方法
【專利摘要】由包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群制備用于臨床應(yīng)用的治療性細(xì)胞群的方法，所述方法包括從起始細(xì)胞群中分離基本不表達(dá)CD38但表達(dá)CD34的細(xì)胞群，并用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。
【專利說(shuō)明】
方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及造血干細(xì)胞(HSC)和造血祖細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及用于HSC的基因修飾的改進(jìn)方法。本發(fā)明還涉及用于基因修飾的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在基因療法中的用途的改進(jìn)方法。
[0002]發(fā)明背景造血系統(tǒng)是不同的成熟細(xì)胞譜系的細(xì)胞的復(fù)雜層次結(jié)構(gòu)。這些包括提供對(duì)病原體的防護(hù)的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、攜帶氧通過(guò)身體的細(xì)胞以及涉及傷口愈合的細(xì)胞。所有這些成熟細(xì)胞來(lái)自于能夠自我更新并分化成任何血細(xì)胞譜系的造血干細(xì)胞(HSC)的池。
[0003]由于HSC能夠補(bǔ)充整個(gè)造血系統(tǒng)，它們可用于移植，例如在血液毒性損傷如放療或化療之后，或用于更換白血病細(xì)胞。
[0004]造血細(xì)胞移植(HCT)是對(duì)數(shù)種遺傳性和獲得性疾病的治愈性療法。但是，同種異體 HCT受限于匹配供體的低可獲得性，以及與同種異體程序相關(guān)的死亡率，其大多涉及移植物抗宿主疾病(GvHD)和深遠(yuǎn)且持久的免疫功能紊亂狀態(tài)所引發(fā)的感染性并發(fā)癥。
[0005]基于移植基因改造的自體HSC的基因治療途徑提供了超出同種異體HCT的潛在改善的安全性和有效性。它們對(duì)缺少匹配的供體的患者尤其重要。
[0006]干細(xì)胞基因療法的概念基于較少數(shù)量的干細(xì)胞的基因修飾。這些在體內(nèi)通過(guò)進(jìn)行自我更新而長(zhǎng)期存留，并生成大量基因“修正的”后代。這確保了在患者的余生持續(xù)供應(yīng)修正的細(xì)胞。HSC對(duì)基因療法是特別有吸引力的目標(biāo)，因?yàn)樵谒鼈兎只瘯r(shí)，它們的基因修飾將傳遞至所有血細(xì)胞譜系。此外，HSC可以容易和安全地獲自例如骨髓、動(dòng)員的外周血和臍帶血。
[0007] HSC及其后代的有效的長(zhǎng)期基因修飾需要能夠?qū)⑿Ｕ鼶NA穩(wěn)定整合到基因組中而不影響HSC功能的技術(shù)。
[0008]長(zhǎng)期的益處需要移植足夠高數(shù)量的修飾的HSC，其可以重新填充經(jīng)調(diào)整的骨髓，產(chǎn)生所有造血譜系的修正的血細(xì)胞。自體HSC因此令移植程序可用于所有患者，避免導(dǎo)致GvHD 的免疫相容性問(wèn)題，并允許最低限度的免疫抑制調(diào)節(jié)療法，由此大大減少感染性并發(fā)癥。
[0009]基于慢病毒的HSC基因療法試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了它們?cè)谥委熯z傳疾病方面的治療潛力。但是，用于HSC的基因修飾的方法仍困難重重。
[0010]現(xiàn)有的HSC基因療法方案(例如Cartier N等人，Science 2009;326:818-823; Cavazzana-Calvo M等人，Nature 2010; 467:318-322 ;Biffi A等人，Science 2013; 341: 1233158;Aiuti A等人，Science.2013;341:1233151)在HSC基因修飾過(guò)程中使用2-4天的體外培養(yǎng)。更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間通常產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。但是，體外培養(yǎng)不利地影響HSC功能， 并且這種負(fù)面影響明顯與培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間相關(guān)聯(lián)(Guenechea G等人，Blood 1999;93: 1097-1105;Xu R等人，Transfus1n 2001 ;41:213-218;Mazurier F等人，Blood 2004; 103:545-552;Ahmed等人，Blood 2004;103:2079-2087;GlimmH等人，Exp.Hematol.2005;33:20-25;Kallinikou K等人，Br.J.Haematol.2012;158:778-787)。盡管對(duì)改善 HSC的體外擴(kuò)增已經(jīng)取得了一些進(jìn)展(Zhang CC等人，Blood 2008;111:3415-3423;Boitano AE等人，Science 2010;329:1345_1348;Delaney C等人，Nat.Med.2010; 16: 232-236;Himburg HA等人，Nat.Med.2010; 16:475-482;Csaszar E等人，Cell Stem Cell 2012;10:218-229;WalasekMA等人，Ann.N.Y.Acad.Sc1.2012;1266:138-150)，所得方案對(duì)臨床轉(zhuǎn)化存在一些挑戰(zhàn)，給出變數(shù)并常常給出再現(xiàn)性不佳的結(jié)果，并仍需要在相關(guān)的臨床情況下得到證實(shí)。因此，在HSC基因療法背景下的體外培養(yǎng)應(yīng)保持盡可能短。[〇〇11]因此，需要設(shè)計(jì)能夠獲得造血干細(xì)胞的有效基因修飾同時(shí)最大程度縮短培養(yǎng)時(shí)間的改進(jìn)方案。此外，該改進(jìn)方案必須適于臨床應(yīng)用。
[0012]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 我們已經(jīng)預(yù)料不到地顯示，當(dāng)⑶34+⑶38— HSC以高純度呈現(xiàn)時(shí)經(jīng)歷更有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了以適于臨床應(yīng)用的方式純化和轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞的方案。[〇〇14] 我們還發(fā)現(xiàn)，前列腺素E2及其衍生物提高了基因轉(zhuǎn)移到⑶34+和⑶34+CD38- HSC中的效率。
[0015]這些預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，這能夠減少施加的載體量并最大程度減少體外培養(yǎng)。
[0016]由這些發(fā)現(xiàn)繼續(xù)，我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于轉(zhuǎn)導(dǎo)的、高度純化的長(zhǎng)期再植細(xì)胞(例如表達(dá)⑶34而不表達(dá)⑶38的細(xì)胞)與未經(jīng)處理的祖細(xì)胞(例如表達(dá)⑶38的細(xì)胞)的共同移植的創(chuàng)新方案。該方案可以通過(guò)以下手段改善基因療法的安全性和有效性:1.提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；2.減少轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的細(xì)胞數(shù)量，這導(dǎo)致了較低的灌注到受試者中所需的整合負(fù)荷；3.確保了快速造血恢復(fù)。
[0017]此外，我們還開(kāi)發(fā)了基于轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血祖細(xì)胞的移植的創(chuàng)新方案。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了由包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群制備用于臨床應(yīng)用的治療性細(xì)胞群的方法，所述方法包括從起始細(xì)胞群中分離基本不表達(dá)CD38但表達(dá)CD34 的細(xì)胞群，并用載體，優(yōu)選用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞群以獲得治療性細(xì)胞群。
[0019]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟:a.從包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群分離表達(dá)CD38的細(xì)胞；b.從不表達(dá)⑶38的步驟(a)中獲得的細(xì)胞群中分離表達(dá)⑶34的細(xì)胞；c.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟(b)中獲得的表達(dá)CD34的細(xì)胞群以獲得治療性細(xì)胞群。
[0020]在另一實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟:a.使包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群與CD38反應(yīng)性試劑接觸；b.使CD38反應(yīng)性細(xì)胞與CD38非反應(yīng)性細(xì)胞分離；c.使步驟(b)中獲得的CD38非反應(yīng)性細(xì)胞與CD34反應(yīng)性試劑接觸；d.使CD34反應(yīng)性細(xì)胞與CD34非反應(yīng)性細(xì)胞分離，其中該CD34反應(yīng)性細(xì)胞構(gòu)成轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群；e.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群以獲得治療性細(xì)胞群。[〇〇21] 該治療性細(xì)胞群可能具有⑶34+⑶38_表型。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包含相關(guān)核苷酸，或本身為相關(guān)核苷酸。[〇〇23]在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的表達(dá)CD38的細(xì)胞或CD38反應(yīng)性細(xì)胞或其一部分被保留以形成支持細(xì)胞群。該支持細(xì)胞群可以具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)該細(xì)胞大約44小時(shí)或更久?！坝幂d體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟”理解為預(yù)刺激和載體暴露階段。例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約44-66小時(shí)、44-60小時(shí)、44-54小時(shí)或44-48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約66、60、54、48或44小時(shí)。
[0025]在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)該細(xì)胞(即在預(yù)刺激和載體接觸過(guò)程中)小于大約44小時(shí)。例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約12-42小時(shí)、12-36小時(shí)、12-24小時(shí)或12-18小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約42、36、30、24、18或12小時(shí)。在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中， 細(xì)胞群優(yōu)選培養(yǎng)大約24小時(shí)。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺素E2或其衍生物用于本發(fā)明的方法以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。[〇〇27]前列腺素￡2或前列腺素￡2衍生物(例如16，16-二甲基前列腺素￡2((11^6￡2))可以在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，優(yōu)選在該步驟的預(yù)刺激階段過(guò)程中添加到細(xì)胞群中。前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在預(yù)刺激階段開(kāi)始時(shí)或在預(yù)刺激階段過(guò)程中加入。例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在細(xì)胞群暴露于載體之前大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11或12小時(shí)加入。優(yōu)選地，在預(yù)刺激階段過(guò)程中，在細(xì)胞暴露于載體之前大約2小時(shí)將該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物加入到細(xì)胞群中。在另一實(shí)施方案中，在暴露于載體的同時(shí)將該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物加入到細(xì)胞群中。
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群獲自組織樣本。
[0029]在另一實(shí)施方案中，包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群獲自動(dòng)員的外周血、骨髓或臍帶血。
[0030]在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的治療性細(xì)胞群。
[0031]在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的支持細(xì)胞群。
[0032]在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的治療性細(xì)胞群或支持細(xì)胞群的藥物組合物，優(yōu)選在可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的存在下。[〇〇33]在另一方面，本發(fā)明提供了用于藥物的治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療性細(xì)胞群與本發(fā)明的支持細(xì)胞群組合施用。
[0035]在另一實(shí)施方案中，在施用該支持細(xì)胞群之前向受試者施用該治療性細(xì)胞群。
[0036]在另一實(shí)施方案中，該治療性細(xì)胞群與支持細(xì)胞群的施用同時(shí)期或同時(shí)地施用于受試者。
[0037]在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和支持細(xì)胞群的試劑盒。
[0038]在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，包括向需要其的受試者施用本發(fā)明的治療性細(xì)胞群。
[0039]在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，包括向需要其的受試者施用本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和本發(fā)明的支持細(xì)胞群。
[0040]優(yōu)選地，該治療是通過(guò)基因療法進(jìn)行的治療。
[0041]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0042]用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟可以例如采用本文中描述的任何細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。[〇〇43]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已經(jīng)從包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群中分離并隨后用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。[〇〇44] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int表型。在另一實(shí)施方案中， 該造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int1、⑶34+⑶38int2和/或⑶34+⑶38+表型。由此該造血祖細(xì)胞群可以例如不包含⑶34+CD38_表型的細(xì)胞。[〇〇45]在另一實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)祖細(xì)胞群與造血干細(xì)胞群，例如具有⑶34+⑶3K表型的細(xì)胞群組合施用。
[0046]在另一方面，本發(fā)明提供基因治療方法，包括向需要其的受試者施用造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0047]在另一方面，本發(fā)明提供了在患者中控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間的方法，其中通過(guò)根據(jù)CD38表達(dá)水平選擇性施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞來(lái)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。提高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)施用具有降低的CD28表達(dá)水平的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0048]在另一方面，本發(fā)明提供了在用載體，優(yōu)選病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞時(shí)前列腺素E2或前列腺素E2衍生物用于提高基因轉(zhuǎn)移效率的用途。[〇〇49]在一個(gè)實(shí)施方案中，該前列腺素E2衍生物是16,16-二甲基前列腺素E2。[〇〇5〇]前列腺素￡2或前列腺素￡2衍生物(例如16，16-二甲基前列腺素￡2((11^6￡2))可以在預(yù)刺激階段過(guò)程中加入到細(xì)胞群中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在預(yù)刺激階段開(kāi)始時(shí)加入。在另一實(shí)施方案中，該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在預(yù)刺激階段過(guò)程中加入。[〇〇51]例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在細(xì)胞群暴露于載體之前大約1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11或12小時(shí)加入。優(yōu)選地，該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物在預(yù)刺激階段過(guò)程中，在細(xì)胞暴露于載體之前大約2小時(shí)加入到細(xì)胞群中。[〇〇52]在另一實(shí)施方案中，該前列腺素E2或前列腺素E2衍生物與暴露于載體同時(shí)加入到細(xì)胞群中。
[0053]在另一方面，本發(fā)明提供了用載體，優(yōu)選慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的方法，其中用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)該細(xì)胞大約44小時(shí)或更久?！坝幂d體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟”理解為預(yù)刺激和載體暴露階段。例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約44-66 小時(shí)、44-60小時(shí)、44-54小時(shí)或44-48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約66、60、54、48或44小時(shí)。
[0054]在另一方面，本發(fā)明提供了用載體，優(yōu)選慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的方法，其中用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)該細(xì)胞(即在預(yù)刺激和載體接觸過(guò)程中)小于大約44小時(shí)。例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約12-42小時(shí)、12-36小時(shí)、12-24小時(shí)或 12-18小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約42、36、30、 24、18或12小時(shí)。在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群優(yōu)選培養(yǎng)大約24小時(shí)。
