷酸的單基因缺失株HS02 ； C)副豬嗜血桿菌雙基因缺失株的構(gòu)建:用轉(zhuǎn)化了上述重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜΔοπιρ2的大腸桿菌β 2155為供體菌，上述單基因缺失株HS02為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10%蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，進(jìn)行第一次PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中，鑒定正確的接合子在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使`第二次同源重組的發(fā)生，涂布含10%蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并進(jìn)行第二次PCR鑒定，確定發(fā)重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失，從而構(gòu)建構(gòu)建aroA基因缺失第394131- 394631位基因和omp2基因缺失181258- 181643雙基因缺失的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟B)接合轉(zhuǎn)移與副豬嗜血桿菌單基因缺失株的構(gòu)建過(guò)程中，第一次PCR鑒定時(shí)，所用的上游引物為SEQ ID N0:5，下游引物為SEQ ID N0:6 ;第二次PCR鑒定上游引物為SEQ ID NO: 7，下游引物為SEQ ID N0:8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟C)副豬嗜血桿菌雙基因缺失株的構(gòu)建中，第一次PCR鑒定時(shí)，上游引物為SEQ ID N0:9，下游引物為SEQ ID NO: 10，第二次PCR鑒定上游引物為SEQ ID N0:7，下游引物為SEQ ID N0:8。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建具體步驟如下: DHps的增殖及其基因組的提取:取凍干保存的副豬嗜血桿菌接種于TSB振搖培養(yǎng)過(guò)夜；再取菌液劃線于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板，于37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜；取上述菌液至EP管中，離心后棄上清，倒置EP管于吸水紙上吸干管中殘余水分；沉淀重懸于TE中，加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小時(shí)；加入NaCl溶液、10% SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K，48-52°C水浴中作用2_4h ;用槍頭將混合液均分到兩個(gè)新的EP管中，加入與菌液等體積的酚、氯仿以及異戊醇的混合液抽提兩次；抽提后用異丙醇于-15°C以下的冰箱中沉淀，離心后棄上清，用預(yù)冷的乙醇洗滌兩次；室溫干燥后，用含20mg/mLRNAase的TE溶解DNA，用于PCR反應(yīng)中作模板； ，2 )核酸物質(zhì)的膠回收純化:上述D NA注入瓊脂糖凝膠的梳空內(nèi)，放入電泳槽中電泳15-20min ;在紫外燈下切下所需的目的片段，然后放入離心管中，加入等倍凝膠體積的Binding Buffer，把混合物置于55°C~65°C水浴中溫浴凝膠完全融化；將DNA-瓊脂糖溶液轉(zhuǎn)移到HiBindDNA柱子中，并把HiBindDNA柱子裝入收集管內(nèi)，室溫下離心處理，棄去濾液；將空柱子重新套回收集管中，離心甩干柱子中殘余的液體；把柱子裝在離心管上，加入洗脫液或滅菌水到柱子的膜中央上，離心后得到的溶液即純化的DNA產(chǎn)物； ，3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:采用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞； ，4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:將上述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞加入純化的DNA產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)溶物，冰浴后于37-45°C的水浴中熱激后；快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻；加入SOC培養(yǎng)基，于搖床上搖動(dòng)細(xì)胞使細(xì)菌復(fù)壯；取復(fù)壯的菌液平鋪到含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，待液體被完全吸干之后于35-42°C倒置培養(yǎng)； ，5)質(zhì)粒的制備:將步驟4)中導(dǎo)致培養(yǎng)后的腸桿菌接種于含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，搖床中振搖培養(yǎng)；將菌液分裝到EP管中，室溫下離心后棄掉上清，收集菌體；加入Sollution I /RNase混合液,充分重懸管底的細(xì)胞沉淀；往細(xì)胞懸液中加入Sollution II,顛倒EP管3-6次，往混合液中加入Sollution III，顛倒數(shù)次至混勻，直到形成白色絮狀沉淀；室溫下連續(xù)離心處理，棄去濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，室溫下離心以甩干柱子；將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，往DNA結(jié)合膜中央加入Elution Buffer或無(wú)菌雙蒸水，室溫下靜置，離心，管底的洗脫液即所需的質(zhì)粒溶液； ，6)重組質(zhì)粒的鑒定:采用PCR快速鑒定法或常規(guī)常規(guī)鑒定法多上述質(zhì)粒溶液進(jìn)行鑒定，挑選鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子接種于含抗生素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，然后用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，抽提出來(lái)的質(zhì)粒溶液用限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化，消化后于0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈 