本發(fā)明涉及一種提高副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)的促生長劑。
背景技術(shù)：
：副豬嗜血桿菌病是近年來嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的新發(fā)細菌性傳染病，引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜腦炎等，發(fā)病率一般為10-15％，死亡率可達50％以上，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，引起了人們的日益重視。因副豬嗜血桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，所以控制該病的有效方式是疫苗接種。文獻報道商業(yè)疫苗或自家苗的使用可以控制副豬嗜血桿菌的感染。但是也有使用滅活菌苗預(yù)防失敗的實例。滅活疫苗要想達到理想的免疫效果，抗原濃度是非常重要的，副豬嗜血桿菌較難培養(yǎng)，一般很難達到制備疫苗的要求，因此疫苗廠家一般都通過離心濃縮來解決這一問題，但這無形當中增加了生產(chǎn)成本以及工序，給疫苗廠帶來了諸多不便，因此提高副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)濃度是解決這一問題的關(guān)鍵，同時也可為疫苗廠節(jié)約大量的生產(chǎn)成本、降低疫苗的價格。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于一種提高副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)的促生長劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：葉酸和/或土豆汁作為副豬嗜血桿菌促生長劑的應(yīng)用。葉酸和/或土豆汁在副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基中的應(yīng)用。進一步的，上述應(yīng)用的方法為將副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基中加入葉酸和/或土豆汁，使葉酸、土豆汁的濃度分別為1～10mg/ml、4％～8％v/v。進一步的，上述土豆汁的制備方法為將干凈的新鮮土豆搗碎榨汁，加入0.5～2倍體積的無菌水浸泡8～14h，離心取上清，高壓滅菌。一種副豬嗜血桿菌的促生長劑，該促生長劑中含有葉酸和土豆汁。進一步的，上述促生長劑由葉酸、kcl、nah2po4、nacl、酵母提取物、nad、山梨醇、土豆汁和水組成。進一步的，上述促生長劑配方為：葉酸0.1～10mg/mlkcl1.5～7.5mg/mlnah2po42～8mg/mlnacl1～6mg/ml酵母提取物1～10mg/mlnad10～30μg/ml山梨醇30～75mg/ml土豆汁1％～10％v/v，余量為水。上述任一項所述的一種副豬嗜血桿菌的促生長劑，所述土豆汁的制備方法為將干凈的新鮮土豆搗碎榨汁，加入0.5～2倍體積的無菌水浸泡8～14h，離心取上清，高壓滅菌。上述任一項所述的促生長劑在副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基中的應(yīng)用。一種副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有0.5～10％v/v上述任一項所述的促生長劑。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的促生長劑能夠顯著提高副豬嗜血桿菌本身生長的濃度，無需濃縮菌液便能生產(chǎn)出理想免疫效果的副豬嗜血桿菌滅活疫苗，免疫效價高，免疫效果好這為疫苗廠節(jié)約大量的生產(chǎn)成本、可降低疫苗的價格，具有廣泛的應(yīng)用價值。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1土豆汁對副豬嗜血桿菌的促生長作用在現(xiàn)常常規(guī)培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基中分別添加5％v/v的胡蘿卜汁、番茄汁和土豆汁，將添加不同蔬果汁的培養(yǎng)基分別接入1％v/v副豬嗜血桿菌種子液，在常規(guī)的條件下進行培養(yǎng)，37℃，120rpm振蕩培養(yǎng)24小時，進行活菌計數(shù)。同時設(shè)置不加任何促生長劑的原培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均相同。上述現(xiàn)有常規(guī)的培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基為含nad和胎牛血清的tsb培養(yǎng)基，具體制備方法為：將購買的tsb(tryptonesoybroth)培養(yǎng)基按照說明書加入水中溶解，于121℃高壓滅菌15分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，無菌條件下每升加入100ml胎牛血清，加入nad(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide)使其終濃度為25μg/ml的，4℃保存，即可。