[0055]要理解的是，本文中所述的制備治療性細(xì)胞群的方法的步驟可以以不同的次序進(jìn)行。由此，制備治療性細(xì)胞群的方法可以包括以下步驟:a.從包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群中分離表達(dá)CD34的細(xì)胞；b.從表達(dá)⑶34的步驟(a)中獲得的細(xì)胞群中分離表達(dá)⑶38的細(xì)胞；c.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟(b)中獲得的不表達(dá)CD38的細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。[〇〇56]表達(dá)CD38的步驟(b)中獲得的細(xì)胞或其一部分可以保留以形成支持細(xì)胞群。
[0057]本申請(qǐng)涉及支持細(xì)胞群的用途。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在本文中提及的支持細(xì)胞群可以用上文定義的支持細(xì)胞群代替。[〇〇58]或者，表達(dá)CD38的步驟(b)中獲得的細(xì)胞或其一部分可以用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可用于治療(例如施用于受試者)。這種方法可以允許向受試者(如用于癌癥基因療法) 瞬時(shí)遞送基因(例如治療性基因)。【附圖說(shuō)明】
[0059]圖 1(A)將來(lái)自臍帶血或成人骨髓的CD34+細(xì)胞(Lonza)解凍，用SCF、FLT3L、TP0和IL6預(yù)刺激12小時(shí)，用抗⑶34、抗⑶133和抗⑶38抗體染色，并FACS分選為柱狀圖的x軸上顯示的亞群。該S0RT-LV方案包括在分選后12小時(shí)用慢病毒載體(PGK.GFP，108 TU/毫升)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在 LV-S0RT方案中，本體⑶34+細(xì)胞在預(yù)刺激24小時(shí)后慢病毒載體-轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后在次日分選。通過(guò)在分化條件下體外培養(yǎng)14天后的載體拷貝數(shù)(VCN)分析(集落形成測(cè)定或液體培養(yǎng))或通過(guò)培養(yǎng)7天后的流式細(xì)胞檢測(cè)分析(綠色柱狀圖，左下圖)來(lái)測(cè)量轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在骨髓的情況下，對(duì)總集落生長(zhǎng)物測(cè)定VCN，或在顯微鏡引導(dǎo)下通過(guò)拔除單個(gè)菌落單獨(dú)地對(duì)骨髓集落和紅細(xì)胞集落測(cè)定VCN。
[0060](B)將來(lái)自4個(gè)臍帶血供體的CD34+細(xì)胞(Lonza)解凍并分為2組:本體:⑶34+細(xì)胞； 干細(xì)胞:獲自本體的分選的CD34+CD38—細(xì)胞(CD38門(mén):最低10%;CD38抗體:IB2-PEV1770， Miltenyi)。將兩個(gè)組在補(bǔ)充有100納克/毫升SCF、100納克/毫升FLT3L、50納克/毫升TP0、50 納克/毫升IL-6的Stem Span無(wú)血清培養(yǎng)基(SFEM)中以106細(xì)胞/毫升的密度放置在培養(yǎng)物中并預(yù)刺激18小時(shí)。以108 TU/毫升用PGK.GFP慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將細(xì)胞注入亞致死劑量照射過(guò)的8周齡NSG小鼠(本體:1.26 X 105細(xì)胞/小鼠；n=6;干細(xì)胞:1.8 X 104細(xì)胞/小鼠； n=6)。使用人細(xì)胞特異性底物，在移植后3個(gè)月通過(guò)對(duì)外周血有核細(xì)胞進(jìn)行的qPCR來(lái)評(píng)估載體拷貝數(shù)。[〇〇61 ](C)對(duì)來(lái)自(B)中描述的造血嵌合(hematochimeric)小鼠的BM在移植后20周進(jìn)行VCN。相對(duì)于總⑶34+細(xì)胞，更高的向⑶34+CD381田胞中的基因轉(zhuǎn)移水平在衍生自相應(yīng)的起始群體的異種移植物中長(zhǎng)期保持。
[0062]圖2在Ospedale san Raffaele根據(jù)批準(zhǔn)的方案在剖腹產(chǎn)后由臍靜脈收集總臍帶血(40毫升)。[〇〇63]通過(guò)Ficoll分離單核細(xì)胞(2X108)，并用譜系抗體和CD38的混合物(Miltenyi，Cat 130-092-263 )標(biāo)記。陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞(108)連接到磁性微珠上并通過(guò)LD柱(Mil tenyi)分離。[〇〇64]流經(jīng)物(108 Lin—/CD38—細(xì)胞)用CD34微珠(Miltenyi)培育，在MS柱上富集CD34+⑶38—細(xì)胞。[〇〇65] 為了能夠追蹤NSG小鼠體內(nèi)CD38+和⑶38—亞群的造血輸出，該Lin+/⑶38+(第一柱) 和⑶34+⑶381及分(第二柱)對(duì)⑶34進(jìn)行FACS分選(分別產(chǎn)生高純⑶34+⑶38+和⑶34+⑶38 一細(xì)胞)。[〇〇66] 再分析顯示基于磁珠有效地分離為⑶38V1?和⑶38+細(xì)胞。這些級(jí)分隨后不同地用表達(dá)GFP和表達(dá)0FP的慢病毒載體標(biāo)記，以1:5的比(CD34+38—: CD34+38+)混合并注射到n=4的 NSG小鼠中。隨后GFP/0FP嵌合28周。
[0067]圖3對(duì)NSG小鼠中干/祖細(xì)胞共同移植建模:骨髓CD38— vs CD38high。[〇〇68] 將CD34+成人骨髓造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPCs)分選為CD34+CD38—(+/-)和CD34+ CD38hi(+/hi)細(xì)胞，在含有SCF(300納克/毫升)、Flt3L(300納克/毫升)、TP0(100納克/毫升)、IL6(60納克/毫升)和dmPGE2(10 yM)的Stem Span SFEM中預(yù)刺激16小時(shí)并用GFP-LV (+/-)或0FP-LV(+/hi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)后，如下將細(xì)胞注入8周齡、亞致死量照射過(guò)的 NSG小鼠:第1組:每只小鼠27，000 CD34+CD38—細(xì)胞(n=3 );第2組:每只小鼠248,000 0)34+0)38111細(xì)胞(11=3);第3組:每只小鼠27,000 CD34+CD38—和248,000 CD34+CD38hi細(xì)胞(n=3)。
[0069]在外周血中經(jīng)時(shí)監(jiān)控植入(第1、2、3組)和嵌合性(第3組)，并在移植后18周分析造血器官。
[0070]圖4(A)對(duì)NSG小鼠中干/祖細(xì)胞共同移植建模:動(dòng)員的外周血CD38—對(duì)? CD38intml 對(duì) CD38intm2 對(duì) CD38hi。[〇〇71] 我們將CD34+分選為具有提高的CD38表達(dá)水平的4個(gè)子集(CD34+/CD38—;CD347CD38intl;CD347CD38int2;CD34+/CD38hi)，這些子集在含有 SCF(300 納克 / 毫升)、Flt3L(300 納克/毫升)、TP0(100納克/毫升)、IL6(60納克/毫升)和dmPGE2(10 yM)的Stem Span SFEM 中預(yù)刺激16小時(shí)，并用以下慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些子集:CD34+/CD38—: GreenFP.LV; CD34+/ CD38intl: CherryFP ? LV; CD34+/CD38int2: CyanFP ? LV; CD34+/CD38h1: OrangeFP ? LV。在轉(zhuǎn)導(dǎo) 24 小時(shí)后，如下將細(xì)胞注入8周齡、亞致死量照射過(guò)的NSG小鼠:第 1 組:每只小鼠 129，000 CD34+/CD38—細(xì)胞(n=6 );第 2組:每只小鼠 869,000祖細(xì)胞(0034+/〇)381—、0)347〇)38—2和0)347〇)38111細(xì)胞的總和，各群落向祖細(xì)胞混合物貢獻(xiàn)33%) (n=7 );第3組:每只小鼠129,000 0)347〇)38—與869,000匯集的祖細(xì)胞的混合物(11=6)。[〇〇72] 在外周血中經(jīng)時(shí)監(jiān)控植入(第1、2、3組)和嵌合性(第3組)。[〇〇73](B)按照CD38表達(dá)水平分選G-CSF-動(dòng)員的外周血CD34+細(xì)胞，并如上圖4(A)中所述，通過(guò)表達(dá)不同的熒光蛋白質(zhì)的4種慢病毒載體標(biāo)記不同的級(jí)分。將差異化標(biāo)記的級(jí)分匯集(對(duì)應(yīng)于圖4(A)中的第3組)并注入8周齡亞致死量照射過(guò)的NSG小鼠。N=2動(dòng)員的外周血供體(購(gòu)自Stem Cell Technologies的⑶34+細(xì)胞)，2個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。[〇〇74]顯示了隨時(shí)間推移來(lái)自CD38亞級(jí)分對(duì)人移植物的相對(duì)貢獻(xiàn)(n=每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只小鼠，6只來(lái)自實(shí)驗(yàn)1，4只來(lái)自實(shí)驗(yàn)2;平均+/- sem)〇
[0075]實(shí)驗(yàn)1:第3組，每只小鼠 129,000 CD34+CD38—(0-12%)和869，000 CD34+CD381? 一intm—high( 12-100%)匯集祖細(xì)胞的混合(n=6)。
[0076]實(shí)驗(yàn)2:第3組，每只小鼠 149,000 CD34+CD38—(0-12%)和 1，320，000 CD34+CD381? 一intm—high( 12-100%)匯集祖細(xì)胞的混合(n=4)。
[0077]圖5(A)dmPGE2對(duì)臍帶血⑶34+細(xì)胞的影響(體外)。[〇〇78]將來(lái)自n=4個(gè)臍帶血供體的CD34 +細(xì)胞(Lonza)解凍并在存在或不存在10 yMdmPGE2的情況下在補(bǔ)充有100納克/毫升SCF、100納克/毫升FLT3U50納克/毫升TP0、50納克/毫升IL6的StemSpan無(wú)血清培養(yǎng)基(SFEM)中培養(yǎng)18小時(shí)(預(yù)刺激)。在預(yù)刺激后，細(xì)胞與 108 TU/毫升的慢病毒載體一起培育24小時(shí)，細(xì)胞隨后在MDM + 10% FCS中體外培養(yǎng)(n=5 次重復(fù))14天，隨后如Gentner, B?等人(2009) TVat.1fetAoc/s 6: 63-6中所述通過(guò)qPCR測(cè)量載體拷貝數(shù)(VCN)。dmPGE2預(yù)刺激導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移的50%提高。[〇〇79](B)dmPGE2對(duì)G-CSF-動(dòng)員的CD34+外周血干細(xì)胞的影響(體外)。
[0080]N=3個(gè)動(dòng)員的外周血受體的6次轉(zhuǎn)導(dǎo)。將細(xì)胞解凍，在以下細(xì)胞因子的存在下以106細(xì)胞/毫升的密度重新懸浮在無(wú)血清的商業(yè)培養(yǎng)基(例如CellGro)中:300納克/毫升SCF、 300納克/毫升FLT3L、100納克/毫升TP0、60納克/毫升IL-3,并在不存在(對(duì)照，Ctrl)或存在 dmPGE2的情況下預(yù)刺激18小時(shí)。以108 TU/毫升用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)(3個(gè)不同批次)12-24小時(shí)。在頂DM和10% FCS中體外培養(yǎng)14天后通過(guò)qPCR評(píng)估載體拷貝數(shù)。顯示了相對(duì)VCN(歸一化至對(duì)照組)。[0081 ](C)dmPGE2刺激的時(shí)間選擇對(duì)通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人HSPCs的能力的影響。[〇〇82]當(dāng)LV暴露前2小時(shí)加入dmPGE2時(shí)該影響似乎最大化(t=-2h:VCN的100%提高)，而在解凍時(shí)添加dmPGE2(t=-16h)導(dǎo)致?50%的VCN提高，類似于(A)和(B)中顯示的實(shí)驗(yàn)。對(duì)1個(gè)臍帶血和1個(gè)動(dòng)員的外周血供體進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，顯示了相對(duì)VCN(歸一化至其相應(yīng)的對(duì)照物)。 [〇〇83](D)通過(guò)dmPGE2體外刺激獲得的提高的載體拷貝數(shù)在異種移植后在衍生自臍帶血的CD34+細(xì)胞的后代中長(zhǎng)期保持。[〇〇84]將臍帶血CD34+細(xì)胞解凍并在補(bǔ)充有100納克/毫升SCF、100納克/毫升FLT3L、50納克/毫升TP0、50納克/毫升IL-6的Stem span無(wú)血清培養(yǎng)基(SFEM)中培養(yǎng)(106細(xì)胞/毫升)18 小時(shí)(預(yù)刺激)，隨后以1〇8 TU/毫升用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)。將細(xì)胞注入亞致死量照射過(guò)的8周齡NSG小鼠(每只小鼠1.5-3 X 105細(xì)胞)，并使用人細(xì)胞特異性底物在所示時(shí)間點(diǎn)處在各組小鼠的匯集的血液或骨髓中分析載體拷貝數(shù)(VCN)。顯示了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。左圖:細(xì)胞用 PGK.TRAIL LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在解凍后直接加入10 yM dmPGE2(dmPGE2組，n=5只小鼠)或DMS0(對(duì)照組，n=5只小鼠)(相對(duì)于載體添加，t=-16小時(shí))。中圖:細(xì)胞用PGK.TRAIL LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在添加載體前120分鐘加入10 yM dmPGE2(dmPGE2組，n=5)或DMS0(對(duì)照組；n=8)(t=-2小時(shí))。中圖:細(xì)胞用PGK.0FP LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在添加載體前120分鐘加入10 yM dmPGE2(dmPGE2組，n=5)或 DMS0(對(duì)照組;n=5)(t=-2小時(shí))。在所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，體外觀察到的轉(zhuǎn)導(dǎo)的益處穩(wěn)定地長(zhǎng)期保持，最高至異種移植后18周。
[0085](E-G)僅當(dāng)采用特定培養(yǎng)條件(即將總培養(yǎng)時(shí)間降低至小于44小時(shí))時(shí)，通過(guò)dmPGE2體外刺激獲得的提高的載體拷貝數(shù)在來(lái)自成人來(lái)源(如動(dòng)員的外周血)的CD34+細(xì)胞的后代中長(zhǎng)期保持。
[0086] 將來(lái)自G-CSF動(dòng)員的外周血(mro)的CD34+細(xì)胞解凍并在補(bǔ)充有SCF(300納克/毫升)、FLT3L(300納克/毫升)、TP0(100納克/毫升)和IL-3(60納克/毫升)的CellGro培養(yǎng)基中培養(yǎng)(106細(xì)胞/毫升)。細(xì)胞用對(duì)gp91ph°x編碼的第三代慢病毒載體(適于慢性肉芽腫病的基因療法的載體)以108 TU/毫升的劑量轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于mPB CD34+細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同方案顯示在(E)中，并在以下方面不同:存在(P1、P2、P3)或不存在(P0、P4)dmPGE2、加入dmPGE2的時(shí)間選擇(在解凍后:P1、P2 ;在轉(zhuǎn)導(dǎo)前120分鐘:P3)以及培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間(24小時(shí):P2、P4對(duì) 44 小時(shí):P0、P1、P3)。[〇〇87](F)將來(lái)自供體1的10X106 CD34+ itfB細(xì)胞解凍，分為四等份，并按照P0、P1、P2或P3用來(lái)自工業(yè)級(jí)生產(chǎn)(Molmed Spa)的SP 146/gp91 ? cogp9lph°x ? 126TLV轉(zhuǎn)導(dǎo)。在時(shí)間0處向每只小鼠注射培養(yǎng)的5 X 105細(xì)胞產(chǎn)物(實(shí)際數(shù)字:P0:每只小鼠3.66 X 105; P1:每只小鼠4.66 \105;?2:每只小鼠3.0\105;?3:每只小鼠4.86\105)。在移植后20周對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。由屬于同一組的小鼠沖洗并匯集BM(P0、P1、P2:每組n=5;P3:每組n=3)并貧化小鼠細(xì)胞。 富集的人細(xì)胞隨后使用人細(xì)胞特異性底物施以載體拷貝數(shù)(VCN)分析(5次技術(shù)重復(fù))。通過(guò)具有Bonferroni測(cè)試后修正的One-way AN0VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在P2條件下表現(xiàn)出在VCN進(jìn)入長(zhǎng)期再植細(xì)胞方面?50%的提高。[〇〇88](G)使用來(lái)自第二供體的mPB⑶34+細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。將15X106⑶34+ itfB細(xì)胞解凍，分為四等份，并按照方案P0、P1(44 h -/+ dmPGE2)或P4、P2(24h -/+ dmPGE2)用來(lái)自實(shí)驗(yàn)室級(jí)生產(chǎn)的3?146/^?914?91—161'.1261'1^(適于(:0)基因療法的載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在時(shí)間 〇處向每只小鼠注射培養(yǎng)的9 X 105細(xì)胞產(chǎn)物(實(shí)際數(shù)字:P0:每只小鼠10 X 105; P1:每只小鼠8.2 X 105; P4:每只小鼠4.5 X 105; P2:每只小鼠5.3 X 105)。使用人細(xì)胞特異性qPCR分析對(duì)來(lái)自移植后13周的各單一小鼠的BM細(xì)胞進(jìn)行VCN分析。與第一實(shí)驗(yàn)一致，P1條件在來(lái)自成人來(lái)源的長(zhǎng)期再植細(xì)胞中通過(guò)dmPGE2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面并未產(chǎn)生持久的增益，與之形成鮮明對(duì)比的是MPB CD34+祖細(xì)胞，其中使用體外讀出器，P1方案導(dǎo)致提高的VCN(參見(jiàn)圖5B)， 并與臍帶血不同，其中與“標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)方案關(guān)聯(lián)的dmPGE2在長(zhǎng)期再植細(xì)胞中導(dǎo)致提高的VCN (圖5D)。我們預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn)，將MPB CD34+細(xì)胞培養(yǎng)方案縮短至24小時(shí)(P2)不僅拯救了 dmPGE2在長(zhǎng)期再植細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)效果，還提高轉(zhuǎn)導(dǎo)至顯著高于通過(guò)44小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)方案所實(shí)現(xiàn)的水平?？赡艿慕忉尠?? dmPGE2對(duì)HSC(但并非對(duì)祖細(xì)胞)的暴露時(shí)間依賴性效應(yīng)，其中許可LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的窗口限于16-24小時(shí)(與以下假設(shè)一致:即使并非統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，其中相對(duì)于P1延遲dmPGE2暴露的 P3方案可能意味著在VCN方面的一定提高;參見(jiàn)圖5F)。[〇〇89]?存在功能不同的HSC物種，一種對(duì)dmPGE2刺激敏感，但在培養(yǎng)24小時(shí)后失去植入潛力，一種對(duì)dmPGE2不敏感，但在培養(yǎng)中更好地保持植入潛力，由此在更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中占據(jù)主要地位。
[0090]圖 6使用dmPGE2提高向來(lái)自成人骨髓的⑶34+、⑶34+⑶38— HSC和⑶34+⑶38+祖細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移。[〇〇91] 如下進(jìn)行該實(shí)驗(yàn):將來(lái)自N=3個(gè)骨髓供體的⑶34+細(xì)胞(Lonza)解凍并在Stem Span 無(wú)血清培養(yǎng)基(SFEM)中在以下條件下培養(yǎng):在300納克/毫升SCF、300納克/毫升FLT3L、100納克/毫升TP0、60納克/毫升IL3中預(yù)刺激18小時(shí)。隨后將細(xì)胞分為三組:本體⑶34+、⑶34+ CD38—、CD34+CD38+(在用來(lái)自BD B1science的CD38-APC抗體標(biāo)記后在MoFlow細(xì)胞儀上FACS 分選)。我們隨后向培養(yǎng)物中加入dmPGE2( 10 yM)或DMS0,并預(yù)刺激該細(xì)胞另外的16小時(shí)，隨后用表達(dá)GFP的慢病毒載體(LV.PGK.GFP)以108 TU/毫升轉(zhuǎn)導(dǎo)它們。以頂DM+10%FCS中液體培養(yǎng)14天(左)或集落形成細(xì)胞(CFC)分析(右；以800細(xì)胞/毫升methocult鋪板，在14天后分析菌落生長(zhǎng))形式進(jìn)行體外培養(yǎng)分析。如Gentner B等人，Nat.Methods 2009;6:63-66中所述通過(guò)qPCR評(píng)估載體拷貝數(shù)。