下觀察酶切產(chǎn)生的條帶； ，7)菌株HlOaroA、omP2基因前后壁的克隆:參照Hps SHO165中aroA基因及上游和下游序列分別設(shè)計(jì)aroA前臂的上游引物SEQ ID N0:1、下游引物SEQ ID N0:2和aroA后臂的上游引物SEQ ID N0:3、下游引物SEQ ID NO:4，分別擴(kuò)增aroA基因的前臂和后臂，其中前臂的上游引物SEQ ID NO:1上加入酶切位點(diǎn)Not I，下游引物SEQ ID N0:2上加入酶切位點(diǎn)Bgl II ;后臂的上游引物SEQ ID N0:3加入酶切位點(diǎn)Bgl II，下游引物SEQ ID N0:4加入酶切位點(diǎn)Sal I ;前臂的上游引物SEQ ID NO:1位于aroA的上游基因ppc上，下游引物SEQID NO: 2位于aroA基因的上游，PCR擴(kuò)增出的片段Λ aroA_UP大小為710bp，橫跨ppc基因和aroA基因；后臂的上游引物Δ aroA-3位于aroA基因的下游,下游引物AaroA_4位于aroA基因的下游基因cspD上，擴(kuò)增出的片段AaroA-DN大小為1281bp ;PCR擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化之后，與PMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T- Δ aroA-UP和pMD18_T- Δ aroA-DN ;平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落經(jīng)PCR鑒定，質(zhì)粒pMD18-T-AaroA-UP用引物SEQ ID NO:1/ SEQ ID NO:2反應(yīng)，pMD18-T-AaroA-DN用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4反應(yīng)，PCR結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，PMD18-T-Λ aroA-UP先用Not I和Bgl II雙酶切鑒定，再用Not I和Sal I雙酶切鑒定；PMD18-T-AaroA-DN用Bgl II和Sal I雙酶切鑒定；酶切產(chǎn)生正確片段的克隆子測(cè)序； 8)中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD18-T-AaroA、pMD18_T_ΛompP2的構(gòu)建及鑒定:步驟7)中測(cè)序正確的克隆子抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒pMD18-T-AaroA-UP經(jīng)Bgl II和Sal I雙酶切回收線性 pMD18-T- Δ aroA-UP,質(zhì)粒 pMD18_T_ Δ aroA-DN 經(jīng) Bgl II 和 Sal I 雙酶切之后回收Δ aroA-DN,再將有著相同黏性末端的線性pMD18_T_ Δ aroA-UP與Λ aroA-DN用T4連接酶連接起來(lái)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，構(gòu)建成中間質(zhì)粒pMD18-T-AaroA ;平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落經(jīng)PCR鑒定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:4反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子抽提質(zhì)粒用Not I和Sal I雙酶切鑒定；酶切產(chǎn)生正確片段的克隆子測(cè)序； 9)重組自殺性質(zhì)粒ρΕΜΛaroA、ρΕΜΛ omP2的構(gòu)建:測(cè)序正確的克隆子抽提質(zhì)粒，并用Not I和Sal I雙酶切，回收片段AaroA-UP-DN，自殺性pEM0C2同樣用Not I和Sal I雙酶切，回收大片段，再將Λ aroA-UP-DN與pEM0C2用T4連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建自殺性質(zhì)粒ρΕΜ Δ aroA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌β 2155，涂布含有Cm和DAP的LB平板，挑取長(zhǎng)出來(lái)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:4反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性的菌落抽提質(zhì)粒Not I和Sal I雙酶切鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟5)中，室溫下連續(xù)離心處理具體步驟為:室溫下離心Imin ;將濾液重新過(guò)一次HiBind DNA結(jié)合柱；棄掉濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，加入HB Buffer,室溫下離心Imin,棄去濾液；將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管，加入DNA Wash Buffer,室溫下離心lmin,棄去濾液；重復(fù)上述步驟一次,棄去濾液，將HiBind DNA結(jié)合柱裝回收集管。
7.一種利用權(quán)利要求1所述的雙基因缺失的副豬嗜血桿菌制備的預(yù)防副豬嗜血桿菌病的疫苗。`
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于:其含有aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的雙基因缺失副豬嗜血桿菌。
【文檔編號(hào)】C12N15/74GK103865834SQ201310518321
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】賈愛(ài)卿, 王貴平 申請(qǐng)人:廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司