上述土豆汁的制備方法為：將洗干凈的新鮮土豆用組織搗碎機搗碎榨汁后，加入1倍體積的無菌雙蒸水浸泡12小時，離心機中8000rpm離心15分鐘后，取上清于121℃高壓滅菌15分鐘，4℃保存?zhèn)溆?。上述胡蘿卜汁、番茄汁的制備方法與土豆汁的制備方法相同。檢測結(jié)果如表1所示，從中可以看出不同蔬果汁作為促生長劑時，對副豬嗜血桿菌促生長效果不同，其中玉米汁對副豬嗜血桿菌幾乎沒有促進效果，該組副豬嗜血桿菌活菌數(shù)與不添加促生長劑的菌數(shù)差不多，其中胡蘿卜汁和番茄汁對副豬嗜血桿菌具有一定的促生長作用，但并不顯著，只有將土豆汁作為促生長劑時才具有顯著的促副豬嗜血桿菌生長的效果，活菌數(shù)可達3.34*109cfu/ml，顯著高于不添加促生長劑的1.02*109cfu/ml，可使菌液的濃度提高3倍以上。在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)往培養(yǎng)基中加入4％～8％v/v的土豆汁，均可使菌液的濃度提高3倍以上。表1不同促生長劑對副豬嗜血桿菌生長密度的影響實施例2葉酸對副豬嗜血桿菌的促生長作用在現(xiàn)常常規(guī)培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基(同實施例1)中分別添加葉酸、草酸、蘋果酸，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為1.5mg/ml，將這3種培養(yǎng)基中分別接入1％v/v副豬嗜血桿菌種子液，在常規(guī)的條件下進行培養(yǎng)，37℃，120轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24小時，進行活菌計數(shù)。同時設(shè)置不加任何促生長劑的原培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均相同。檢測結(jié)果如表2所示，從中可以看出葉酸、草酸、蘋果酸分別作為促生長劑時，對副豬嗜血桿菌促生長效果不同，其中草酸、蘋果酸對副豬嗜血桿菌促生長和繁殖的效果較弱，副豬嗜血桿菌活菌數(shù)相比不添加促生長劑的菌數(shù)只是小幅度增加，但將葉酸作為促生長劑時具有顯著的促副豬嗜血桿菌生長的效果，活菌數(shù)可達2.92*109cfu/ml，顯著高于不添加促生長劑的1.02*109cfu/ml，可使菌液的濃度提高約3倍。在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)常規(guī)培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基中含1～10mg/ml的葉酸，均可使菌液的濃度提高約3倍以上。表2不同成分對副豬嗜血桿菌生長密度的影響實施例3一種提高副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)的促生長劑副豬嗜血桿菌促生長劑按下述配方進行配制，其中酵母提取物需進行121℃高壓處理，其他成分需進行過濾處理，證促生長劑無菌。促生長劑配制好后4℃保存?zhèn)溆?。副豬嗜血桿菌促生長劑配方：葉酸5g/mlkcl3mg/mlnah2po44mg/mlnacl3mg/ml酵母提取物5mg/mlnad21μg/ml山梨醇55mg/ml土豆汁4％v/v，余量為水。實施例4一種提高副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)的促生長劑副豬嗜血桿菌促生長劑按下述配方進行配制，其中酵母提取物需進行121℃高壓處理，其他成分需進行過濾處理，證促生長劑無菌。促生長劑配制好后4℃保存?zhèn)溆?。副豬嗜血桿菌促生長劑配方：葉酸0.1g/mlkcl7.5mg/mlnah2po42mg/mlnacl1mg/ml酵母提取物10mg/mlnad10μg/ml山梨醇75mg/ml土豆汁10％v/v，余量為水。實施例5一種提高副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)的促生長劑副豬嗜血桿菌促生長劑按下述配方進行配制，其中酵母提取物需進行121℃高壓處理，其他成分需進行過濾處理，證促生長劑無菌。促生長劑配制好后4℃保存?zhèn)溆?。副豬嗜血桿菌促生長劑配方：葉酸10g/mlkcl1.5mg/mlnah2po48mg/mlnacl6mg/ml酵母提取物1mg/mlnad30μg/ml山梨醇30mg/ml土豆汁1％％v/v，余量為水。實施例6本發(fā)明副豬嗜血桿菌促生長劑的應(yīng)用在現(xiàn)常常規(guī)培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基(同實施例1)中添加實施例3～5任一所述的促生長劑，使促生長劑在培養(yǎng)基中的含量為0.5％～10％(體積百分比)，然后按1/100的體積比接種活化好的副豬嗜血桿菌菌種，37℃，120rpm振蕩培養(yǎng)24小時后，取菌液進行活菌計數(shù)。檢測結(jié)果如表3所示，從中可以看出加含有本發(fā)明促生長劑的培養(yǎng)基，可顯著提高副豬嗜血桿菌活菌數(shù)，提高副豬嗜血桿菌的濃度，尤其是在培養(yǎng)基中含有5％(v/v)的促生長劑時，副豬嗜血桿菌的生長密度最高，可達7.24╳109cfu/ml，將近是不添加促生長劑時生長密度的7倍(表3)。