[0092]圖 7對(duì)共同施用培養(yǎng)/轉(zhuǎn)導(dǎo)⑶34+⑶3K干細(xì)胞與未培養(yǎng)的⑶34+⑶38intA祖細(xì)胞建模。[〇〇93]通過(guò)白細(xì)胞分離法獲得G-CSF-動(dòng)員的外周血細(xì)胞，對(duì)⑶34+細(xì)胞富集，通過(guò)FACS(MoFlo XDP分選儀和CD38 PE-V1770 Miltenyi抗體)分選成更原始的CD38—干細(xì)胞級(jí)分 (0-7%⑶38百分位)和⑶38int/+祖細(xì)胞級(jí)分(13-100%⑶38百分位)。將各級(jí)分的多個(gè)等分試樣冷凍。[〇〇94](A)將⑶34+CD38X干細(xì)胞)級(jí)分解凍，以106細(xì)胞/毫升的密度重新懸浮在補(bǔ)充有300納克/毫升SCF、300納克/毫升FLT3U100納克/毫升TP0、60納克/毫升IL-3和10 yM dmPGE2的Stem Span無(wú)血清培養(yǎng)基(SFEM)中。如示意圖中所示，細(xì)胞預(yù)刺激20小時(shí)(示意圖中的灰色框)并用PGK.GFP慢病毒載體(108 TU/毫升)轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)(紅色框)。培養(yǎng)/基因修飾的干細(xì)胞隨后與新鮮解凍的⑶34+⑶38intA祖細(xì)胞以1:8的比混合，并注入到8周齡的亞致死量照射過(guò)的吧6小鼠中(每只小鼠47,400 0)34沱0387327,000未培養(yǎng)的祖細(xì)胞，11=6)。干細(xì)胞區(qū)室的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在體內(nèi)為95%，如在排它地用CD34+CD3K干細(xì)胞移植的NSG小鼠中測(cè)得的那樣(n=6)。左側(cè)的圖顯示了作為衍生自培養(yǎng)的⑶34+⑶38_細(xì)胞的細(xì)胞的替代標(biāo)記物在所述時(shí)間點(diǎn)處在人移植物(實(shí)心圓沖GFP+細(xì)胞的百分比，以及作為衍生自未培養(yǎng)祖細(xì)胞移植物的細(xì)胞的替代標(biāo)記物的GFP_細(xì)胞(空心圓)的百分比。在BMT后24周(反映來(lái)自HSC的造血作用的時(shí)間點(diǎn))，該移植物的大約60%是GFP+并由此衍生自⑶34+CD3&干細(xì)胞級(jí)分。該圖對(duì)包括 B細(xì)胞(⑶19+)、骨髓細(xì)胞(⑶33+)和⑶34+ HSPC的所有譜系是類似的(右側(cè)圖)。另一方面，長(zhǎng)期移植物的30-40%似乎衍生自⑶34+⑶38intA祖細(xì)胞——與圖4中描述的研究相比預(yù)料不到地高的級(jí)分。此外，在達(dá)到干細(xì)胞和祖細(xì)胞貢獻(xiàn)之間的平衡之前花費(fèi)了 15周(圖7A)，與圖4B 中描述的研究中的9周形成對(duì)照。[〇〇95](B)為了基于輸注高度富集的基因修飾HSC和未培養(yǎng)的祖細(xì)胞支持來(lái)改進(jìn)基因療法方案，我們調(diào)節(jié)了干細(xì)胞對(duì)祖細(xì)胞的比例(1:5對(duì)1:10)和培養(yǎng)條件(將培養(yǎng)時(shí)間減少至 24小時(shí)，避免祖細(xì)胞細(xì)胞因子如IL3)以便能夠在⑶34+⑶381田胞中更好地保持HSC功能。將來(lái)自于(A)中相同供體的⑶34+CD38飛干細(xì)胞)細(xì)胞解凍，以106/毫升重新懸浮在補(bǔ)充有300 納克/毫升SCF、300納克/毫升FLT3L、100納克/毫升TP0和10 yM dmPGE2的CellGro介質(zhì)中并預(yù)刺激16小時(shí)(示意圖中的灰色框)。如示意圖中所示，用PGK.GFP慢病毒載體以108 TU/毫升轉(zhuǎn)導(dǎo)8小時(shí)(紅色框)。培養(yǎng)/基因修飾的干細(xì)胞隨后與新鮮解凍的CD34+CD38int/11細(xì)胞以 1:5(每只小鼠46,500 0)34沱0387232,500未培養(yǎng)的祖細(xì)胞，11=5)或1:10(每只小鼠46,500 ⑶34+CD387465,000未培養(yǎng)的祖細(xì)胞，n=5)的比混合，并注入到8周齡的亞致死量照射過(guò)的 NSG小鼠中。上圖顯示了作為衍生自培養(yǎng)的CD34+CD381田胞的細(xì)胞的替代標(biāo)記物在所述時(shí)間點(diǎn)處在人移植物(實(shí)心圓)中GFP+細(xì)胞的百分比，以及作為衍生自未培養(yǎng)祖細(xì)胞移植物的細(xì)胞的替代標(biāo)記物的GFP1田胞(空心圓)的百分比。注意到來(lái)自轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶34+CD3&干細(xì)胞的快得多的貢獻(xiàn)，在12周時(shí)已經(jīng)達(dá)到最高70%(與圖7A中的40%相比)。該GFP+細(xì)胞的分?jǐn)?shù)在短壽命造血細(xì)胞譜系(CD33+或⑶34+細(xì)胞)中是類似的，與1:5或1:10的干細(xì)胞/祖細(xì)胞比無(wú)關(guān)(下圖)。這些數(shù)據(jù)支持了這樣的觀點(diǎn):短培養(yǎng)時(shí)間對(duì)獲得高度官能的、基因修飾的HSC而言至關(guān)重要。
[0096]圖 8定制基因療法過(guò)程中基因修飾的細(xì)胞的持久性。[〇〇97](A)通過(guò)施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38-細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38+/int祖細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此類方法非常適于治療遺傳的遺傳性疾病。[〇〇98](B)通過(guò)施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38+/int祖細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38—細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)短期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。[〇〇99](C)通過(guò)施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38int/1°細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38—細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)中期表達(dá)。
[0100](B)和(C)中顯示的途徑非常適于靶向腫瘤。[〇1〇1]這些圖顯示了來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(供體1: n=21只小鼠；供體2: n=12只小) 〇
[0102]圖9體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植入HSPC級(jí)分的影響(B和C:總CD34+HSPC; D: CD34+CD38— HSPC; E: CD34 +CD38int/+祖細(xì)胞)(A)測(cè)試體外培養(yǎng)條件的方案。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)通過(guò)白細(xì)胞分離法收集的G-CSF動(dòng)員外周血 (mPB)干細(xì)胞進(jìn)行。將細(xì)胞解凍并在補(bǔ)充有300納克/毫升SCF、300納克/毫升FLT3U100納克/毫升TP0、60納克/毫升IL-3的無(wú)血清介質(zhì)中(106細(xì)胞/毫升)培養(yǎng)24小時(shí)(標(biāo)準(zhǔn))或16小時(shí)(短)，如通過(guò)灰色方框在該示意圖中所示。如通過(guò)紅色方框所示(更暗的方框)，用第三代慢病毒載體以1〇8 TU/毫升進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)20小時(shí)(標(biāo)準(zhǔn))或8小時(shí)(短方案)。將同等數(shù)量的細(xì)胞 (按照體外培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的輸入數(shù)量)注入亞致死量照射過(guò)的8周齡NSG小鼠，并經(jīng)時(shí)監(jiān)控植入。通過(guò)具有Bonferroni測(cè)試后的Two-way AN0VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。[〇1〇3](B)(左)按照標(biāo)準(zhǔn)或短期方案(每組n=5只小鼠，各自用5X105 mPB CD34+細(xì)胞的產(chǎn)物注射)操作用SP146/gp91.cogp91ph°x.126TLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mPB CD34+細(xì)胞異種移植后在所示時(shí)間點(diǎn)處在NSG小鼠的外周血(PB)和骨髓(BM)中的人⑶45+植入。(右)植入水平歸一化至注入各小鼠的CD34+細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量。該數(shù)字對(duì)短期培養(yǎng)方案較低，因?yàn)榧?xì)胞的體外增殖時(shí)間較少。[〇1〇4](C)類似(B)中所述的復(fù)制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，培養(yǎng)較短持續(xù)時(shí)間(24小時(shí)對(duì)44小時(shí))的⑶34+細(xì)胞具有顯著提高的種群恢復(fù)潛力。[〇1〇5](D)按照短期方案(n=6只小鼠，每只小鼠4.7 X 104細(xì)胞)或標(biāo)準(zhǔn)方案(n=6只小鼠，每只小鼠4.7X104細(xì)胞)操作用PGK.GFPLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的mPB⑶34+⑶38_干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞異種移植后在所示時(shí)間點(diǎn)處在NSG小鼠的外周血(PB)和骨髓抽出物(BMasp)中的人CD45+GFP+植入。CD38—的水平定義為按照用抗CD38抗體(IB6-PE-V1770, Miltenyi)培育時(shí)的CD38染色水平排序并從最低⑶38表達(dá)細(xì)胞(0-7%間隔，0為最低，100%為最高表達(dá)細(xì)胞)開(kāi)始的⑶34+ 細(xì)胞的7%。
[0106] (E )按照標(biāo)準(zhǔn)方案(n=4只小鼠)或短期方案(n=5只小鼠)操作用PGK.GFPLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的 mPB CD34+CD38int/11細(xì)胞異種移植后在所示時(shí)間點(diǎn)處在NSG小鼠的外周血(PB)和骨髓抽出物(BMasp沖的人CD45+植入。此外，n=5只小鼠用新解凍(未培養(yǎng))的CD34+CD38int/%細(xì)胞異種移植。用等效的5 X 105 mPB CD34+CD38int/lH胞注射小鼠。CD38intA的水平定義為按照用抗CD38抗體(IB6-PE-V1770, Miltenyi)培育時(shí)的CD38染色水平排序并從最高CD38表達(dá)細(xì)胞(13-100%間隔，0為最低，100%為最高表達(dá)細(xì)胞)開(kāi)始的CD34+細(xì)胞的87%。
[0107]圖10待用于臨床基因療法應(yīng)用的潛在轉(zhuǎn)導(dǎo)方案的示意圖。方案A、B、C和D是優(yōu)選方案。
[0108]發(fā)明詳述現(xiàn)在將通過(guò)非限制性實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明的各種優(yōu)選特征和實(shí)施方案。
[0109]除非另行說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。在文獻(xiàn)中說(shuō)明了此類技術(shù)。參見(jiàn)例如J.Sambrook, E.F.Fritsch和T.Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F.M.等人(1995并定期增補(bǔ))Current Protocols in Molecular B1logy,第9、13和16章， John Wiley & Sons, New York, NY;B.Roe, J.Crabtree和A.Kahn (1996) DNA Isolat1n and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J.M.Polak 和James 0’D.McGee (1990) In Situ Hybridizat1n: Principles and Practice; Oxford University Press; M.J.Gait (編輯)(1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press;以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press。這些常規(guī)文本各自經(jīng)引用并入本文。
[0110]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了制備用于臨床應(yīng)用的治療性細(xì)胞群的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD34但基本不表達(dá)CD38。該細(xì)胞由包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群制備。該方法包括從起始細(xì)胞群中分離基本不表達(dá)CD38但表達(dá)CD34的細(xì)胞群，并用載體，優(yōu)選病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。該載體優(yōu)選包含相關(guān)核苷酸。
[0111]治療性細(xì)胞群應(yīng)理解為當(dāng)施用于受試者時(shí)產(chǎn)生治療效果的細(xì)胞群。該治療效果可以是改善或基本治愈受試者的疾病或病癥，或減少或基本防止疾病或病癥在未來(lái)的出現(xiàn)。 例如，有可能通過(guò)基因組測(cè)序來(lái)識(shí)別遺傳的遺傳疾病并通過(guò)施用該治療性細(xì)胞群來(lái)防止該疾病出現(xiàn)。該治療性細(xì)胞群可以包含可用于基因療法的基因。
[0112] “臨床應(yīng)用”應(yīng)理解為以可以施用于動(dòng)物受試者，優(yōu)選人類受試者的形式制備該治療性細(xì)胞群。
[0113]造血干細(xì)胞干細(xì)胞能夠分化成多種細(xì)胞類型。能夠分化成所有細(xì)胞類型的細(xì)胞被稱為全能細(xì)胞。 在哺乳動(dòng)物中，僅有受精卵和早期胚胎細(xì)胞是全能的。干細(xì)胞在大多數(shù)(如果并非全部)多細(xì)胞生物中發(fā)現(xiàn)。它們的特征在于通過(guò)有絲細(xì)胞分裂自我更新和分化成各種各樣的特定細(xì)胞類型的能力。兩種主要類型的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞是從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離的胚胎干細(xì)胞，以及在成體組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞。在發(fā)育的胚胎中，干細(xì)胞可以分化成所有特定胚胎組織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞充當(dāng)身體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充特定的細(xì)胞，但還維持再生性器官如血液、皮膚或腸組織的正常周轉(zhuǎn)。
[0114]造血干細(xì)胞(HSC)是例如可以在外周血、骨髓和臍帶血中發(fā)現(xiàn)的多能干細(xì)胞。HSC 能夠自我更新并分化成任何血細(xì)胞譜系。它們能夠再移植(recolonising)整個(gè)免疫系統(tǒng)， 并在所有造血組織(如骨髓、脾臟和胸腺)中再移植紅細(xì)胞和骨髓細(xì)胞譜系。它們提供所有造血細(xì)胞譜系的終身生產(chǎn)。
[0115]造血祖細(xì)胞能夠分化成特定類型的細(xì)胞。但是，不同于干細(xì)胞，它們已經(jīng)更具體得多:它們被推進(jìn)到分化成它們的“革E”細(xì)胞。干細(xì)胞與祖細(xì)胞之間的差別在于，干細(xì)胞可以無(wú)限復(fù)制，而祖細(xì)胞僅能分裂有限的次數(shù)。造血祖細(xì)胞可以僅通過(guò)功能體內(nèi)試驗(yàn)(即移植并證明是否它們能夠在延長(zhǎng)的時(shí)段產(chǎn)生所有血細(xì)胞譜系)與HSC嚴(yán)格區(qū)分。
[0116]分化的細(xì)胞是與干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比已經(jīng)變得更特定的細(xì)胞。分化在多細(xì)胞生物發(fā)育過(guò)程中發(fā)生，當(dāng)生物體由單個(gè)受精卵變?yōu)榻M織和細(xì)胞類型的復(fù)雜體系。分化還是在成體中的常見(jiàn)過(guò)程:在組織修復(fù)和正常細(xì)胞更新過(guò)程中，成體干細(xì)胞分裂并產(chǎn)生完全分化的子代細(xì)胞。分化顯著改變了細(xì)胞的尺寸、形狀、膜電勢(shì)、代謝活性和對(duì)信號(hào)的響應(yīng)。這些變化在很大程度上是由于基因表達(dá)中的高度受控的修飾。換句話說(shuō)，分化細(xì)胞是具有特定結(jié)構(gòu)并由于涉及特定基因的激活與失活的發(fā)育過(guò)程而發(fā)揮特定功能的細(xì)胞。在這里，分化細(xì)胞包括造血細(xì)胞譜系的分化細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。例如，造血細(xì)胞譜系的分化細(xì)胞可以通過(guò)檢測(cè)在未分化細(xì)胞上不表達(dá)或表達(dá)程度較低的細(xì)胞表面分子來(lái)與干細(xì)胞和祖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。合適的人細(xì)胞譜系標(biāo)記物的實(shí)例包括⑶33、CD13、⑶14、CD15(骨髓細(xì)胞)、0)19丄020、0)22、0)793(8細(xì)胞)、0)36丄071、0)2353(紅系細(xì)胞)、0)2、0)3、0)4、0)8(丁細(xì)胞)、CD56(NK細(xì)胞)。
[0117]HSC^m在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群獲自組織樣本。
[0118] 例如，HSC可以獲自成人和胎兒的外周血、臍帶血、骨髓、肝臟或脾臟。優(yōu)選地，這些細(xì)胞獲自外周血或骨髓。它們可以在通過(guò)生長(zhǎng)因子治療在體內(nèi)動(dòng)員細(xì)胞后獲得。
[0119]可以使用例如G-CSF、普樂(lè)沙福(plerixaphor)或其組合來(lái)進(jìn)行動(dòng)員。其它試劑如 NSAIDs、CXCR2配體(Grobeta)和二肽基肽酶抑制劑也可用作動(dòng)員劑。
[0120]由于干細(xì)胞生長(zhǎng)因子GM-CSF和G-CSF的可用性，大多數(shù)造血干細(xì)胞移植程序現(xiàn)在使用由外周血而非由骨髓收集的干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。收集外周血干細(xì)胞提供了更大的移植物， 不需要對(duì)供體施以全身麻醉以收集該移植物，導(dǎo)致了植入時(shí)間更短，并可以提供較低的長(zhǎng)期復(fù)發(fā)率。[〇121] 可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)吸引法或通過(guò)使用下一代收獲工具(例如Marrow Miner)來(lái)收集骨髓(穩(wěn)定狀態(tài)或動(dòng)員后)。
[0122]此外，HSC還可以衍生自誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
[0123]HSC特性通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)程序，HSC通常具有低前向散射和側(cè)向散射輪廓。一些是代謝靜止的， 如通過(guò)羅丹明標(biāo)記(其能夠測(cè)定線粒體活性)所展現(xiàn)的那樣。HSC可以包含某些細(xì)胞表面標(biāo)記物如⑶34、CD45、⑶133、⑶90和⑶49f。它們還可以定義為缺少⑶38和⑶45RA細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)的細(xì)胞。但是，這些標(biāo)記物的一些的表達(dá)依賴于該HSC的發(fā)育階段和組織特異性背景。稱為“側(cè)群細(xì)胞”的一些HSC如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的那樣排除Hoechst 33342染料。 由此，HSC具有允許它們的識(shí)別和分離的描述性特性。
[0124]陰性標(biāo)記物CD38是人HSC的最成熟和使用的單一陰性標(biāo)記物。
[0125]人 HSC 還可能對(duì)譜系標(biāo)記物如 CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD36、CD56、 ⑶66b、⑶271和⑶45RA是陰性的。但是，對(duì)于HSC富集，這些標(biāo)記物必須組合使用。
