本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis,hps)是一種存在于常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道中的一種常在菌，但是在特定條件下，例如在豬場的豬群免疫力下降時候，副豬嗜血桿菌可以侵入健康的豬群機(jī)體，并引發(fā)嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主。主要臨診癥狀為發(fā)熱，咳嗽，呼吸困難，共濟(jì)失調(diào)等。除此之外，副豬嗜血桿菌還能引發(fā)敗血癥，并留下后遺癥。

副豬嗜血桿菌具有多種血清型，按照krg瓊脂擴(kuò)散的血清型分類辦法，至少可以將該菌分為15個不同的血清型。副豬嗜血桿菌病呈世界分布，是一種對養(yǎng)豬業(yè)具有嚴(yán)重危害的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，往往給發(fā)病豬場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前副豬嗜血桿菌病在我國的大部分地區(qū)的豬場都存在發(fā)生和流行的現(xiàn)象，該病是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的最為重要的病原菌之一，因此副豬嗜血桿菌的防治對于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重大的意義。目前，亟需一種新的具有較好免疫原性的菌株制備的疫苗對該病進(jìn)行防治。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一株副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用，該菌株毒力強(qiáng)，制備的疫苗免疫性好。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一株副豬嗜血桿菌，所述的副豬嗜血桿菌為副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis)hnhps1，保藏編號：cgmccno：13335，保藏日期：2016年11月22日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

所述的副豬嗜血桿菌為副豬嗜血桿菌4型。

一種副豬嗜血桿菌在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗方面的應(yīng)用。

所述的副豬嗜血桿菌滅活疫苗中，副豬嗜血桿菌菌量為1×10⁹cfu/ml。

所述的副豬嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法為：將所述的副豬嗜血桿菌依次經(jīng)過培養(yǎng)、收獲和滅活得到疫苗原液后，加入佐劑即得疫苗。

所述的佐劑為氫氧化鋁佐劑。

所述的副豬嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法為：將副豬嗜血桿菌接種到tsb液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床中培養(yǎng)，24h后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h；滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得副豬嗜血桿菌滅活疫苗。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明中的菌株hnhps1分離自發(fā)生典型呼吸道癥狀及神經(jīng)癥狀死亡的保育豬的腦組織，在tsa固體培養(yǎng)基上分離時無其它細(xì)菌生長，只有副豬嗜血桿菌生長，在tsb液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，達(dá)10⁹cfu/ml以上。

2、本發(fā)明中的菌株hnhps1對保育豬具有較強(qiáng)的致病力，引起保育豬發(fā)病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根據(jù)本發(fā)明中的菌株hnhps1制備的疫苗對豬的副豬嗜血桿菌病具有較好的保護(hù)效果。

附圖說明

圖1為菌株hnhps1菌落形態(tài)。

圖2為菌株hnhps1菌體革蘭氏染色100×顯微鏡下形態(tài)。

圖3為菌株hnhps1的pcr鑒定結(jié)果，圖中的marker為dl2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1為引物hps1，hps2對4型副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的擴(kuò)增結(jié)果；2為引物hps1，hps2對菌株hnhps1的擴(kuò)增結(jié)果；4為引物hps3，hps4對4型副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，5為引物hps3，hps4對菌株hnhps1的擴(kuò)增結(jié)果；3，6為陰性對照。從圖中可以看出，1，2為副豬嗜血桿菌通用引物擴(kuò)增，片段為276bp，4，5為副豬嗜血桿菌4型引物擴(kuò)增片段，大小為349bp，證明擴(kuò)增片段為目的片段，符合預(yù)期設(shè)計大小。

圖4為菌株hnhps1的瓊擴(kuò)分型試驗結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實施例1、副豬嗜血桿菌的分離和鑒定

1.1病料采集

病料來自于2016年11月在河南省汝陽縣某大型養(yǎng)豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難及神經(jīng)癥狀死亡的2月齡保育豬。

1.2培養(yǎng)基的制備

tsb液體培養(yǎng)基：將tsb肉湯粉(trypticsoybroth，胰蛋白胨大豆肉湯)30g，溶于1000ml超純水中，115℃滅菌15min，加胎牛血清50ml、無菌1％nad(nicotinamideadeninedinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶ⅰ)1ml；

tsa固體培養(yǎng)基：將tsa瓊脂粉(trypticsoyagar，胰蛋白胨大豆瓊脂)40g，溶于1000ml超純水中，115℃滅菌15min，加胎牛血清50ml、無菌1％nad(根據(jù)需要添加)1ml；于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌采集病死豬的腦組織接種于含有nad的tsa固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，長出一致的針尖狀大小、無色透明、光滑、濕潤的，直徑大小為1～2毫米的菌落(見圖1)。純化并接種于不含nad的tsa固體培養(yǎng)基上，在不含nad的tsa培養(yǎng)基上不能生長。革蘭氏染色(見圖2)，該菌為革蘭氏陰性菌，具有多種不同的形態(tài)，從單個的球桿菌到細(xì)長致絲狀的菌體，命名為菌株hnhps1。