這為實際生產(chǎn)提高副豬嗜血桿菌大大節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。表3不同濃度促生長劑對副豬嗜血桿菌生長密度的影響實施例7疫苗免疫效果試驗按現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)制備副豬嗜血桿菌疫苗，具體操作方法如下：1)一級種子液制備：取保存的副豬嗜血桿菌接種于tsa固體平板，在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)18h；然后挑取單菌落于tsb培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的條件下，以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)18h，進行純粹檢驗合格后，作為一級種子液，置2～8℃保存?zhèn)溆?，保存時間均不超過3天；2)二級種子液制備：取步驟1)得到的一級種子液，按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:20接種于tsb培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的條件下，以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)16h，進行純粹檢驗合格后，作為二級種子液，置2～8℃保存?zhèn)溆?，保存時間均不超過3天；3)原菌液制備：取步驟2)得到的二級種子培養(yǎng)液，按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:100分別接種于培養(yǎng)基a、b和c中(培養(yǎng)基成分如表4)，在溫度為37℃的條件下，以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)24h后，得到原菌液a、b、c；表4培養(yǎng)基成分表組別培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基atsb培養(yǎng)基b含2％v/v本發(fā)明促生長劑的tsb培養(yǎng)基c含5％v/v本發(fā)明促生長劑的tsb4)滅活：在上述3種菌液中加入終濃度為0.2～0.4％的甲醛溶液，37℃振蕩滅活24h。5)乳化：在步驟4)得到的滅活菌液中取樣，按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進行純粹檢驗；將原菌液在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心10min取沉淀的菌體，用無菌生理鹽水重懸菌體后洗滌，加入原體積的生理鹽水后將制苗菌液與鋁膠佐劑以體積比4：1混合，轉(zhuǎn)速8000rpm的條件下乳化20min，得到副豬嗜血桿菌疫苗a、b、c，2～8℃保存?zhèn)溆谩?)免疫效果評價：將上述制備的疫苗分別各免疫5頭10日齡仔豬，2ml/頭，頸部肌肉注射，14日齡后，進行二免，2ml/頭，頸部肌肉注射，另外設(shè)置1組試驗對照組，免疫生理鹽水，二免20日后進行攻毒，每頭仔豬腹腔注射副豬嗜血桿菌桿菌5╳109cfu，每頭觀察臨床癥狀，連續(xù)觀察10天，記錄仔豬發(fā)病及死亡情況(表5)。表5疫苗免疫效果評價結(jié)果組別免疫疫苗仔豬數(shù)發(fā)病數(shù)死亡數(shù)1疫苗a5202疫苗b5003疫苗c5004生理鹽水552注：疫苗a為用常規(guī)tsb培養(yǎng)基培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌制備的疫苗，疫苗b、c分別為用含2％v/v、5％v/v本發(fā)明促生長劑的tsb培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌制備的疫苗。試驗結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌培養(yǎng)時加入2％或5％促生長劑后，所制備的b和c組疫苗免疫效果明顯優(yōu)于未加促生長劑的a組。滅活疫苗要想達到理想的免疫效果，抗原濃度是非常重要的，目前副豬嗜血桿菌較難培養(yǎng)，通常很難達到制備疫苗的要求，因此疫苗廠家一般都通過離心濃縮來解決這一問題，但這無形當中增加了生產(chǎn)成本以及工序，給疫苗廠帶來了諸多不便，因此提高副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)濃度是解決這一問題的關(guān)鍵，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的促生長劑能夠顯著提高副豬嗜血桿菌本身生長的濃度，有效地解決了這技術(shù)難題，無需濃縮便能生產(chǎn)出理想免疫效果的副豬嗜血桿菌滅活疫苗，免疫效價高，免疫效果更好(見表5)，這為疫苗廠節(jié)約大量的生產(chǎn)成本、可降低疫苗的價格，具有廣泛的應(yīng)用價值。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12