[0126]陰性標(biāo)記物應(yīng)理解為人HSC缺乏這些標(biāo)記物的表達(dá)。
[0127]陽(yáng)性標(biāo)記物⑶34和⑶133是對(duì)HSC最有用的陽(yáng)性標(biāo)記物。
[0128] 某些HSC對(duì)譜系標(biāo)記物如⑶90、CD49f和⑶93也是陽(yáng)性的。但是，對(duì)于HSC富集，這些標(biāo)記物必須組合使用。
[0129]陽(yáng)性標(biāo)記物應(yīng)理解為人HSC表達(dá)這些標(biāo)記物。[〇13〇]因此，該治療性細(xì)胞群可以是⑶34+CD38'可以進(jìn)行進(jìn)一步分離以獲得例如⑶34+ CD38—CD45RA—CD90+CD49f+細(xì)胞。
[0131]細(xì)胞的分離分離細(xì)胞群指的是將表現(xiàn)出特定表型或特性的細(xì)胞群從不表現(xiàn)出該表型或特性或以較低程度表現(xiàn)的其它細(xì)胞中提純。例如，可以從起始細(xì)胞群中分離不表達(dá)特異性標(biāo)記物(如 ⑶38)的細(xì)胞群?；蛘呋虼送猓梢苑蛛x表達(dá)另一標(biāo)記物(如⑶34)的細(xì)胞群。
[0132]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟:a.從包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群中分離表達(dá)CD38的細(xì)胞；b.從不表達(dá)⑶38的步驟(a)中獲得的細(xì)胞群中分離表達(dá)⑶34的細(xì)胞；c.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟(b)中獲得的表達(dá)CD34的細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。
[0133]分離表達(dá)特定標(biāo)記物(例如⑶38或⑶34)的細(xì)胞群可以通過(guò)使用結(jié)合到該標(biāo)記物的試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0134]在另一實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟:a.使包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群與CD38反應(yīng)性試劑接觸；b.將CD38反應(yīng)性細(xì)胞與CD38非反應(yīng)性細(xì)胞分離；c.使步驟(b)中獲得的CD38非反應(yīng)性細(xì)胞與CD34反應(yīng)性試劑接觸；d.將CD34反應(yīng)性細(xì)胞與CD34非反應(yīng)性細(xì)胞分離，其中該CD34反應(yīng)性細(xì)胞構(gòu)成該轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群；e.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)該轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。
[0135]對(duì)特定標(biāo)記物如CD38或CD34為反應(yīng)性的試劑應(yīng)理解為基本特異性結(jié)合到該標(biāo)記物上的試劑。
[0136]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)CD38或CD34為反應(yīng)性的試劑分別是抗CD38或抗 ⑶34抗體。
[0137]本文中所用的抗體指的是能夠結(jié)合到所選靶上的完全抗體或抗體片段，并包括Fv、ScFv、F(ab ’)和F (ab ’)2，單克隆和多克隆抗體，工程抗體，包括嵌合抗體、CDR移植抗體和人源化抗體，以及使用噬菌體展示或替代技術(shù)產(chǎn)生的人工選擇抗體。
[0138]此外，傳統(tǒng)抗體的替代物也可用于本發(fā)明，例如“avibodies”、“avimers”、 “anticalins”、“nanobodies”和“DARPins”。
[0139]因此，例如⑶38反應(yīng)性細(xì)胞應(yīng)理解為表達(dá)⑶38標(biāo)記物并因此結(jié)合到⑶38反應(yīng)性試劑上的那些細(xì)胞。相反，CD38非反應(yīng)性細(xì)胞基本上不結(jié)合到CD38反應(yīng)性試劑。相同的理解可以類推地適用于CD34反應(yīng)性和非反應(yīng)性細(xì)胞。
[0140]可以使用多種本領(lǐng)域已知的技術(shù)的任一種標(biāo)記特定標(biāo)記物反應(yīng)性試劑以使得可以識(shí)別。該反應(yīng)性試劑可以固有地被標(biāo)記，或可以通過(guò)向其綴合標(biāo)簽來(lái)修飾。綴合理解為該反應(yīng)性試劑與標(biāo)簽操作性連接。這意味著反應(yīng)性試劑與標(biāo)簽以能夠基本無(wú)阻礙地執(zhí)行其功能(例如結(jié)合至標(biāo)記物、允許熒光標(biāo)識(shí)、或當(dāng)置于磁場(chǎng)時(shí)能夠進(jìn)行分離)的方式連接在一起。 合適的綴合方法在本領(lǐng)域是公知的，并可以由技術(shù)人員容易地識(shí)別。
[0141]標(biāo)簽例如可以允許被標(biāo)記的試劑及結(jié)合于其上的任何細(xì)胞從其環(huán)境中純化(例如該反應(yīng)性試劑可以用磁珠或親和標(biāo)記物如親和素進(jìn)行標(biāo)記)和/或檢測(cè)。適于用作標(biāo)簽的可檢測(cè)的標(biāo)記物包括熒光基團(tuán)(例如綠色、櫻桃色、藍(lán)綠色和橙色熒光蛋白)和肽標(biāo)記物(例如 His標(biāo)記物、Myc標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物和HA標(biāo)記物)。
[0142]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗⑶38和/或抗⑶34抗體綴合到磁珠上。
[0143]在另一實(shí)施方案中，抗⑶38和/或抗⑶34抗體綴合到可檢測(cè)的標(biāo)記物上。
[0144]在另一實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光基團(tuán)。
[0145]大量用于分離表達(dá)特定標(biāo)記物的細(xì)胞群的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。這些包括基于磁珠的分離技術(shù)(例如基于磁珠的閉路分離)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)、 親和標(biāo)記物純化(例如使用親和柱或珠，如生物素柱來(lái)分離親和素標(biāo)記的試劑)和基于顯微術(shù)的技術(shù)。
[0146]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于磁珠的分離法或流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分離表達(dá)⑶38的細(xì)胞和/或表達(dá)⑶34的細(xì)胞。
[0147]在另一實(shí)施方案中，使用基于磁珠的分離法或流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分離CD38反應(yīng)性細(xì)胞和/或CD34反應(yīng)性細(xì)胞。
[0148]還有可能采用不同技術(shù)的組合來(lái)進(jìn)行分離，如在基于磁珠的分離步驟后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)一種或更多種附加(陽(yáng)性或陰性)標(biāo)記物來(lái)分選所得細(xì)胞群。
[0149]可以進(jìn)行臨床級(jí)分離，例如使用CliniMACS%系統(tǒng)(Miltenyi)。這是基于磁珠的閉路分離技術(shù)的一個(gè)實(shí)例。
[0150]還可以設(shè)想，染料排斥性質(zhì)(例如側(cè)群細(xì)胞或羅丹明標(biāo)記)或酶活性(例如ALDH活性)可用于富集HSC。
[0151]當(dāng)使用現(xiàn)有的基于磁珠的分離技術(shù)時(shí)，優(yōu)選的是負(fù)分離步驟(即貧化表達(dá)⑶38的細(xì)胞)應(yīng)當(dāng)先于正分離步驟(即富集表達(dá)CD34的細(xì)胞)。但是，可以設(shè)想，可以采用替代技術(shù)， 例如先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)(例如閉路FACS)同時(shí)進(jìn)行負(fù)分離和正分離步驟。
[0152]但是，還可以在負(fù)分離步驟(即貧化表達(dá)⑶38的細(xì)胞)之前進(jìn)行正分離步驟(即富集表達(dá)⑶34的細(xì)胞)。[〇153]本發(fā)明的細(xì)胞群可以根據(jù)⑶38表達(dá)水平分離成多個(gè)級(jí)分。CD38表達(dá)水平可以采用本領(lǐng)域已知的合適技術(shù)，例如流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)(參見(jiàn)例如圖4)來(lái)量化。例如，CD38表達(dá)水平可以通過(guò)用IB6克隆或類似/等效試劑染色抗體來(lái)測(cè)量。
[0154]細(xì)胞的⑶38表達(dá)量可以以百分比表達(dá)水平來(lái)表示，0%為最低表達(dá)細(xì)胞，100%為最高表達(dá)細(xì)胞。
[0155]細(xì)胞群可以基于⑶38表達(dá)水平分類或分離為亞群(例如衍生自⑶34+群的亞群)。 細(xì)胞群可以分類或分離為⑶38'⑶38int1、⑶38int2或⑶38+亞群，其以此順序具有漸增的 ⑶38表達(dá)水平(例如整個(gè)⑶34+群根據(jù)⑶38表達(dá)/染色強(qiáng)度評(píng)級(jí))。例如(當(dāng)預(yù)門(mén)控對(duì)⑶34+細(xì)胞的分析時(shí))，具有CD3&表型的細(xì)胞群可以根據(jù)CD38表達(dá)水平包含在最低的10%細(xì)胞中；具有⑶38intl表型的細(xì)胞群(也稱為⑶38int/1°)可以包含在該⑶38_細(xì)胞的下一個(gè)最高的30%細(xì)胞中；具有⑶38int2表型的細(xì)胞群(也稱為⑶38+Ant)可以包含在⑶38intl細(xì)胞的下一個(gè)最高 30%的細(xì)胞中；并且具有⑶38+表型的細(xì)胞群(也稱為⑶38hi)可以包含在⑶38int2細(xì)胞的下一個(gè)最高30%的細(xì)胞中。
[0156]由此，具有⑶3K表型的細(xì)胞群可以例如包含在⑶38表達(dá)的大約0-12%范圍內(nèi)，例如大約0-10%范圍。
[0157]具有⑶38intl表型的細(xì)胞群(也稱為⑶38int/1°)可以例如包含在⑶38表達(dá)的大約 10-40%范圍內(nèi)，例如大約12-40%或大約13-40%范圍。
[0158]具有⑶38int2表型的細(xì)胞群(也稱為⑶38+/int)可以例如包含在⑶38表達(dá)的大約40-70%范圍內(nèi)，例如大約41-70%范圍。
[0159]具有⑶38+(也稱為⑶38hi)表型的細(xì)胞群可以例如包含在⑶38表達(dá)的大約70-100% 范圍內(nèi)，例如大約71-100%范圍。[〇16〇]根據(jù)本文中的公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地根據(jù)預(yù)期用途基于CD38表達(dá)水平來(lái)選擇細(xì)胞群。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，公開(kāi)的CD38表達(dá)水平可以根據(jù)所需用途略微調(diào)整。
[0161]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該CD38lf(含有干細(xì)胞的級(jí)分)定義為具有0-10%范圍的 CD38表達(dá);CD38intl群(含有多能祖細(xì)胞的級(jí)分，具有短期或中期再植能力)定義為具有10-40%范圍的CD38表達(dá);CD38int2群(含有祖細(xì)胞的級(jí)分，具有短期再植能力)定義為具有40-70%范圍的⑶38表達(dá);并且⑶38+群(前體細(xì)胞，基本不具有顯著的再植能力)定義為具有70-100%范圍的CD38表達(dá)。
[0162]細(xì)胞的這些級(jí)分可以按需合并。例如，CD38intl和CD38int2級(jí)分可以合并以形成 CD38int級(jí)分(包含在CD38表達(dá)的大約10-70%范圍內(nèi))；并且CD38intl、CD38int2和CD38+組可以合并以形成⑶38lciw_intm_high(也稱為⑶38int/+)級(jí)分(包含在⑶38表達(dá)的大約10-100%范圍內(nèi)， 例如大約12-100%或大約13-100%范圍)。
[0163]載體載體是允許或促進(jìn)實(shí)體由一種環(huán)境轉(zhuǎn)移至另一種環(huán)境的工具。按照本發(fā)明并舉例而言，用于重組核酸技術(shù)的一些載體允許實(shí)體，如核酸片段(例如異源DNA片段，如異源cDNA片段)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。該載體可以用于以下目的:將該異源核酸(DNA或RNA)保持在細(xì)胞中， 促進(jìn)包含核酸片段的載體的復(fù)制，或促進(jìn)由核酸片段編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。載體可以是非病毒的或病毒的。用于重組核酸技術(shù)的載體的實(shí)例包括但不限于質(zhì)粒、染色體、人工染色體和病毒。該載體還可以是例如裸露的核酸(例如DNA)。在其最簡(jiǎn)單的形式中，該載體本身可以是相關(guān)核苷酸。
[0164]本發(fā)明中使用的載體例如可以是質(zhì)?；虿《据d體，并可以包括用于多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)子和任選該啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)子。
[0165]用于本發(fā)明的包含多核苷酸的載體可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)引入到細(xì)胞中，如轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。幾種技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，例如用重組病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、桿狀病毒和單純性皰疹病毒載體感染;直接注射核酸和生物射彈轉(zhuǎn)化。
[0166]非病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染法。這里，轉(zhuǎn)染包括使用非病毒載體向靶細(xì)胞遞送基因的過(guò)程。
[0167]通常的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、DNA生物射彈、脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、緊湊型DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染劑(11。<^6(31:；[11)、陽(yáng)離子試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子表面親水脂分子(CFAs)(Nature B1technology 1996 14; 556)及其組合。
[0168]此外，本發(fā)明可以采用基因靶向協(xié)議，例如DNA修飾劑的遞送。
[0169]病毒載體在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用病毒載體。
[0170]在另一實(shí)施方案中，該病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體。[〇171]在另一實(shí)施方案中，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。
[0172]逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體本發(fā)明中使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自或可以衍生自任何合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒。已經(jīng)確定了大量不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒。實(shí)例包括:鼠白血病病毒(MLV)、人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)、 小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米腫瘤病毒(FuSV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo MLV)、FBR小鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼氏小鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝爾遜氏白小鼠白血病病毒(A-MLV)、鳥(niǎo)類骨髓細(xì)胞瘤病毒-29(MC29)和鳥(niǎo)類成紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)清單可見(jiàn)于Coffin等人(1997) “Retroviruses”，Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus,第758-763 頁(yè)。
[0173]逆轉(zhuǎn)錄病毒可以大致分為兩類，8卩“簡(jiǎn)單”和“復(fù)雜”。逆轉(zhuǎn)錄病毒甚至可以進(jìn)一步分為七組。這些組中的五組代表具有致癌潛能的逆轉(zhuǎn)錄病毒。剩余兩組是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的綜述見(jiàn)于Coffin等人(1997)，同上。
[0174]逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)有許多共同特征，如5’ LTR和3’ LTR(使得能夠包裝基因組的包裝信號(hào)位于其之間或其之中)、引物結(jié)合位點(diǎn)、使得能夠整合到宿主細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn)以及編碼包裝組件的gag?、/和基因一一這些是裝配病毒粒子所需的多肽。慢病毒具有附加特征，如在HIV中的rer和RRE序列，這使得能夠?qū)⒄系那安《镜腞NA轉(zhuǎn)錄體由細(xì)胞核有效輸出至感染的目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。
[0175]在前病毒中，這些基因在兩個(gè)末端處側(cè)接稱為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)的區(qū)域。該 LTRs負(fù)責(zé)前病毒整合和轉(zhuǎn)錄。LTRs還充當(dāng)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列，并可以控制病毒基因的表達(dá)。
[0176]該LTRs本身是相同的序列，可以分為三個(gè)組分，其稱為U3、R和U5 W3衍生自RNA的 3 ’末端獨(dú)有的序列。R衍生自在RNA兩個(gè)末端處重復(fù)的序列，U5衍生自RNA的5 ’末端獨(dú)有的序列。三個(gè)組分的尺寸在不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒中可以顯著不同。[〇177]在有缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組中，gag?、/70^和e/3 r可以不存在或無(wú)功能。在 RNA兩個(gè)末端處的R區(qū)域是重復(fù)序列。U5和U3分別代表在RNA的5 ’和3 ’末端處的獨(dú)特序列。
[0178]在用于本發(fā)明的典型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，復(fù)制所必需的一個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的至少一部分可以從該病毒中除去。這使該病毒載體為復(fù)制缺陷型。該病毒基因組的部分還可以被操作性連接到調(diào)控區(qū)的庫(kù)編碼候選調(diào)制部分和該載體基因組中的報(bào)道基因部分替代以生成包含候選調(diào)制部分的載體，其能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)非分裂宿主細(xì)胞和/或?qū)⑵浠蚪M整合到宿主基因組中。
[0179]慢病毒載體是更大的一組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一部分。慢病毒的詳細(xì)清單可見(jiàn)于 Coffin等人(1997) “Retroviruses”，Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus，第758-763頁(yè)。簡(jiǎn)而言之，慢病毒可以分為靈長(zhǎng)類動(dòng)物組和非靈長(zhǎng)類動(dòng)物組。靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒的實(shí)例包括但不限于:人免疫缺陷癥病毒(HIV)、人免疫缺陷綜合征的病原體(AIDS)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒組包括原型“慢病毒”綿羊髓鞘脫落病毒/綿羊慢性進(jìn)行性肺炎病毒(VMV)，以及相關(guān)的山羊關(guān)節(jié)炎_ 腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和更近來(lái)描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