1.4菌株的鑒定

1.4.1設(shè)計引物

根據(jù)副豬嗜血桿菌vany基因的序列設(shè)計一對通用引物，用于副豬嗜血桿菌的擴(kuò)增，引物序列如下：

hps1：5’-acaacctgcaagtacttatcgggat-3’(seqidno.1)

hps2：5’-tagcctcctgtctgatattcccacg-3’(seqidno.2)

擴(kuò)增片段大小為276bp。

同時根據(jù)副豬嗜血桿菌wcip的序列設(shè)計一對副豬嗜血桿菌4型的特異性引物，用于副豬嗜血桿菌4型的擴(kuò)增，引物序列如下：

hps3：5’-ggttaagaggtagagctaagaatagagg-3’(seqidno.3)

hps4：5’-ctttccacaacagctctagaaacc-3’(seqidno.4)

擴(kuò)增片段大小為349bp。

1.4.2pcr鑒定

按照dna提取試劑盒的操作步驟提取出菌株hnhps1的dna，分光光度計測定濃度為100μg/ml，進(jìn)行pcr鑒定。同時，設(shè)置4型副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照，設(shè)置豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)株為陰性對照。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl：10×緩沖液2.5μl，2.5mm(each)dntpsmix0.5μl，10μm/l通用引物hps1，hps2各1μl，5u/μlrtaq1μl，100μg/mldna模板1μl，加入ddh2o至25μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，pcr產(chǎn)物4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，每孔加樣10μl，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果(見圖3)。結(jié)果擴(kuò)增出276bp片段，測序與副豬嗜血桿菌sh0165株(genbankno:cp001321)、zj0906株(genbankno:cp005384)、kl0318株(genbankno:cp009237)100％同源，與sc1401株(genbankno:cp015099)99.6％同源，測序結(jié)果如下，證明菌株hnhps1為副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis)。

acaacctgcaagtacttatcgggattttgaacgacaaaaatggatttggaatacaaaattcaatggtgaaaataaagttcatgatgatcatggtaaagctatcatattaactggcttagatgattgggacaaatgtcaagctatcctgcgttggtccgcagtgccaggggctagccgtcaccattggggaacagaaattgatatttttgatcctactttacttcctgaaggaaaaaagctcatgttggaaccgtgggaatatcagacaggaggcta(seqidno.5)

1.4.3血清型鑒定

1.4.3.1瓊擴(kuò)分型試驗

將分離出的菌株hnhps1接種在tsa固體培養(yǎng)基之上，37℃培養(yǎng)36h，在無菌操作臺中用ph7.2pbs緩沖液洗下菌苔，室溫條件下7000r/min離心2min之后棄去上清，估計出沉淀的體積大小之后，加入相當(dāng)于沉淀物體積9倍的ph7.2pbs緩沖液并充分混勻，121℃高壓蒸汽處理2h，再7000r/min離心10min，所得的上清液即為分型抗原，用于后續(xù)的瓊脂擴(kuò)散試驗。

稱取1g瓊脂糖和8.5g氯化鈉，溶于100mlph7.2pbs緩沖液中并充分混勻，放入微波爐中加熱溶解。倒平板3～4mm厚，4℃保存。利用打孔器在平板上打出6個孔徑為3mm，孔間距4mm的小孔并封底。

在中央孔加入已經(jīng)制備好的待檢菌株的瓊擴(kuò)抗原，周圍孔加入1～15型的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，濕盒中，37℃靜置24～48h觀察結(jié)果。結(jié)果在4型標(biāo)準(zhǔn)血清(編號20)與抗原孔之間出現(xiàn)明顯的沉淀線，與其它型血清之間無(見圖4)。

1.4.3.2pcr分型

參照1.4.2方法，用副豬嗜血桿菌4型的特異性引物hps3，hps4擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出349bp大小片段(見圖3)，測序與4型副豬嗜血桿菌sw124株(genbankno:kc795356)100％同源，證明菌株hnhps1為4型副豬嗜血桿菌。

