本發(fā)明涉及一種用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物，以實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞的實(shí)質(zhì)上完全殺菌，同時維持在微生物細(xì)胞中表達(dá)的酶活性在高水平；以及由此產(chǎn)生的已殺菌的微生物細(xì)胞。

更具體地說，本發(fā)明涉及一種對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其通過用可以用于食品中的聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞，從而能夠使用已殺菌的微生物細(xì)胞用于食品生產(chǎn)；以及含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)。

背景技術(shù)：

用于制備食品的一些工藝可能需要使用由各種微生物產(chǎn)生的各種酶。也就是說，可以從微生物獲得所預(yù)期的酶，并且用作食品的一種構(gòu)成材料。

因而，在食品生產(chǎn)工藝中采用微生物細(xì)胞時，存在有活的微生物細(xì)胞可能泄漏且并入產(chǎn)品中從而引起二次微生物污染的問題。

為了解決這些問題，所述微生物細(xì)胞的泄漏通常通過在封閉系統(tǒng)中使具有高穩(wěn)定性的微生物反應(yīng)并且固定所用的微生物細(xì)胞來減到最少。然而，近年來，為了大規(guī)模生產(chǎn)特定的酶，已經(jīng)快速地增加基因工程微生物的使用。當(dāng)所述基因工程微生物用于食品生產(chǎn)工藝時，要求微生物細(xì)胞完全殺菌以確保食品安全。

微生物細(xì)胞完全殺菌的方法基本上分為兩種方法，即使用物理手段的方法和使用化學(xué)手段的方法。使用物理手段的方法的實(shí)例可以包含進(jìn)行加熱、紫外線照射、電磁波照射、殺菌過濾等的方法。使用化學(xué)手段的方法的實(shí)例可以包含使用苯酚、乙醇、氧化劑、重金屬離子、殺菌氣體等的方法。

韓國專利第100501864號揭示使用化學(xué)手段對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法的一個實(shí)例。

此公開案揭示一種使用陽離子型或兩性表面活性劑對紅球菌屬(rhodococcus)進(jìn)行殺菌的方法，所述紅球菌屬是一種重組細(xì)菌。此方法提高了使用陽離子型表面活性劑的微生物細(xì)胞殺菌效率。然而，此方法有因?yàn)橛闷S索氯銨(benzethoniumchloride)作陽離子型表面活性劑引起的一個問題。

芐索氯銨具有強(qiáng)殺菌力并且用于治療鼻炎和口腔炎藥物、用作嗽口水等等。然而，近來的研究報導(dǎo)芐索氯銨被認(rèn)為是一種會干擾內(nèi)分泌的代表性環(huán)境激素并且對人體非常有害。

因此，以上方法可能只能用于出于工業(yè)目的對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，在專門應(yīng)用中沒有引入人體的風(fēng)險。在這方面，以上方法并非如本發(fā)明中所提出的可以用于食品生產(chǎn)的對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行徹底的調(diào)查以解決如上所述的問題，并且研發(fā)了一種使用可以用于食品的聚乙二醇類非離子型表面活性劑對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法。

確切地說，本發(fā)明目的在于提供一種用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物，使得所述微生物細(xì)胞實(shí)質(zhì)上完全殺菌，同時維持在微生物細(xì)胞中表達(dá)的酶活性在高水平。

另外，本發(fā)明目的在于提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞，所述含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)能夠用于食品生產(chǎn)。

此外，本發(fā)明目的在于提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理產(chǎn)生半乳糖和/或阿拉伯糖異構(gòu)酶的棒狀桿菌屬(genuscorynebacterium)微生物細(xì)胞，所述含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)能夠用于塔格糖生產(chǎn)。

技術(shù)解決方法

本發(fā)明涉及一種對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞；以及含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其包含用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述聚乙二醇類非離子型表面活性劑包含由醚型、酯型和含氮型聚乙二醇類非離子型表面活性劑所組成的族群中選出的至少一個。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述聚乙二醇類非離子型表面活性劑以基于微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物0.1％到10％的濃度使用。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物的處理在0℃到70℃的溫度下進(jìn)行。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述微生物細(xì)胞是棒狀桿菌屬。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述微生物細(xì)胞是能夠產(chǎn)生半乳糖和/或阿拉伯糖異構(gòu)酶的棒狀桿菌屬。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述方法用于制備塔格糖的工藝中。