[0180]慢病毒家族不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒之處在于慢病毒能夠感染分裂和非分裂的細(xì)胞 (Lewis等人(1992) EMB0 J 11(8): 3053-3058,以及Lewis和Emerman (1994) J Virol 68 (1): 510-516)。相反，其它逆轉(zhuǎn)錄病毒如MLV不能感染非分裂或緩慢分裂的細(xì)胞，如構(gòu)成例如肌肉、腦、肺和肝臟組織的那些。
[0181]本文中所用的慢病毒載體是包含至少一個(gè)可以衍生自慢病毒的組成部分的載體。 優(yōu)選地，該組成部分涉及載體由此感染細(xì)胞、表達(dá)基因或被復(fù)制的生物學(xué)機(jī)制。
[0182]慢病毒載體可以是“非靈長(zhǎng)類”載體，即衍生自并非主要感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人的病毒。
[0183]非靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒的實(shí)例可以是不會(huì)天然地感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物的慢病毒科的任何成員，并可以包括貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒 (CAEV)、梅-維病毒(MVV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)。
[0184]該病毒載體可以衍生自EIAV』IAV具有最簡(jiǎn)單的慢病毒基因組結(jié)構(gòu)。除了 gag、poJ和基因之外，EIAV編碼三種其它基因:ta和^之。fa t充當(dāng)病毒LTR的轉(zhuǎn)錄激活因子(Derse和Newbold (1993) Virology 194(2):530_536,以及Maury等人(1994) Virology 200(2):632-642)，并且red!過(guò)rev應(yīng)答元件(RRE)調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)病毒基因的表達(dá) (Martarano等人(1994) J Virol 68(5):3102_3111)。這兩種蛋白質(zhì)的作用機(jī)制據(jù)認(rèn)為大致相似于靈長(zhǎng)類動(dòng)物病毒中的類似機(jī)制(Martarano等人(1994)1￥;[1'〇1 68(5):3102-3111)。的功能未知。此外，已經(jīng)確定了EIAV蛋白，Ttm，其通過(guò)被剪接到跨膜蛋白起始處的編碼序列的ta t的第一個(gè)外顯子來(lái)編碼。
[0185]本發(fā)明中使用的病毒載體優(yōu)選具有最小病毒基因組。
[0186]本文中所用的術(shù)語(yǔ)“最小病毒基因組”指的是病毒載體已經(jīng)被操縱以便去除非必需元件并保留必需元件以提供感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和遞送相關(guān)核苷酸序列至目標(biāo)宿主細(xì)胞所需的功能性。這種策略的更多細(xì)節(jié)可見(jiàn)于W0 1998/017815。
[0187]但是，用于在宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞中產(chǎn)生病毒基因組的質(zhì)粒載體將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列，這些調(diào)節(jié)控制序列操作性連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組以引導(dǎo)基因組在宿主細(xì)胞/ 包裝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。這些調(diào)節(jié)序列可以是與被轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，即5’ U3區(qū)域相關(guān)的天然序列，或者它們可以是異源啟動(dòng)子，如另一種病毒啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。一些慢病毒基因組需要額外的序列以便有效地產(chǎn)生病毒。例如特別是在HIV的情況下，可以包括rer和 RRE序列。但是，通過(guò)密碼子優(yōu)化可以減少或消除對(duì)rer和RRE的需要。這種策略的更多細(xì)節(jié)可見(jiàn)于W0 2001/079518。執(zhí)行與re r/RRE系統(tǒng)相同功能的替代性序列也是已知的。例如， re r/RRE系統(tǒng)的功能性類似物存在于Mason Pfizer猴病毒中。這被稱為組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件 (CTE)并包含被認(rèn)為與受感染細(xì)胞中的因子相互作用的該基因組中的RRE-型序列。該細(xì)胞因子可以被認(rèn)為是rer類似物。由此，CTE可以用作rer/RRE系統(tǒng)的替代物。已知或可用的任何其它功能等同物可以與本發(fā)明相關(guān)。例如，還已知HTLV-1的Rex蛋白可以在功能上替代 HIV-1的Rev蛋白。在本發(fā)明的方法中使用的載體中，和RRE可能不存在或無(wú)功能;在替代物中可能存在rer和RRE。
[0188]用于本發(fā)明的方法的載體可以使用其中已經(jīng)刪除病毒增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列的自身失活型(SIN)載體。SIN載體可以以類似于野生型載體的效率在體內(nèi)生成并轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。SIN前病毒中的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的轉(zhuǎn)錄失活應(yīng)通過(guò)可復(fù)制病毒防止動(dòng)員。這應(yīng)當(dāng)還能夠通過(guò)消除LTR的任何順式作用效果由內(nèi)部啟動(dòng)子進(jìn)行基因的調(diào)節(jié)表達(dá)。
[0189]例如，通過(guò)刪除轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或3’ LTR的U3區(qū)域中的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子，已經(jīng)構(gòu)建了自身失活型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。在一輪載體反轉(zhuǎn)錄和整合后，這些變化被拷貝到5’和3’ LTR中，產(chǎn)生無(wú)轉(zhuǎn)錄活性的前病毒。但是，此類載體中位于LTRs內(nèi)部的任何啟動(dòng)子仍將是轉(zhuǎn)錄活性的。這種策略已經(jīng)用于消除病毒LTRs中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子對(duì)來(lái)自內(nèi)部放置基因的轉(zhuǎn)錄的影響。此類影響包括提高的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄抑制。這種策略還可用于消除由3’ LTR向基因組DNA中的下游轉(zhuǎn)錄。這在其中重要的是防止內(nèi)源性致癌基因的偶發(fā)性激活的人類基因療法中是特別值得關(guān)注的。Yu等人，(1986) PNAS 83: 3194-98 ;Marty等人，(1990) B1chimie 72: 885_7;Naviaux 等人，(1996) J.Virol.70: 5701-5; Iwakuma 等人， (1999) Virol.261: 120-32;Deglon等人，(2000) Human Gene Therapy 11: 179-90〇
[0190]非復(fù)制型慢病毒載體在復(fù)制缺陷型慢病毒載體基因組中，gag?、/和可以不存在或無(wú)功能。
[0191]在用于本發(fā)明的典型慢病毒載體中，復(fù)制所必需的一個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的至少一部分可以從該病毒中除去。這使該病毒載體為復(fù)制缺陷型。該病毒基因組的部分還可以被相關(guān)核苷酸(N0I)替代以生成包含N0I的載體，其能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)非分裂宿主細(xì)胞和/ 或?qū)⑵浠蚪M整合到宿主基因組中。
[0192]在一個(gè)實(shí)施方案中，該慢病毒載體是W0 2007/071994中描述的非整合載體。
[0193]該慢病毒載體可以是“非靈長(zhǎng)類”載體，即衍生自并非主要感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人類的病毒。
[0194]腺病毒載體在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該載體可以是腺病毒載體。腺病毒是雙鏈的線性DNA病毒，其不經(jīng)過(guò)RNA中間體。存在超過(guò)50種不同的腺病毒的人血清型，其基于基因序列同源性分為6個(gè)亞組。腺病毒的天然目標(biāo)是呼吸道和消化道上皮細(xì)胞，通常僅引起輕微的癥狀。血清型2和5(具有95%的序列同源性)最常用于腺病毒載體系統(tǒng)，并通常與年輕人的上呼吸道感染相關(guān)。
[0195]腺病毒是無(wú)包膜的正二十面體。典型的腺病毒包含140納米包被的DNA病毒。該病毒的二十面體對(duì)稱性由152個(gè)殼粒組成:240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體。該顆粒的芯含有36 kb 線性雙鏈DNA，其在5 ’末端處與末端蛋白(TP)共價(jià)相連，所述末端蛋白充當(dāng)DNA復(fù)制的引物。 該DNA具有末端反向重復(fù)序列(ITR)，并且這些的長(zhǎng)度隨血清型而不同。
[0196]腺病毒能夠體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)導(dǎo)多種人和非人來(lái)源的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞包括呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、原代乳腺上皮細(xì)胞和有絲分裂后終末分化細(xì)胞如神經(jīng)元。
[0197]腺病毒載體也能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。這對(duì)疾病非常重要，如囊性纖維化，其中肺上皮細(xì)胞中受影響的細(xì)胞具有緩慢的更新率。事實(shí)上，一些實(shí)驗(yàn)正在利用囊性纖維化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CFTR)向患病成人囊性纖維化患者肺內(nèi)的腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。
[0198]腺病毒已經(jīng)用作用于基因療法和用于異源基因的表達(dá)的載體。大的(36 kb)基因組可以容納最多8 kb的外來(lái)插入DNA，并能夠在互補(bǔ)細(xì)胞系中有效地復(fù)制以制造高達(dá)1012 的極高滴度。腺病毒因此是研究原代非復(fù)制性細(xì)胞中的基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)之一。
[0199]病毒或來(lái)自腺病毒基因組的外源基因的表達(dá)不需要復(fù)制細(xì)胞。腺病毒載體通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦在細(xì)胞內(nèi)部，腺病毒載體很少整合到宿主染色體中。相反，它們?cè)谒拗骷?xì)胞核中基因游離地(獨(dú)立于宿主基因組)起到線性基因組的作用。因此，使用重組腺病毒減輕了與隨機(jī)整合到宿主基因組中相關(guān)的問(wèn)題。
[0200]腺相關(guān)病毒載體腺相關(guān)病毒(AAV)是用于本發(fā)明的有吸引力的載體系統(tǒng)，因?yàn)槠渚哂懈哒项l率，并且其可以感染非分裂細(xì)胞。這使其可用于在組織培養(yǎng)中向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中遞送基因。AAV具有廣泛的易感染宿主范圍。關(guān)于rAAV載體的生成和使用的細(xì)節(jié)描述在美國(guó)專利號(hào)5，139,941 和美國(guó)專利號(hào)4,797,368中。
[0201]重組AAV載體已經(jīng)成功地用于標(biāo)記物基因和涉及人類疾病的基因的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0202]單純性皰疹病毒載體單純性皰疹病毒(HSV)是一種包膜的雙鏈DNA病毒，其天然感染神經(jīng)元。其可以容納外源DNA的大片段，這使其作為載體系統(tǒng)具有吸引力，并已經(jīng)用作向神經(jīng)元遞送基因的載體。
[0203]在治療程序中使用HSV需要對(duì)菌株進(jìn)行減毒以使得它們不能建立裂解循環(huán)。特別地，如果HSV載體用于人體內(nèi)的基因療法，多核苷酸應(yīng)優(yōu)選插入到必需基因中。這是因?yàn)?，如果載體病毒遇到野生型病毒，將通過(guò)重組發(fā)生異源基因向野生型病毒中的轉(zhuǎn)移。但是，只要多核苷酸被插入必需基因，這種重組轉(zhuǎn)移將刪除容受病毒中的必需基因，并防止異源基因 “逃逸”到可復(fù)制型野生型病毒群中。
[0204]相關(guān)核苷酸本發(fā)明中使用的載體優(yōu)選包含相關(guān)核苷酸。
[0205]該相關(guān)核苷酸優(yōu)選產(chǎn)生治療效果。
[0206]合適的NOIs包括但不限于編碼酶、細(xì)胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化劑分子、工程化的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、mi cr oRNA、shRNA、s i RNA、核酶、mi RNA靶序列、靶蛋白的跨域負(fù)突變體、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、膜蛋白、表面受體、抗癌分子、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(如具有相關(guān)報(bào)告基團(tuán)的衍生物)的序列。該NOIs還可以編碼前藥激活酶。
[0207] N0I的一個(gè)實(shí)例是￠-球蛋白鏈，其可用于地中海貧血/鐮狀細(xì)胞疾病的基因療法。 [〇2〇8] NOIs還包括可用于治療需要骨髓系中的非緊急/選擇性基因修正的其它疾病的那些，如:慢性肉芽腫病(CGD，例如gp91ph〇x轉(zhuǎn)基因)、白細(xì)胞粘附缺陷、在未發(fā)生嚴(yán)重感染的患者體內(nèi)的其它巨噬細(xì)胞疾病和遺傳性骨髓衰竭綜合征(例如范可尼貧血癥)，以及原發(fā)性免疫缺陷(SCID)。
[0209]支持細(xì)胞群我們的預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)一一高度純化的HSC明顯更可被載體，特別是慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)——促使我們?cè)u(píng)估HSC基因療法方案的全新設(shè)計(jì)。該新方案包括將起始細(xì)胞群(例如獲自動(dòng)員的外周血、骨髓或臍帶血的細(xì)胞群)分離為富含HSC的級(jí)分(治療性細(xì)胞群，例如對(duì)于 CD34+細(xì)胞具有富集的HSC含量)和含有祖細(xì)胞的級(jí)分(支持細(xì)胞群)。后者可以在未經(jīng)離體操作的情況下冷凍并可以注入到受試者體內(nèi)以促進(jìn)骨髓脫離調(diào)理后的血液學(xué)恢復(fù)。高度純化的含有HSC的級(jí)分將使用如本文中所述的“最小”體外培養(yǎng)(相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方案降低的培養(yǎng)時(shí)間和載體劑量)來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)。[〇21〇]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，保留分離的表達(dá)CD38的細(xì)胞或CD38反應(yīng)性細(xì)胞或其一部分以形成支持細(xì)胞群。該群可以包含⑶38intl、CD38int2和/或⑶38+級(jí)分。
[0211]該治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群可以在其制備后冷凍以便于后繼移植之前的儲(chǔ)存。當(dāng)支持細(xì)胞群在制備該治療性細(xì)胞群的方法的早期階段分離時(shí)，優(yōu)選其應(yīng)當(dāng)在分離后盡快地冷凍，優(yōu)選在分離后立即冷凍。冷凍細(xì)胞以保持其存活的方法在本領(lǐng)域是公知的。
[0212]當(dāng)需要例如用于施用于受試者時(shí)，可以將冷凍的細(xì)胞解凍。[〇213] 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群可以利用在第二培養(yǎng)階段之前的預(yù)刺激階段，在此過(guò)程中細(xì)胞暴露于載體。在預(yù)刺激階段過(guò)程中，細(xì)胞可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含例如干細(xì)胞因子 (3〇卩)、？1^3配體汗1^31〇和促血小板生成素打?0)，以及任選113、116、11^1、]\^3?、？6卩-1、 IGF-2、IGFBP2、ANGPTL3或5。
[0214]細(xì)胞群例如可以是如本文中所述的治療性細(xì)胞群、CD34+⑶381田胞群、造血干細(xì)胞群或造血祖細(xì)胞群。
[0215]優(yōu)選地，該載體是慢病毒載體。
[0216]下面描述的標(biāo)準(zhǔn)或短方案可以在本文中所述的方法的過(guò)程中實(shí)施。但是，還要理解的是，標(biāo)準(zhǔn)方案和短方案可以在用載體(例如慢病毒載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的任何方法的過(guò)程中實(shí)施。這向本發(fā)明提供了進(jìn)一步的方面。
[0217]用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群可以使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行，其中細(xì)胞在施用于受試者之前經(jīng)歷44 小時(shí)或更久的培養(yǎng)。
[0218]本發(fā)明因此提供其中用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)細(xì)胞大約44小時(shí)或更久 (“標(biāo)準(zhǔn)”方案)的方法?！坝幂d體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟”應(yīng)理解為預(yù)刺激和載體暴露階段。[〇219]例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約44-66小時(shí)、44-60小時(shí)、 44-54小時(shí)或44-48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約 66、60、54、48 或 44 小時(shí)。
[0220]但是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間不利地影響造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功能植入能力。因此，本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了短轉(zhuǎn)導(dǎo)方案，其平衡了植入方面的改進(jìn)與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面的相應(yīng)降低。
[0221]本發(fā)明因此提供了其中用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)細(xì)胞小于大約44小時(shí)的方法(“短”方案)。
[0222]例如，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群可以培養(yǎng)大約12-42小時(shí)、12-36小時(shí)、 12-24小時(shí)或12-18小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群培養(yǎng)大約 42、36、30、24、18或12小時(shí)。在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟過(guò)程中，細(xì)胞群優(yōu)選培養(yǎng)大約24小時(shí)。
[0223]在標(biāo)準(zhǔn)方案或短方案中，該預(yù)刺激階段例如可以為大約12、14、16、18或22小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。優(yōu)選地，該預(yù)刺激階段具有大約16小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。