1.5毒力試驗

試驗動物為9～10周齡斷奶健康的保育豬8頭。試驗動物分為兩組，對照組4頭，試驗組4頭。將hnhps1接種tsb液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)24h后，測定菌體濃度，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，低倍鏡下活菌計數(shù)，計算原液菌體濃度，為3.2×10⁹cfu/ml，再調(diào)整至10⁸cfu/ml，試驗組動物通過氣管內(nèi)接種3ml副豬嗜血桿菌液體培養(yǎng)物，對照組動物通過氣管內(nèi)接種3ml滅菌的tsb液體培養(yǎng)基。注射后連續(xù)觀察2周，觀察并記錄其發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)等情況。

試驗組動物在接種副豬嗜血桿菌24h后表現(xiàn)出咳嗽、呼吸困難等癥狀，體溫升高，耳部、腹部及臀部發(fā)紺，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈。2天后死亡1頭，3天后死亡2頭。對照組動物在試驗期間體溫正常且無明顯的呼吸道癥狀。試驗結(jié)束后剖殺試驗組動物，同時剖殺4頭對照組動物。采集病料，進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離。試驗組剖檢肺有大量纖素樣滲出，與胸膜粘連，心包積液，絨毛心，腦部出血。對照組剖檢均未發(fā)生明顯的病理變化，對照組的4份病料均未分離到副豬嗜血桿菌，試驗組的4份病料中均分離到副豬嗜血桿菌，pcr鑒定結(jié)果與hnhps1一致。

實施例2、疫苗的制備、安全性和效力試驗

2.1疫苗的制備

將副豬嗜血桿菌菌株hnhps1接種到tsb液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床中培養(yǎng)，24h后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至終濃度為0.2％，于37℃滅活12h。滅活后的培養(yǎng)物按體積比1:1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得副豬嗜血桿菌滅活疫苗。

2.2疫苗的安全性試驗：

選取14日齡健康保育豬10頭，分為2組，每組5頭。疫苗組：頸部肌肉注射4ml本疫苗；對照組：頸部肌肉注射4ml滅菌生理鹽水。測定動物體溫，觀察臨床表現(xiàn)，共觀察2周。觀察期間，疫苗組和對照組的保育豬在整個觀察期間呼吸、食欲、精神狀態(tài)都正常，平均體溫升高不超過1℃，說明本發(fā)明的滅活疫苗安全。

表1疫苗接種仔豬后的平均體溫變化

2.3疫苗的效力試驗

選取2周齡健康仔豬30頭，分為6組，每組5頭。具體為：疫苗1-4組：每組分別注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5組為未免疫組，第6組為健康對照組，注射2ml滅菌生理鹽水。疫苗組和健康對照組3周后二免注射同等劑量的疫苗或滅菌生理鹽水。二免后14天各組用10⁹cfu的hnhps1菌液采取滴鼻攻毒。觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，并每日測定體溫，共觀察2周。

計算整個觀察周期實驗仔豬的發(fā)病率和死亡率，測定體溫，對死亡豬肺臟等器官進(jìn)行傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離培養(yǎng)。

觀察結(jié)果：疫苗組與未免疫組有明顯的差異，攻毒后第二天，未免疫組的仔豬開始出現(xiàn)臨床癥狀，體溫升高，呼吸困難，轉(zhuǎn)圈，第三天開始出現(xiàn)死亡，2周后共死亡5頭。剖檢未免疫組死亡豬胸腔和腹腔有積液，并有纖維素性滲出物，心包積液，心包腔內(nèi)有纖維素性滲出物，心包粘連。肺臟腫大，兩側(cè)肺葉淤血或出血，表面纖維素性滲出物。腦膜充血，腦脊液增加。健康對照組的仔豬均未發(fā)病。而疫苗組中，0.5ml疫苗組的5頭仔豬中有2頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1ml疫苗組的5頭仔豬中有1頭出現(xiàn)臨床癥狀和病例變化；1.5ml和2ml疫苗組的5頭仔豬沒有發(fā)病。

表1免疫攻毒保護(hù)情況

注：“—”表示不適用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保護(hù)劑量為0.5ml含菌量為1×10⁹cfu/ml。說明本發(fā)明的滅活苗具有良好的保護(hù)效果。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實施例，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一株副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用

<160>5

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<213>副豬嗜血桿菌（haemophilusparasuis）

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caatggtgaaaataaagttcatgatgatcatggtaaagctatcatattaactggcttaga120

tgattgggacaaatgtcaagctatcctgcgttggtccgcagtgccaggggctagccgtca180

ccattggggaacagaaattgatatttttgatcctactttacttcctgaaggaaaaaagct240

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