本發(fā)明的又一個實(shí)施例提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，所述微生物細(xì)胞通過本發(fā)明的方法殺菌。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，其中所述已殺菌的微生物細(xì)胞用于塔格糖的制備。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，其能夠用于食品生產(chǎn)并且包含：a)聚乙二醇類非離子型表面活性劑；以及b)半乳糖或阿拉伯糖異構(gòu)酶。

有利作用

在根據(jù)本發(fā)明用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法中，微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理，從而實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞實(shí)質(zhì)上完全殺菌，同時允許在微生物細(xì)胞中表達(dá)的酶活性維持在高水平。

另外，根據(jù)本發(fā)明，用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法防止在食品制備中產(chǎn)品由于微生物細(xì)胞泄漏而遭到二次污染并且促進(jìn)隨后工藝中微生物細(xì)胞的處理。

此外，本發(fā)明提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌，所述物質(zhì)能夠用于食品生產(chǎn)。

此外，本發(fā)明提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，通過用聚乙二醇類非離子型表面活性劑對能夠產(chǎn)生半乳糖和/或阿拉伯糖異構(gòu)酶的棒狀桿菌屬微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌，所述物質(zhì)能夠用于食品生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是顯示實(shí)例2中在30℃下對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌后殘余酶活性結(jié)果的圖。

圖2是顯示實(shí)例2中在50℃下對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌后殘余酶活性結(jié)果的圖。

具體實(shí)施方式

最佳模式

在下文中，本發(fā)明的實(shí)施例將參考附圖更詳細(xì)地描述。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的細(xì)節(jié)描述將在本文中省略。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法，其包含用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物。

用于本發(fā)明的微生物細(xì)胞不具體限制，并且包含野生型和基因工程微生物的任何眾所周知的微生物都可以使用。

微生物細(xì)胞優(yōu)選地包含棒狀桿菌屬微生物細(xì)胞，更優(yōu)選地谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032。

谷氨酸棒狀桿菌atcc13032在本領(lǐng)域中已知并且由國際保藏單位atcc(美國馬納薩斯州的美國模式培養(yǎng)物保藏所(americantypeculturecollection，manassas，usa))保藏。

可用于本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌atcc13032能夠產(chǎn)生半乳糖(galactose)和/或阿拉伯糖(arabinose)異構(gòu)酶(isomerase)并且可以進(jìn)行基因重組以產(chǎn)生異構(gòu)酶。

如本文所用，培養(yǎng)物可以指培養(yǎng)微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液，以及含有微生物細(xì)胞在培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中的培養(yǎng)結(jié)果的培養(yǎng)物。

培養(yǎng)物可以包含培養(yǎng)微生物細(xì)胞所需的營養(yǎng)來源，例如碳源、氮源等等，以及天然鹽組分、氨基酸、維生素、核酸和/或培養(yǎng)基(或培養(yǎng)液)中通常含有的其它組分。

此外，培養(yǎng)物可以包含由微生物細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的酶作為培養(yǎng)微生物細(xì)胞的結(jié)果。

如本文所用，術(shù)語“對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌”意指在相對高濃度的微生物細(xì)胞懸浮液中相應(yīng)微生物細(xì)胞的活微生物細(xì)胞數(shù)實(shí)質(zhì)上接近0。表述“實(shí)質(zhì)上接近0”意指微生物細(xì)胞的存活率(殺菌后的活微生物細(xì)胞數(shù)/殺菌前的活微生物細(xì)胞數(shù))是1/10⁵或更小。

活微生物細(xì)胞數(shù)可以通過以下來計算：將微生物細(xì)胞懸浮液稀釋到預(yù)定濃度，在其中微生物細(xì)胞有活力的培養(yǎng)基上散布(spreading)微生物細(xì)胞懸浮液，并且基于稀釋比，測定培養(yǎng)基上活微生物細(xì)胞數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法包含用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物。表述“用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理”意指所有形式的處理，例如通過微生物細(xì)胞與聚乙二醇類非離子型表面活性劑直接接觸，或通過含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物與所添加的聚乙二醇類非離子型表面活性劑接觸。殺菌可以在攪拌表面活性劑的同時進(jìn)行。