[0224]在標(biāo)準(zhǔn)方案或短方案中，該載體暴露階段例如可以為大約8、10、12、14或16小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。優(yōu)選地，該載體暴露階段具有大約8小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。
[0225]在標(biāo)準(zhǔn)方案或短方案中，用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟可以包括在將細(xì)胞施用于受試者之前重復(fù)該預(yù)刺激和載體暴露階段。例如，該細(xì)胞可以經(jīng)受預(yù)刺激，接著是載體暴露，接著是第二預(yù)刺激階段，接著是第二載體暴露階段。
[0226]優(yōu)選地，在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟的過(guò)程中該細(xì)胞培養(yǎng)基不包含IL3。
[0227]前列腺素￡2或前列腺素￡2衍生物(例如16，16-二甲基前列腺素￡2((11^6￡2))可以在預(yù)刺激階段過(guò)程中添加至細(xì)胞群。前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在預(yù)刺激階段開(kāi)始時(shí)、或在預(yù)刺激階段過(guò)程中加入。例如，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可以在細(xì)胞群暴露于載體之前大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小時(shí)加入。優(yōu)選地，前列腺素￡2或前列腺素E2衍生物在預(yù)刺激階段過(guò)程中在細(xì)胞暴露于載體之前大約2小時(shí)添加到細(xì)胞群中。在另一實(shí)施方案中，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物與暴露于載體同時(shí)添加到細(xì)胞群中。
[0228]實(shí)施例8中陳述了優(yōu)選的轉(zhuǎn)導(dǎo)方案。
[0229]藥物組合物本發(fā)明提供包含本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群的藥物組合物。
[0230]本發(fā)明的細(xì)胞可以用可藥用載體、稀釋劑或賦形劑配制以便施用于受試者。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖的鹽水，并可能含有人血清白蛋白。
[0231]細(xì)胞療法產(chǎn)品的處理優(yōu)選遵照用于細(xì)胞療法的FACT-JACIE國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。
[0232]造血干細(xì)胞移植本發(fā)明提供了用于醫(yī)學(xué)，例如用于基因療法的治療性細(xì)胞群。
[0233]該用途可以作為造血干細(xì)胞移植程序的一部分。
[0234]造血干細(xì)胞移植(HSCT)是衍生自骨髓(在這種情況下稱為骨髓移植)或血液的血液干細(xì)胞的移植。干細(xì)胞移植是血液學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域中的醫(yī)療方法，最通常對(duì)患有血液或骨髓疾病或某些類型的癌癥的人進(jìn)行。
[0235]許多HSCTs的接受者是多發(fā)性骨髓瘤或白血病患者，其將不會(huì)受益于長(zhǎng)期治療，或已經(jīng)耐受化療。HSCTs的候選者包括兒科病例，其中患者具有天生的缺陷如嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷或先天性中性白細(xì)胞減少，干細(xì)胞存在缺陷，以及在出生后失去他們的干細(xì)胞的患有再生障礙性貧血的孩子或成人。用干細(xì)胞移植治療的其它病癥包括鐮狀細(xì)胞疾病、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、尤因氏肉瘤、促纖維增生性小圓細(xì)胞腫瘤和何杰金氏病。更近來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了需要較小劑量的術(shù)前化療和輻射的非骨髓脫離性，或所謂“微移植”程序。這允許在被認(rèn)為過(guò)于虛弱以致不能承受常規(guī)治療方案的中老年和其他患者中進(jìn)行HSCT。
[0236]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該治療性細(xì)胞群與本發(fā)明的支持細(xì)胞群結(jié)合施用。
[0237]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群作為自體干細(xì)胞移植程序的一部分施用。
[0238]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群作為同種異體干細(xì)胞移植程序的一部分施用。
[0239]自體干細(xì)胞移植程序應(yīng)理解為起始細(xì)胞群(該治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群衍生于此)獲自施用該治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群的同一受試者。如上所述，自體移植程序是有利的，因?yàn)樗鼈儽苊饬伺c免疫學(xué)的組織不相容性相關(guān)的問(wèn)題，并可用于受試者而不考慮基因匹配供體的可得性。
[0240]同種異體干細(xì)胞移植程序理解為起始細(xì)胞群(該治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群衍生于此)獲自與施用該治療性細(xì)胞群和/或支持細(xì)胞群的受試者不同的受試者。優(yōu)選地， 該供體與施用該細(xì)胞的受試者基因匹配以盡量減少免疫學(xué)的組織不相容性的風(fēng)險(xiǎn)。
[0241]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該治療性細(xì)胞群在施用支持細(xì)胞群之前施用于受試者。
[0242]該治療性細(xì)胞群例如在施用該支持細(xì)胞群之前大約1-72、12-60或24-48小時(shí)，如施用該支持細(xì)胞群之前大約1、2、3、4、5、6、12、18、24、30、36、42、48、60或72小時(shí)施用于受試者。
[0243]在另一實(shí)施方案中，該治療性細(xì)胞群與施用支持細(xì)胞群同時(shí)期或同時(shí)地施用于受試者。
[0244]合適劑量的治療性和支持細(xì)胞群使得是治療和/或預(yù)防有效的。待施用的劑量可能取決于待治療的受試者與病癥，并可以容易地由技術(shù)人員確定。
[0245]支持細(xì)胞群中⑶34+CD38+細(xì)胞的可能劑量可能為大約4-5百萬(wàn)細(xì)胞/千克。該劑量應(yīng)確保在骨髓脫離調(diào)理后及時(shí)短期植入。
[0246]因此，當(dāng)本發(fā)明的支持細(xì)胞群并未對(duì)CD34+細(xì)胞富集時(shí)，該支持細(xì)胞群的可能的目標(biāo)劑量可以為大約50-1000百萬(wàn)⑶38+有核細(xì)胞/千克，如大約100百萬(wàn)細(xì)胞/千克(假定⑶34+ 細(xì)胞濃度為5%)。例如，衍生自動(dòng)員的外周血的細(xì)胞的可能劑量可以為大約100-500百萬(wàn)細(xì)胞/千克，而衍生自骨髓的細(xì)胞的可能劑量可以為大約50-200百萬(wàn)細(xì)胞/千克。
[0247]治療性細(xì)胞群的可能劑量可以為大約0.1-2百萬(wàn)細(xì)胞/千克，例如大約0.5-1百萬(wàn)細(xì)胞/千克。
[0248]治療性細(xì)胞群:支持細(xì)胞群的總比率取決于臨床情況，并取決于制備支持細(xì)胞群的方式。在其中通過(guò)未預(yù)先進(jìn)行CD34富集的CD38選擇(例如白細(xì)胞分離法或骨髓收獲)制備支持細(xì)胞群的情況下，治療性細(xì)胞群:支持細(xì)胞群的總比率可以為大約1:100-1:1000，例如大約1:500或1:100。優(yōu)選根據(jù)其中所含的CD34+細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量來(lái)定量施用支持細(xì)胞群(與是否進(jìn)行⑶34+預(yù)富集無(wú)關(guān))。
[0249]在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)受試者已經(jīng)經(jīng)受骨髓脫離調(diào)理時(shí)，細(xì)胞的劑量可以調(diào)整以使得在支持細(xì)胞群中施用的CD34+細(xì)胞的數(shù)量為大約5-15 X、優(yōu)選5-10 X在治療性細(xì)胞群中施用的CD34+細(xì)胞的數(shù)量。由此，例如，施用于受試者的CD34+CD381H胞對(duì)未培養(yǎng)的CD34+ ⑶38+祖細(xì)胞的比率可以為大約1:10或1: 5。
[0250]待施用的支持細(xì)胞群可以包含最小絕對(duì)數(shù)量大約2.5-3百萬(wàn)⑶34+細(xì)胞/千克患者體重。
[0251]當(dāng)受試者未經(jīng)骨髓脫離調(diào)理時(shí)，該治療性細(xì)胞群可以單獨(dú)施用于受試者(即可以不需要支持細(xì)胞群)。
[0252]本發(fā)明的治療性和/或支持細(xì)胞群可用于治療W0 1998/005635中列舉的病癥。為了容易參考，下面提供該疾病列表的部分:癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病癥、發(fā)熱、心血管作用(card1vascular effects)、出血、凝血和急性期反應(yīng)、惡病質(zhì)、食欲缺乏、急性感染、 HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成;腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和擴(kuò)散、血管生成、轉(zhuǎn)移瘤、惡性腫瘤、腹水和惡性胸腔積液;腦缺血、缺血性心臟病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、脈管炎、克羅恩病(Crohr/s disease) 和潰瘍性結(jié)腸炎;牙周炎、齦炎;銀肩病、特應(yīng)性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和手術(shù)傷口愈合;鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、濕疹、過(guò)敏反應(yīng);再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位癥、動(dòng)脈粥樣硬化或內(nèi)皮硬化(endosc 1 eros i s )。
[0253]此外，或在備選方法中，本發(fā)明的治療性和/或支持細(xì)胞群可用于治療WO 1998/ 007859中列舉的病癥。為了容易參考，下面提供該列表的部分:細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性;免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治療免疫缺陷，包括被人免疫缺陷病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng);治療癌癥和許多自身免疫病，并防止移植排斥或誘導(dǎo)腫瘤免疫力)；調(diào)節(jié)造血作用，例如治療骨髓病或淋巴病;促進(jìn)骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長(zhǎng)，例如用于傷口愈合、治療燒傷、潰瘍和牙周病和神經(jīng)變性;抑制或激活促卵泡激素(調(diào)節(jié)生育力)；趨化/化學(xué)激動(dòng)活性(例如用于將特定細(xì)胞類型動(dòng)員到損傷或感染部位);止血和溶栓活性(例如用于治療血友病和中風(fēng));抗炎活性(用于治療例如敗血癥性休克或克羅恩病);作為抗微生物藥;例如代謝或行為(behav1ur)的調(diào)節(jié)劑;作為鎮(zhèn)痛藥;治療特定營(yíng)養(yǎng)缺乏癥;用于治療例如銀肩病、用于人用或獸用藥物。
[0254]此外，或在備選方法中，本發(fā)明的治療性和/或支持細(xì)胞群可用于治療W0 1998/ 009985中列舉的病癥。為了容易參考，下面提供該列表的部分:巨噬細(xì)胞抑制和/或T細(xì)胞抑制活性及因而的抗炎活性;抗免疫活性，即針對(duì)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答(包括與炎癥無(wú)關(guān)的反應(yīng))的抑制作用；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞粘附胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白的能力，以及增量調(diào)節(jié)fas受體在T細(xì)胞中的表達(dá);抑制不良免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、超敏反應(yīng)相關(guān)炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原病和其它自身免疫病、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心臟停搏、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺病、與消化性潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎和胃腸道的其它疾病相關(guān)的炎癥、肝纖維化、肝硬化或其它肝病、甲狀腺炎或其它腺病、腎小球性腎炎或其它腎病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙病、睪丸炎或附睪-睪丸炎、不育癥、睪丸創(chuàng)傷或其它免疫相關(guān)的睪丸疾病、胎盤(pán)功能障礙、 胎盤(pán)功能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、子癇、先兆子癇和其它免疫和/或炎癥相關(guān)性婦科疾病、后葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、前葡萄膜炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)炎、目艮內(nèi)炎癥例如視網(wǎng)膜炎或囊樣黃斑水腫、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、退行性眼底病變(degenerative fondus disease)的免疫和炎性成分、眼外傷的炎性成分、由感染引起的眼炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病、急性缺血性視神經(jīng)病變、例如青光眼濾過(guò)手術(shù)后的過(guò)度瘢痕形成、對(duì)眼植入物的免疫和/或炎癥反應(yīng)及其它免疫和炎癥相關(guān)性眼科疾病、其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官兩者中免疫和/或炎癥抑制可能有益的與自身免疫病或病況或病癥有關(guān)的炎癥、帕金森病(Parkinsor/ s disease)、因帕金森病治療引起的并發(fā)癥和/或副作用、艾滋病相關(guān)癡呆綜合癥、HIV相關(guān)腦病、德維克病、小舞蹈病、阿爾茨海默氏病和CNS的其它變性疾病、病況或病癥、中風(fēng)的炎性成分、脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、精神障礙的免疫和炎性成分、脊髓炎、腦炎、亞急性致硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、格-巴綜合征(Guillaim-Barre syndrome)、小舞蹈病、重癥肌無(wú)力、假腦瘤、唐氏綜合征、亨廷頓舞蹈病(Huntingtor/ s disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化、CNS壓迫或 CNS創(chuàng)傷或CNS感染的炎性成分、肌萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良的炎性成分、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥相關(guān)疾病、病況或病癥、創(chuàng)傷后炎癥、敗血癥性休克、感染性疾病、手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用、基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用(例如因病毒載體感染所致)或愛(ài)滋病相關(guān)炎癥、用于阻抑或抑制體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答、通過(guò)減少單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量治療或改善單核細(xì)胞或白細(xì)胞增殖性疾病(例如白血病)、在移植天然或人工細(xì)胞、組織和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起博器、天然或人工皮膚組織)的情況下用于預(yù)防和/或治療移植排斥。[〇255]試劑盒在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的治療性細(xì)胞群和支持細(xì)胞群的試劑盒。
[0256]該治療性細(xì)胞群和支持細(xì)胞群可以在合適的容器中提供。
[0257]該試劑盒還可以包括使用說(shuō)明。
[0258]造血祖細(xì)胞移植本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0259]如我們已經(jīng)表明的那樣，此類祖細(xì)胞提供短期植入。因此，此類基因療法將在受試者體內(nèi)提供非永久效果。例如，該效果可以限于施用該轉(zhuǎn)導(dǎo)造血祖細(xì)胞后1-6個(gè)月。由于治療干預(yù)的自限性，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是更好的安全性和耐受性。[〇26〇]因此，我們可以調(diào)整基因修飾的細(xì)胞的持久性(參見(jiàn)實(shí)施例3)。例如，可以設(shè)想，可以根據(jù)需要相關(guān)核苷酸的表達(dá)的時(shí)間長(zhǎng)度施用不同的細(xì)胞群用于治療不同的病癥，如:1.長(zhǎng)期:CD34+CD3&細(xì)胞(例如0-10%百分位數(shù))用于治愈遺傳性遺傳疾??；2.中期:CD34+CD38inV1°細(xì)胞(例如12-40%百分位數(shù))用于大約3-4個(gè)月的治療持續(xù)時(shí)間 (例如用于抗癌蛋白質(zhì)的微環(huán)境靶向遞送)；3.短期:CD34+CD38+Ant細(xì)胞(例如41-70%百分位數(shù))用于大約1-2個(gè)月的治療持續(xù)時(shí)間 (例如用于抗癌蛋白質(zhì)的微環(huán)境靶向遞送)。
[0261]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已經(jīng)從包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群中分離并隨后用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0262]此類造血祖細(xì)胞基因療法可以適于治療后天性疾病，例如癌癥，其中(可能有毒的)抗癌相關(guān)核苷酸的時(shí)間受限的表達(dá)足以根除該疾病。
[0263]特別適于在造血祖細(xì)胞基因療法中應(yīng)用的相關(guān)核苷酸包括例如干擾素-alpha2b、 其它1型干擾素、其它免疫刺激細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因如TNF相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和腫瘤微環(huán)境破壞性因子。
[0264]在一個(gè)實(shí)施方案中，該造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int表型，例如該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)⑶34+⑶38int表型進(jìn)行了富集。
[0265]具有⑶34+⑶38int表型的細(xì)胞群可以使用流式細(xì)胞術(shù)法分離。該⑶38^造血祖細(xì)胞群可以包含在通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所確定的CD38表達(dá)的10-70%范圍內(nèi)(參見(jiàn)例如實(shí)施例3和圖4——這里⑶38int群已經(jīng)進(jìn)一步分離為⑶38intl和⑶38int2)。造血干細(xì)胞可以包含在⑶38 表達(dá)的0-10%范圍內(nèi)。
[0266]在另一實(shí)施方案中，該造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38intl，CD34+CD38int2和/或CD34+ CD38+表型，例如，該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型進(jìn)行了富集。由此，例如，該祖細(xì)胞群可以基本上包含CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或 CD34+CD38+細(xì)胞。
[0267]在另一實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)祖細(xì)胞群與造血干細(xì)胞群，例如未修飾的造血干細(xì)胞組合施用。該造血干細(xì)胞可以具有⑶34+CD38_表型。[〇268]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的具有⑶34+⑶38int表型的細(xì)胞群，例如對(duì)具有CD34+CD38int表型的細(xì)胞進(jìn)行了富集的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0269]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/ 或 CD34+CD38+表型的細(xì)胞群，例如對(duì)具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2 和/或 CD34+CD38+表型的細(xì)胞進(jìn)行富集的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。由此，例如，該祖細(xì)胞群基本上包含CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+細(xì)胞。
[0270]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int表型(例如該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)⑶34+⑶38int表型進(jìn)行了富集)并已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0271]在另一方面，本發(fā)明提供了用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型(例如該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)CD34+ CD38intl，CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型進(jìn)行了富集)并已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。由此， 例如，該祖細(xì)胞群可以基本上包含⑶34+⑶38int1、⑶34+⑶38int2和/或⑶34+⑶38+細(xì)胞。
[0272]在另一方面，本發(fā)明提供了制備用于臨床應(yīng)用的造血祖細(xì)胞群的方法，所述方法包括從包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群中分離造血祖細(xì)胞群，并用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞群。
[0273]在一個(gè)實(shí)施方案中，該造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int表型，例如該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)⑶34+⑶38int表型進(jìn)行了富集。
[0274]在另一實(shí)施方案中，該造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+ CD38+表型，例如該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)對(duì)CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型進(jìn)行了富集。由此，例如，該祖細(xì)胞群可以基本上包含CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或 CD34+CD38+細(xì)胞。
[0275]治療方法要理解的是，本文中所有提到治療包括治愈、治標(biāo)和預(yù)防性治療;盡管在本發(fā)明上下文中提到預(yù)防更通常與預(yù)防性治療相關(guān)。哺乳動(dòng)物，特別是人的治療是優(yōu)選的。人和獸醫(yī)治療均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[〇276]前列腺素當(dāng)用載體，優(yōu)選病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞時(shí)，前列腺素E2或前列腺素E2衍生物可用于提高基因轉(zhuǎn)移效率。
[0277]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該前列腺素E2衍生物是16,16-二甲基前列腺素E2。 [〇278]衍生物應(yīng)理解為前列腺素E2被本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)的任一種修飾，優(yōu)選以改善性質(zhì)如穩(wěn)定性和活性，同時(shí)仍保留其在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞時(shí)提高基因轉(zhuǎn)移效率的功能。
[0279]還可以設(shè)想，在本文中描述的任何方面和實(shí)施方案中，該前列腺素E2或前列腺素 E2衍生物可以被前列腺素受體激動(dòng)劑取代，例如作用于EP4受體的小分子藥物。
[0280]實(shí)施例實(shí)施例1高度純化的HSC更易被慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)我們研究了 microRNA對(duì)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群的不同影響。為此，用慢病毒miRNA海綿或過(guò)表達(dá)載體(數(shù)據(jù)未顯示)轉(zhuǎn)導(dǎo)⑶34+CD38-和⑶34+⑶38+臍帶血HSPCs。預(yù)料不到地并且與本領(lǐng)域中普遍認(rèn)為的相反，我們注意到提高1.5倍的基因轉(zhuǎn)移到更初級(jí)的CD34+CD3K HSC富集的子集中。我們獨(dú)立地證實(shí)了使用表達(dá)標(biāo)記物基因的生物中性載體對(duì)多個(gè)臍帶血和成人骨髓供體的觀察結(jié)果，顯示了與批量CD34+或CD34+CD38+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)相比進(jìn)入分選的CD34+ ⑶3K HSC富集級(jí)分的提高1.5至2倍的基因轉(zhuǎn)移效率(圖1 (A))。
[0281]由于本體⑶34+ HSPCs含有小的⑶38_細(xì)胞子集，我們想要測(cè)試這種更初級(jí)的細(xì)胞的提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)性是否還能在批量培養(yǎng)中保持，或者預(yù)分選對(duì)發(fā)現(xiàn)此類效果是否是必要的。 我們因此進(jìn)行了分選-LV方案(首先分選CD38亞群，隨后在24小時(shí)的預(yù)刺激后進(jìn)行慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo))與LV-分選方案(24小時(shí)預(yù)刺激，隨后進(jìn)行慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)分選 ⑶38亞群)的并列比較。雖然在LV-分選組中提高的⑶381田胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)也是明顯的，如果在轉(zhuǎn)導(dǎo)前進(jìn)行分選，該效果明顯更大(圖1 (A))。[〇282]由此，對(duì)高度純化的HSC富集的亞群的工作在轉(zhuǎn)導(dǎo)方面給出了明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0283]我們已經(jīng)證實(shí)，與批量⑶34+細(xì)胞相反，提高的向預(yù)純化⑶34+CD38- HSPCs中的基因轉(zhuǎn)移在異種移植后在體內(nèi)保持(圖1 (B))。這些數(shù)據(jù)表明，該效果在造血干細(xì)胞水平下存在，并有可能在經(jīng)歷基因療法的患者體內(nèi)長(zhǎng)期存留。
[0284]實(shí)施例2基于珠的分別對(duì)CD38和CD34的連續(xù)負(fù)/正選擇能夠提純具有優(yōu)異的NSG植入潛力的細(xì)胞。
[0285]為了測(cè)試基于珠的分別對(duì)⑶38和⑶34A的連續(xù)負(fù)/正選擇的可行性，我們將市售⑶38選擇試劑盒應(yīng)用于人臍帶血單核細(xì)胞并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性移植在NSG小鼠中測(cè)試了⑶38_(通過(guò)正選擇進(jìn)一步富集了⑶34)和⑶38+級(jí)分的植入潛力(圖2)。即使我們使用第一代、未優(yōu)化的選擇方案，我們可以清楚地證明CD3K級(jí)分的植入優(yōu)勢(shì)。而CD381田胞構(gòu)成該移植物的小于 20%，70-80%的長(zhǎng)期植入衍生自該級(jí)分，激勵(lì)了對(duì)該純化方案的進(jìn)一步優(yōu)化。
[0286]實(shí)施例3NSG小鼠中的分割移植的建模為了對(duì)基因修飾長(zhǎng)期再植細(xì)胞與短期祖細(xì)胞的共同移植建模，我們用一組表達(dá)熒光蛋白的慢病毒載體(LV)不同地標(biāo)記干細(xì)胞富集級(jí)分和各種祖細(xì)胞級(jí)分，并在競(jìng)爭(zhēng)與非競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中研究了在NSG小鼠中的植入動(dòng)力學(xué)。
[0287]首先，將 CD34+成人骨髓 HSPC 分選為 CD34+CD38—(+/-)和 CD34+CD38hi(+/hi )細(xì)胞，在含有SCF(300納克/毫升)、Flt3L(300納克/毫升)、TP0( 100納克/毫升)、IL6(60納克/毫升) 和dmPGE2(10 yM)的Stem Span SFEM中預(yù)刺激 16小時(shí)，并用GFP-LV(+/_)或0FP-LV(+/hi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)后，如下將細(xì)胞注入8周齡、亞致死量照射過(guò)的NSG小鼠:第1組:每只小鼠27，000 +/-細(xì)胞(n=3);第2組:每只小鼠248,000 +/111細(xì)胞(11=3);第3組:每只小鼠27,000 +/-和248,000 +/111細(xì)胞(11=3)在外周血中經(jīng)時(shí)監(jiān)控植入(第1、2、3組)和嵌合性(第3組)，并在移植后18周分析造血器官(圖3)。
[0288]我們發(fā)現(xiàn)，CD34+/CD38h￥H胞并未在小鼠中植入，甚至在移植后3周的短期內(nèi)也未植入。在第3組中，其中我們將0FP-陽(yáng)性⑶347⑶38hi細(xì)胞與GFP-陽(yáng)性⑶347⑶38—細(xì)胞混合， 我們經(jīng)時(shí)并在指定的造血亞群(HSC:CD34+CD38—CD90+CD45RA—;MPP:CD34+CD38—CD90— CD45RA—;MLP: CD34+CD38—CD90—CD45RA+)中跟蹤GFP/0FP嵌合性。引人注目的是，該CD34+/ CD38hl衍生細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)過(guò)程中以及在骨髓和脾臟中幾乎不存在(后者未顯示)。
[0289]我們的結(jié)論是:CD34+/CD381田胞含有大多數(shù)(如果不是全部的話)SCID再生潛力， 短期以及長(zhǎng)期。
[0290]接著，我們移至CD34+動(dòng)員的外周血(MTO)細(xì)胞(購(gòu)自Stem Cell Technologies)，因?yàn)檫@是與兒科環(huán)境相比更迫切地需要改進(jìn)基因療法方案的成人患者中的優(yōu)選HSC來(lái)源 (圖4)。我們將⑶34+分選為具有提高的⑶38表達(dá)水平的4個(gè)亞群(CD34+/⑶38—;⑶34+/CD38intl;CD34+/CD38int2;CD34+/CD38hi)，在含有 SCF(300 納克 / 毫升)、Flt3L(300 納克 / 毫升)、TP0(100納克/毫升)、IL6(60納克/毫升)和dmPGE2(10 yM)的Stem Span SFEM中預(yù)刺激這些亞群16小時(shí)，并用以下LVs轉(zhuǎn)導(dǎo)該亞群:+/-:GreenFP ? LV;+/intl: CherryFP ? LV; +/ int2: CyanFP.LV; +/h1: OrangeFP.LV。在轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)后，如下將細(xì)胞注入8周齡、亞致死量照射過(guò)的NSG小鼠:第1組:每只小鼠129，000 +/-細(xì)胞(n=6 );第2組:每只小鼠869,000祖細(xì)胞(+八1^1、+八的2和+/1^細(xì)胞之和，各群落向祖細(xì)胞混合物貢獻(xiàn)33%)(n=7);第3組:每只小鼠129，000 +/-和869，000匯集的祖細(xì)胞的混合物(n=6)在外周血中經(jīng)時(shí)監(jiān)控植入(第1、2、3組)和嵌合性(第3組)(圖4(A))。
[0291]CD34+CD38hi(+/hi)細(xì)胞顯示在早期時(shí)間點(diǎn)處在NSG小鼠中幾乎沒(méi)有但可檢測(cè)的植入潛力，它們的輸出隨后消失。有趣的是，來(lái)自MPB的CD34+CD38飛+/-)群在移植后3周幾乎不顯示造血輸出。相反，在該時(shí)間點(diǎn)的短期植入大部分被CD34+CD38int細(xì)胞維持(int2 > inti)。在移植后9-15周，不同級(jí)分的貢獻(xiàn)改變:第1組和第3組現(xiàn)在顯示類似的人⑶45+細(xì)胞植入水平。在第3組中，其用所有干細(xì)胞和祖細(xì)胞群的混合物移植，該CD34+CD38X+/-)群貢獻(xiàn)>70-80%的huCD45+和>98%的huCD13+植入，而+/intl貢獻(xiàn)了大約20-10%的B細(xì)胞。在9和15 軸的時(shí)間點(diǎn)處，該+/int2與+/hi細(xì)胞未顯示對(duì)造血的顯著貢獻(xiàn)。
[0292]我們的結(jié)論是:來(lái)自的⑶34+⑶38-(+/-)細(xì)胞含有大多數(shù)(如果不是全部的話) 長(zhǎng)期SCID再生潛力，而短期再生由CD34+/CD38int2—high(第一波)和CD34+/CD38intl細(xì)胞(第二波)提供。這證明了以下原則:G-CSF-動(dòng)員衍生⑶34+⑶38_細(xì)胞(所有⑶34+細(xì)胞的10%)的基因修飾通過(guò)基因修飾細(xì)胞足以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)(如果并非全部的話)的長(zhǎng)期植入。在轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)中是否包括CD34+/CD38int細(xì)胞的選擇取決于其中需要實(shí)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞接管造血作用的時(shí)間框架。相反，該CD34+/CD38int2細(xì)胞提供了短期植入，并代表了以未培養(yǎng)、未基因修飾的支持細(xì)胞的形式給出以便在調(diào)理后促進(jìn)造血恢復(fù)的理想種群，降低了經(jīng)受基因療法的患者的感染和出血性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。[〇293]在較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)持續(xù)進(jìn)行圖4(A)中顯示的研究提供了進(jìn)一步的了解。圖4(B)顯示了研究持續(xù)至24周，其提供了長(zhǎng)期讀出測(cè)量穩(wěn)定的、HSC衍生的造血作用。此外，我們已經(jīng)進(jìn)行了使用另一動(dòng)員的外周血供體并變更了標(biāo)記該CD38級(jí)分的慢病毒載體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0294]長(zhǎng)期分析證實(shí)，>95%的長(zhǎng)期植入衍生自培養(yǎng)的⑶34+動(dòng)員外周血HSPC的⑶38_級(jí)分 (最低12%的⑶38表達(dá)細(xì)胞)。這些數(shù)據(jù)還支持了由不同的⑶38表達(dá)水平限定的祖細(xì)胞群的植入動(dòng)力學(xué):⑶38intA°(12-40%⑶38百分位數(shù))細(xì)胞在第3周給出了它們的最高貢獻(xiàn)，并經(jīng)4 個(gè)月的時(shí)間窗口緩慢衰減;CD38+Ant(41-70% CD38百分位數(shù))細(xì)胞在第3周給出了它們的最高貢獻(xiàn)，并經(jīng)2個(gè)月的時(shí)間窗口快速衰減。⑶38hi(71-100%⑶38百分位數(shù))細(xì)胞在第3周時(shí)給出了低植入。
[0295]這些數(shù)據(jù)使我們能夠定制該基因修飾細(xì)胞的持久性:?長(zhǎng)期:⑶34+⑶3&細(xì)胞(0-10%百分位數(shù))，用于治愈遺傳疾病；?中期:⑶34+⑶38intA°細(xì)胞(12-40%百分位數(shù))，用于3-4個(gè)月的治療持續(xù)時(shí)間(例如用于抗癌蛋白的微環(huán)境靶向遞送)；?短期CD34+CD38+Ant細(xì)胞(41 -70%百分位數(shù))用于大約卜2個(gè)月的治療持續(xù)時(shí)間(例如用于抗癌蛋白質(zhì)的微環(huán)境靶向遞送)。
[0296]實(shí)施例4前列腺素E2提高了向具有NSG再生潛力的人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移嘗試?yán)们傲邢偎谽2(PGE2)的抗凋亡性質(zhì)(Pelus LM等人Prostaglandins Other Lipid Mediat.2011;96:3-9)，我們用長(zhǎng)效?6￡2同系物16，16-二甲基前列腺素￡2((111^6￡2; Cayman Chemical，Cat 14750)處理暴露于應(yīng)力的CD34+ HSPC(冷凍/解凍循環(huán)，用有毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，電穿孔)。預(yù)料不到地，我們發(fā)現(xiàn)在dmPGE2處理后向來(lái)自臍帶血(圖5(A))和成人骨髓 (圖6)的⑶34+或⑶34+⑶38— HSPC中的基因轉(zhuǎn)移效率提高了 1.5倍。這種在載體拷貝數(shù)(VCN) 方面的差異在該細(xì)胞移植到NSG小鼠中之后保持超過(guò)4個(gè)月，并且植入水平未受dmPGE2處理的負(fù)面影響。
[0297]我們已經(jīng)證實(shí)，如果用dmPGE2預(yù)刺激的話，G-CSF-動(dòng)員⑶34+外周血干細(xì)胞還經(jīng)歷更高效的慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖5(B))。
[0298]此外，我們已經(jīng)研究了 dmPGE2刺激的時(shí)間選擇對(duì)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人HSPCs的影響。 當(dāng)在LV暴露前2小時(shí)加入dmPGE2時(shí)，該影響似乎最大化(圖5(C))。[〇299]此外，我們已經(jīng)在附加實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，通過(guò)dmPGE2體外刺激獲得的提高的載體拷貝數(shù)長(zhǎng)期保持，高達(dá)異種移植后18周(圖5 (D))。
[0300]總之，我們?cè)谶@里首次展示了更原始的HSC制劑更容易被VSVg-假型，第三代慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其效果可以通過(guò)用dmPGE2預(yù)刺激來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)。我們已經(jīng)制定了創(chuàng)新的HSC基因療法方案，其在體外操作中結(jié)合了這些改進(jìn)。我們對(duì)來(lái)自來(lái)自臍帶血、骨髓和動(dòng)員的外周血的人HSC測(cè)試了這種新的方案，基于使用現(xiàn)有技術(shù)的NSG異種移植模型在CD38表達(dá)方面的量化差異首次將免疫表型限定的CD34+動(dòng)員的外周血群落的多譜系重建動(dòng)力學(xué)去卷積，并從具有快速短期再生潛力的祖細(xì)胞中分離了長(zhǎng)期多譜系移植細(xì)胞(全部CD34+細(xì)胞的〈 10%)。這種方案將通過(guò)以下特征改善安全性:通過(guò)改善的體外培養(yǎng)提供質(zhì)量更好的基因修飾HSC級(jí)分，通過(guò)未培養(yǎng)的祖細(xì)胞延續(xù)快速造血恢復(fù)，以及向患者輸注較低的累積劑量。這還通過(guò)大幅度降低載體劑量改善了 HSC基因療法的可持續(xù)性。
[0301]實(shí)施例5臨床方案(改編自Biffi A等人Science 2013;341:1233158):全部骨髓按照內(nèi)部S0P 在無(wú)菌條件下且使用全身麻醉收集自髂嵴?；蛘?，患者通過(guò)從第-3天開(kāi)始的5-10微克/千克 G-CSF經(jīng)受HSPC動(dòng)員，在白細(xì)胞分離法之前6-9小時(shí)使用或不使用單一劑量的plerixaphor。 收獲的骨髓或動(dòng)員的外周血，收集在專用袋中，密封并鑒別，隨后轉(zhuǎn)移到GMP設(shè)施。通過(guò)負(fù)/ 正選擇使用免疫磁珠按照制造商的程序(Miltenyi B1tec，Bergisch_Gladbach，Germany) 在GMP條件中進(jìn)行細(xì)胞純化。純化的細(xì)胞隨后在涂有纖維連接蛋白的VueLife袋(American Fluoroseal，Gaithersburg，MD)中在補(bǔ)充有GMP級(jí)別細(xì)胞因子(見(jiàn)上文)的無(wú)血清介質(zhì)中培養(yǎng)并在30-100的多次感染下暴露于GMP級(jí)別的純化載體一次或兩次，總培養(yǎng)時(shí)間為40-60小時(shí)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)程序結(jié)束時(shí)，收獲轉(zhuǎn)導(dǎo)⑶34+細(xì)胞，用Cel 1 Grow介質(zhì)洗滌并以2-10 X 106細(xì)胞/毫升的濃度重新懸浮在鹽水溶液中以便輸注到患者體內(nèi)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)束時(shí)，如上收集細(xì)胞級(jí)分用于克隆試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和體外培養(yǎng)。細(xì)胞保持在4°C下直到輸注時(shí)，根據(jù)品質(zhì)控制測(cè)試批量釋放時(shí)(輸注時(shí)可獲得的結(jié)果:生存能力、免疫表型、內(nèi)毒素、大T Ag DNA、支原體)。