在本發(fā)明中，可以使用聚乙二醇類非離子型表面活性劑，但不限于非離子型表面活性劑是聚乙二醇類表面活性劑的范圍。

聚乙二醇類非離子型表面活性劑的實(shí)例可以包含醚型聚乙二醇類非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯等等；酯型聚乙二醇類非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇脂肪酸酯等等；或含氮型聚乙二醇類非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯脂肪酰胺等等，不限于此。這些可以單獨(dú)使用或兩個或超過兩個組合使用。

在本發(fā)明中聚乙二醇類非離子型表面活性劑優(yōu)選為含氮型非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯脂肪酰胺。

在用聚乙二醇類非離子型表面活性劑處理微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物中，表面活性劑的濃度不具體限制。優(yōu)選地，表面活性劑的濃度是基于微生物細(xì)胞或含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物0.1％到10％，更優(yōu)選地0.5％到8％。

當(dāng)所用表面活性劑的濃度小于0.1％時，難以實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞的充分殺菌。當(dāng)所用表面活性劑的濃度超過10％時，表面活性劑的量變得過多，其并不有效，并且有破壞酶活性的可能性。此外，已殺菌的微生物細(xì)胞中表面活性劑的含量增加，使得已殺菌的微生物細(xì)胞變得不適用于多種應(yīng)用，例如食品生產(chǎn)等等。

根據(jù)本發(fā)明用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法可以在任何溫度下進(jìn)行，只要溫度不抑制由微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性即可。優(yōu)選地，用于對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌的方法在0℃到70℃，更優(yōu)選地10℃到60℃的溫度下進(jìn)行。

當(dāng)溫度小于0℃或超過70℃時，由微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶可能被破壞，從而降低酶活性。

根據(jù)本發(fā)明，所述方法可以進(jìn)一步包含添加酶的底物和/或底物類似物，以在不破壞酶活性下維持由相應(yīng)微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性。

在本發(fā)明的另一方面，所述方法可以用于生產(chǎn)塔格糖的工藝中。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，所述微生物細(xì)胞通過根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行殺菌。

含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)可以包含已殺菌的微生物細(xì)胞和在殺菌前由微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶。

含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)可以通過對能夠產(chǎn)生半乳糖和/或阿拉伯糖異構(gòu)酶的棒狀桿菌屬微生物細(xì)胞，優(yōu)選地谷氨酸棒狀桿菌微生物細(xì)胞，更優(yōu)選地谷氨酸棒狀桿菌atcc13032微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌來制備。

含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)可以包含半乳糖和/或阿拉伯糖異構(gòu)酶。

含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)的使用不具體限制，并且含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)可以用于食品生產(chǎn)，優(yōu)選地生產(chǎn)塔格糖的工藝中。

塔格糖是半乳糖的一種異構(gòu)體并且是已知具有類似于果糖的物理和化學(xué)性質(zhì)的天然糖。

塔格糖被fda(食品與藥物管理局(foodanddrugadministration))認(rèn)為是gras(通常認(rèn)為安全的)，并且批準(zhǔn)其用作食品、飲料、健康食品、食物添加劑等的甜味劑。塔格糖沒有副作用并且是幾乎零卡路里的低熱量糖。塔格糖是一種重要的甜味劑，它替代引起例如肥胖癥、糖尿病等各種成人疾病的糖。

塔格糖可以利用生物學(xué)方法，通過使用半乳糖或阿拉伯糖異構(gòu)酶使半乳糖或阿拉伯糖異構(gòu)化來制備。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)，其能夠用于食品生產(chǎn)并且包含：a)聚乙二醇類非離子型表面活性劑；以及b)半乳糖或阿拉伯糖異構(gòu)酶。

如本文所用，術(shù)語“食品生產(chǎn)”可以包含其中含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì)直接或間接用于食品生產(chǎn)的所有情況。

【本發(fā)明的模式】

然后，本發(fā)明將參考實(shí)例和比較實(shí)例更詳細(xì)地描述。然而，應(yīng)了解以下實(shí)例和比較實(shí)例僅為說明而提供并且不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)例1

與聚乙二醇類非離子型表面活性劑的濃度相關(guān)的微生物細(xì)胞的殺菌

將重組谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株用作為非離子型表面活性劑提供的不同濃度的聚乙二醇硬脂酰胺(polyoxyethylenestearylamine；poesa)作為含氮聚乙二醇類表面活性劑(日本協(xié)同有限公司的奈明s-215(naimines-215，nihonyushico.，ltd.)和吐溫80(tween80)(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)處理，以測定谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的殺菌程度和酶活性。用于進(jìn)行所述測量的詳細(xì)方法如下。

(1)谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的培養(yǎng)

含有10微克/毫升濃度的卡那霉素(kanamycin)的mb培養(yǎng)基(10克/升細(xì)菌用胰蛋白胨、5克/升細(xì)菌用酵母提取物、5克/升nacl、5克/升大豆胨)用谷氨酸棒狀桿菌atcc13032接種，使得初始濃度o.d.600是0.1，接著在30℃下培養(yǎng)24小時，以誘導(dǎo)重組半乳糖異構(gòu)酶的表達(dá)。

含有3升含有10微克/毫升濃度的卡那霉素的突變培養(yǎng)基(80克/升葡萄糖、20克/升大豆胨、10克/升(nh4)2so4、1.2克/升kh2po4、1.4克/升mgso4)的5升發(fā)酵缸用所得培養(yǎng)液接種，使得o.d.600是0.6，接著在30℃下培養(yǎng)20小時。

(2)微生物細(xì)胞的殺菌

制備由40ml含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物構(gòu)成的11個樣本。表面活性劑未添加到第一樣本，添加各種濃度(分別基于培養(yǎng)物0.05％、0.1％、0.5％、1％以及5％)的聚乙二醇類非離子型表面活性劑(poesa)到第二樣本到第六樣本，并且添加各種濃度的吐溫80到第七樣本到第十一樣本，接著將微生物細(xì)胞置于30℃下3小時以對微生物細(xì)胞進(jìn)行殺菌。

(3)活微生物細(xì)胞數(shù)的測定

在微生物細(xì)胞殺菌后，11個樣本施加于含有卡那霉素的mb瓊脂培養(yǎng)基，接著在30℃下培養(yǎng)24小時，以測定活微生物細(xì)胞數(shù)。

(4)酶活性的測量

含有已殺菌的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物(含有已殺菌的微生物細(xì)胞的物質(zhì))經(jīng)受8000xg(＝10，000rpm)離心10分鐘，收獲微生物細(xì)胞。無微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物懸浮于含有300克/升半乳糖底物的50mmtris-hcl緩沖溶液(從西格瑪奧德里奇(sigma-aldrich)購買)(ph7.5)中，接著在55℃下從半乳糖異構(gòu)化成塔格糖，歷時2小時。

異構(gòu)化后，測量半乳糖異構(gòu)酶的殘余活性。

殺菌處理后的酶活性通過將反應(yīng)結(jié)束后塔格糖的產(chǎn)生量與異構(gòu)化開始時半乳糖的量比較來測量。

殺菌后，測量活微生物細(xì)胞數(shù)和殘余酶活性。結(jié)果展示于表1中。

表1

實(shí)例2

與溫度變化相關(guān)的使用聚乙二醇類非離子型表面活性劑對微生物細(xì)胞的滅菌

除了每種條件的兩個樣本用變化的類別和濃度的表面活性劑制備以制備22個樣本并且用于殺菌處理的溫度設(shè)置為30℃和50℃，殺菌通過與實(shí)例1中相同的程序進(jìn)行。

殺菌后，測量活微生物細(xì)胞數(shù)和殘余酶活性。結(jié)果展示于表2和表3中。

表2

表3

如表1到表3中所示，可以看出，當(dāng)使用吐溫80時，即使使用5％吐溫80處理，微生物細(xì)胞也未完全殺菌。然而，當(dāng)使用聚乙二醇類非離子型表面活性劑時，從0.5％的濃度，活微生物細(xì)胞數(shù)就開始顯著減少并且在1％的濃度下微生物細(xì)胞完全殺菌。

此外，可以看出，與殺菌用相同濃度的吐溫80進(jìn)行的情況相比較，用聚乙二醇類非離子型表面活性劑殺菌顯示出較高的殘余酶活性。從使用聚乙二醇類非離子型表面活性劑殺菌后酶活性比酶未用所述表面活性劑處理的情況高的結(jié)果，確定表面活性劑可以促進(jìn)酶與底物之間的相互作用。

不同的殺菌溫度下的測量結(jié)果展示當(dāng)微生物細(xì)胞在50℃下處理時殺菌更有效地進(jìn)行。