[0302]實(shí)施例6對(duì)培養(yǎng)/轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+CD3&干細(xì)胞與未培養(yǎng)的CD34+CD38inV11細(xì)胞的共同施用建模圖7中顯示的數(shù)據(jù)涉及未培養(yǎng)的CD34+CD38intA動(dòng)員的外周血祖細(xì)胞(祖細(xì)胞)與基因修飾的⑶34+⑶38_ HSPC(干細(xì)胞)的結(jié)合移植。該實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于培養(yǎng)/轉(zhuǎn)導(dǎo)⑶34+⑶38int/+細(xì)胞，未培養(yǎng)的⑶34+CD38intA(13-100%⑶38百分位數(shù))祖細(xì)胞堅(jiān)持更長(zhǎng)時(shí)間，并具有更高的再生能力。[〇3〇3] 這意味著:1.作為支持細(xì)胞群提供給患者的新鮮祖細(xì)胞將可能加速和鞏固基因療法患者體內(nèi)的造血恢復(fù)，從而顯著降低治療后第一個(gè)月的感染和出血并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)；2.基因修飾干細(xì)胞超出新鮮祖細(xì)胞的比(目前1:8 )可以偏向干細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)(例如1: 5)以改善有效的長(zhǎng)期基因標(biāo)記；3.⑶34+CD38intl群的部分可以從支持細(xì)胞群中去除以減少與基因修飾的⑶34+⑶38 一細(xì)胞的克爭(zhēng)；4.短的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)獲得高度功能性的基因修飾的HSC至關(guān)重要。改善基因修飾的HSC的功能特性使得點(diǎn)(2 )和(3 )中描述的干預(yù)變得不那么關(guān)鍵，如通過(guò)對(duì)1:5和1:10比例在體內(nèi)的⑶34+和⑶33high細(xì)胞中的類似基因標(biāo)記所顯示的那樣(參見(jiàn)圖7B)。[〇3〇4]實(shí)施例7圖5、7和9中的數(shù)據(jù)表明，培養(yǎng)時(shí)間不利地影響來(lái)自動(dòng)員的外周血的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的官能植入能力。將培養(yǎng)時(shí)間降低至24小時(shí)可以減輕培養(yǎng)的不利影響，改善藥用基因療法產(chǎn)品的品質(zhì)。使用dmPGE2能夠在24小時(shí)離體操作短方案中有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)HSC(圖5)，由此形成強(qiáng)有力的理由在未來(lái)的基因療法研究中實(shí)施該方案。這些數(shù)據(jù)還牽涉CD34細(xì)胞數(shù)量(用于定量進(jìn)行干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)量度)具有降低的信息價(jià)值，因?yàn)閬?lái)自延長(zhǎng)的體外培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞在功能上不等效于新鮮CD34+細(xì)胞或短期培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞。事實(shí)上，即使我們注射較少的來(lái)自24小時(shí)培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞，與44小時(shí)培養(yǎng)相比，前面的方案提供更高水平的長(zhǎng)期植入。
[0305]實(shí)施例8優(yōu)選的轉(zhuǎn)導(dǎo)方案以獲得向來(lái)自動(dòng)員的外周血(用G-CSF和/或Pleri xaphor或新的在研動(dòng)員劑來(lái)動(dòng)員)或骨髓的⑶34+CD3K HSPC中的有效的基因轉(zhuǎn)移討論的方案顯示在圖10中。
[0306]參比方案:2Hit Standard-66小時(shí):用標(biāo)準(zhǔn)2 hit方案(66小時(shí))轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38— 細(xì)胞，這是對(duì)CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)行基準(zhǔn)方案(Biffi，A等人(2013) Science 341: 1233158;Scaramuzza, S?等人(2013) Mol.Ther.21: 175-84)。[〇3〇7]我們測(cè)試的lHit-44小時(shí)方案(參見(jiàn)圖7和9)顯示是次優(yōu)的，不會(huì)進(jìn)一步推行。[〇3〇8]下面的方案期望勝過(guò)參考方案并且是用于⑶34+CD3K細(xì)胞的基因修飾的更佳方案:方案A:在無(wú)IL-3的介質(zhì)中用“single hit”方案(38小時(shí))轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶34+⑶381田胞；方案B:在無(wú)IL-3的介質(zhì)中用“single hit”方案(38小時(shí))轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38—細(xì)胞，在LV 暴露前在120分鐘時(shí)進(jìn)行dmPGE2暴露；方案C:在無(wú)IL-3的介質(zhì)中用縮短的“single hit”方案(24小時(shí))轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38一細(xì)胞；方案D:在無(wú)IL-3的介質(zhì)中用縮短的“single hit”方案(24小時(shí))轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+CD38一細(xì)胞，在LV暴露前在120分鐘時(shí)進(jìn)行dmPGE2暴露。
[0309]將按照設(shè)想的技術(shù)選項(xiàng)之一(例如基于微芯片的分選或基于珠的順序選擇)從動(dòng)員的外周血或骨髓中純化CD34+CD381田胞，并以大約106細(xì)胞/毫升的密度在培養(yǎng)/轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)中鋪板。臨床級(jí)LV( 107至108 TU/毫升，根據(jù)應(yīng)用)在方案中安排的時(shí)間點(diǎn)處加入。在方案B和 D中，如方案中所安排的那樣，在LV暴露前120分鐘向培養(yǎng)物中加入dmPGE2。在培養(yǎng)的預(yù)見(jiàn)結(jié)束時(shí)(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)，細(xì)胞將被洗滌并冷凍保存或預(yù)備直接施用于患者(藥物產(chǎn)品)。[〇31〇] MPB⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的環(huán)境條件培養(yǎng)器培養(yǎng)將保持在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5% C02)培養(yǎng)皿涂有纖維連接蛋白的板或袋預(yù)刺激/轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)參比方案:補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素和SCF(300納克/毫升)、FLT3L(300納克/毫升)、TPO (100納克/毫升)、IL3(60納克/毫升)的CellGro(CellGenix)介質(zhì)，在使用前無(wú)菌過(guò)濾(0.22 微米)。
[0311] 方案A、B、C、D:補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素和SCF(300納克/毫升)、FLT3L(300納克/毫升)、TP0(100納克/毫升)的CellGro(CellGenix)介質(zhì)(或適于培養(yǎng)造血干細(xì)胞的其它臨床級(jí)介質(zhì))，在使用前無(wú)菌過(guò)濾(0.22微米)。如方案中安排的那樣，向一些組中加入dmPGE2( 10 yM)〇[〇312]優(yōu)選地，在適當(dāng)?shù)幕颊哳A(yù)處理后，將該藥物產(chǎn)品骨內(nèi)(intraosseously)輸注。任選地，適當(dāng)劑量的支持細(xì)胞(合適劑量的定義:在非骨髓脫離調(diào)理的情況下為零;在骨髓脫離調(diào)理的情況下:相對(duì)于⑶38—制劑中含有的⑶34+細(xì)胞數(shù)量，5 X-10 X來(lái)自⑶38+制劑的⑶34+ 細(xì)胞數(shù)量，最小絕對(duì)數(shù)量為每千克患者體重2.5-3百萬(wàn))可以靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選在輸注藥物產(chǎn)品后1-2天?；蛘?，該藥物產(chǎn)品可以靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選與支持細(xì)胞共同施用。
[0313]上面的說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物經(jīng)此引用并入本文。所描述的本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，而不脫離本發(fā)明的精神與范圍。盡管已經(jīng)結(jié)合特定優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)鼐窒抻诖祟愄囟▽?shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種改變意欲在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.由包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群制備用于臨床應(yīng)用的治療性細(xì)胞群的方法，所述方法包括從起始細(xì)胞群中分離基本不表達(dá)CD38但表達(dá)CD34的細(xì)胞群，并用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述分離的細(xì)胞群以獲得該治療性細(xì)胞群。2.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括以下步驟: a.從包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群中分離表達(dá)CD38的細(xì)胞； b.從不表達(dá)⑶38的步驟(a)中獲得的細(xì)胞群中分離表達(dá)⑶34的細(xì)胞； c.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟(b)中獲得的表達(dá)CD34的細(xì)胞群以獲得治療性細(xì)胞群。3.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括以下步驟: a.使包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群與CD38反應(yīng)性試劑接觸； b.將CD38反應(yīng)性細(xì)胞與CD38非反應(yīng)性細(xì)胞分離； c.使步驟(b)中獲得的CD38非反應(yīng)性細(xì)胞與CD34反應(yīng)性試劑接觸； d.將CD34反應(yīng)性細(xì)胞與CD34非反應(yīng)性細(xì)胞分離，其中所述CD34反應(yīng)性細(xì)胞構(gòu)成所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群； e.用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群以獲得所述治療性細(xì)胞群。4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性細(xì)胞群具有CD34+CD38—表型。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中包含造血干細(xì)胞的起始細(xì)胞群獲自動(dòng)員的外周血、骨髓或臍帶血。6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的方法，其中⑶38或⑶34反應(yīng)性試劑分別是抗⑶38或抗⑶34抗體。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗CD38和/或抗CD34抗體結(jié)合到磁珠或可檢測(cè)標(biāo)記物上。8.權(quán)利要求2或4-7中任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)CD38的細(xì)胞和/或表達(dá)CD34的細(xì)胞使用基于磁珠的分離或流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分離。9.權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的方法，其中CD38反應(yīng)性細(xì)胞和/或CD34反應(yīng)性細(xì)胞使用基于磁珠的分離或流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分離。10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述載體是病毒載體。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒載體包含相關(guān)核苷酸。13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群的步驟包括培養(yǎng)所述細(xì)胞小于大約44小時(shí)。14.權(quán)利要求2、4-8或10-13中任一項(xiàng)的方法，其中保留所述分離的表達(dá)⑶38的細(xì)胞或其一部分以構(gòu)成支持細(xì)胞群。15.權(quán)利要求3-7或9-13中任一項(xiàng)的方法，其中保留所述分離的CD38反應(yīng)性細(xì)胞或其一部分以構(gòu)成支持細(xì)胞群。16.權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)的方法，其中所述支持細(xì)胞群具有⑶34+CD38intl、⑶34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型。17.按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法制備的治療性細(xì)胞群。18.按照權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的方法制備的支持細(xì)胞群。19.包含權(quán)利要求17的治療性細(xì)胞群的藥物組合物。20.包含權(quán)利要求18的支持細(xì)胞群的藥物組合物。21.用于藥物的權(quán)利要求17的治療性細(xì)胞群。22.用于藥物的權(quán)利要求17的治療性細(xì)胞群，其中所述治療性細(xì)胞群與權(quán)利要求18的所述支持細(xì)胞群組合施用。23.用于藥物的權(quán)利要求18的支持細(xì)胞群，其中所述支持細(xì)胞群與權(quán)利要求17的所述治療性細(xì)胞群結(jié)合施用。24.用于如權(quán)利要求21或22所述的用途的治療性細(xì)胞群，其中作為自體干細(xì)胞移植程序或同種異體干細(xì)胞移植程序的一部分施用所述治療性細(xì)胞群。25.用于如權(quán)利要求23所述的用途的支持細(xì)胞群，其中作為自體干細(xì)胞移植程序或同種異體干細(xì)胞移植程序的一部分施用所述支持細(xì)胞群。26.用于如權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)所述的用途的治療性或支持細(xì)胞群，其中所述治療性細(xì)胞群在施用所述支持細(xì)胞群之前施用于受試者。27.用于如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的用途的治療性或支持細(xì)胞群，其中所述治療性細(xì)胞群與所述支持細(xì)胞群的施用同時(shí)期或同時(shí)地施用于受試者。28.包含權(quán)利要求17和18的治療性和支持細(xì)胞群的試劑盒。29.治療方法，包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求17的治療性細(xì)胞群。30.治療方法，包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求17的治療性細(xì)胞群和權(quán)利要求18的支持細(xì)胞群。31.權(quán)利要求30的方法，其中在施用所述支持細(xì)胞群之前向所述受試者施用所述治療性細(xì)胞群。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述治療性細(xì)胞群與所述支持細(xì)胞群的施用同時(shí)期或同時(shí)地施用于受試者。33.用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。34.用于基因療法的造血祖細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已經(jīng)從包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群中分離并隨后用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。35.用于如權(quán)利要求33或34的用途的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38int 表型。36.用于如權(quán)利要求33或34的用途的造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2 和/或 CD34+CD38+表型。37.用于如權(quán)利要求33-36中任一項(xiàng)所述的用途的造血祖細(xì)胞群，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的祖細(xì)胞群與造血干細(xì)胞群組合施用。38.基因療法，包括向需要其的受試者施用造血祖細(xì)胞群，其中該造血祖細(xì)胞群已經(jīng)用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。39.基因療法，包括向需要其的受試者施用造血祖細(xì)胞群，其中在施用于所述受試者之前，所述細(xì)胞已經(jīng)從包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群中分離并隨后用相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。40.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述造血祖細(xì)胞群具有⑶34+⑶38int表型。41.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述造血祖細(xì)胞群具有CD34+CD38intl、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型。42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的祖細(xì)胞群與造血干細(xì)胞群組合施 用。43.在患者體內(nèi)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間的方法，其中通過(guò)根據(jù)CD38表達(dá)水平選擇性施用轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞來(lái)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。44.權(quán)利要求43的方法，其中通過(guò)施用具有降低的CD38表達(dá)水平的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)提高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間。45.前列腺素E2或前列腺素E2衍生物用于當(dāng)用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞時(shí)提高基因轉(zhuǎn)移效率的用途。46.權(quán)利要求45的用途，其中所述前列腺素E2衍生物是16，16-二甲基前列腺素E2。47.權(quán)利要求45或46的用途，其中作為權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法的一部分進(jìn)行造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK106062201SQ201480070868
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2014年10月24日
【發(fā)明人】L.納爾迪尼, B.R.根特納, E.佐納里, F.博卡拉特
【申請(qǐng)人】圣拉法埃萊醫(yī)院有限公司, 泰萊托恩基金會(huì)