本發(fā)明屬于醫(yī)學技術領域，尤其涉及一種血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法。

背景技術：

牛黃是脊索動物門哺乳綱?？苿游锱８闻K的膽結石。天然牛黃極其珍貴，國際上價值堪比黃金。目前市場上多以人工體內外培植為主，而影響牛黃質量和產(chǎn)量的最核心因素就是致使牛黃產(chǎn)生的菌株。為了提高牛黃的質量和產(chǎn)量填補市場，人們一直尋找可以高效產(chǎn)牛黃的菌株。

牛黃的形成過程中，菌株在牛的膽囊內生存，會產(chǎn)生一種叫做β——葡萄糖醛酸酶(β-g酶)的關鍵酶，這種含量的高低直接決定了牛黃的產(chǎn)量和牛黃中膽紅素的含量(此為牛黃質量的關鍵指標)。

高效致牛黃菌株滿足的條件為：高效產(chǎn)生β-g酶、低毒性(對牛本身的生長影響小)、在膽囊環(huán)境中穩(wěn)定繁殖生存。

現(xiàn)有技術中，有一種致黃菌：eco-mixture型血清型的大腸桿菌；但其存在很多缺陷。

綜上所述，現(xiàn)有技術存在的問題是：現(xiàn)有的致黃菌株在篩選過程中不注重低毒性篩選、沒有濃度梯度的馴化培養(yǎng)過程，馴化培養(yǎng)的之后沒有針對于高效產(chǎn)生β-g酶進行在篩選培養(yǎng)和純化步驟，以及沒有考慮在變化濃度環(huán)境中的致黃菌的生長穩(wěn)定和性質穩(wěn)定檢測，故現(xiàn)有牛黃致黃菌株不能更高效的產(chǎn)生β-g酶；和在牛黃形成過程中對牛本身的生長影響相對較大；在膽囊環(huán)境的生長周期較短，繁殖活力較弱。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

原料采集：將屠宰后的雞立即結扎膽管；

大腸桿菌篩選：無菌采集各膽內膽汁接種于麥康凱瓊脂平板，同時另取膽內膽汁接種于普通肉湯增菌，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，挑選生長良好的菌落使用甘油保存；

毒素測驗：以保存的大腸桿菌標株o8為陽性對照，用膽囊分離出大腸桿菌分別接種于葡萄糖、蛋白胨肉湯；增菌，培養(yǎng)后作兔腸結扎試驗，判定結果；再進行小鼠的中長期注射毒性檢測，篩選出對小鼠生長影響小的菌種；

膽汁存活篩選：取毒素測驗步驟中分離菌種的肉湯培養(yǎng)物接種于牛膽汁中，培養(yǎng)，取存活菌落使用甘油條件下保存；

高濃度膽汁耐受篩選：用肉湯配制含牛膽汁的無菌培養(yǎng)基；使用膽鹽配成無菌肉湯；取膽汁存活篩選步驟中分離菌的肉湯培養(yǎng)物和接種于膽鹽牛膽汁瓊脂中由低度膽汁到高度逐步培養(yǎng)馴化；重復膽汁存活篩選步驟；

將馴化得到的菌株分別進行牛膽囊動態(tài)生長模擬環(huán)境：取分離菌種的肉湯培養(yǎng)物分別接種于滅菌的牛膽汁中，上調和下調膽汁中的膽紅素濃度；培養(yǎng)；取培養(yǎng)后的菌種涂布于麥糠凱瓊脂平板培養(yǎng)；檢測生長好的菌落對葡萄糖醛酸的利用情況進行再次篩選；

分離提純：重復大腸桿菌篩選、毒素測驗、膽汁存活篩選步驟，得到血清型的大腸桿菌。

進一步，所述大腸桿菌篩選具體包括：無菌采集各膽內膽汁0.01ml分別接種于麥康凱瓊脂平板，同時另取1ml接種于普通肉湯增菌，37℃培養(yǎng)24～h48h：

麥糠凱瓊脂平板上出現(xiàn)直徑約2mm～3mm、圓形、隆起、光滑、濕潤的紅色菌落視為可疑，麥糠凱無菌落生長、肉湯清亮透明者視為無菌，麥糠凱上無紅色的菌落但是肉湯渾濁者再取0.1ml肉湯培養(yǎng)物轉接于麥糠凱平板上37℃培養(yǎng)24h從麥糠凱培養(yǎng)基上挑選標準菌落，接種于普通培養(yǎng)基上，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，挑選生長良好的菌落使用甘油于4℃條件下保存。

進一步，所述毒素測驗具體包括：以保存的大腸桿菌標株o8為陽性對照，用膽囊分離出的26株大腸桿菌分別接種于1％葡萄糖、2％蛋白胨肉湯，于37℃增菌，培養(yǎng)36h后作兔腸結扎試驗，每腸段注射菌液1ml，對照腸段注入普通無菌肉湯，判定結果；

進行小鼠的中長期注射毒性檢測，篩選出對小鼠生長影響較小的菌種。

進一步，所述膽汁存活篩選具體包括：取毒素測驗步驟中分離菌種的肉湯培養(yǎng)物各1鉑耳，分別接種于2ml滅菌的牛膽汁中，37℃培養(yǎng)24h后置于室溫18℃下，后每隔24h取1鉑耳涂布于麥糠凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h；

平板上有多量密集的菌落為存活，少量稀疏菌落為生長不良，無菌落為生長死亡；取存活菌落使用甘油于4℃條件下保存。

進一步，所述高濃度膽汁耐受篩選具體包括：用肉湯配制含經(jīng)高壓滅菌后冰箱內保存的牛膽汁6％、10％、20％、40％、50％和100％的無菌培養(yǎng)基；

使用膽鹽配成膽酸含量為0.25％、0.5％、1.25％、2.5％、6.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％和35.0％的無菌肉湯；

每管總量均為1ml；取膽汁存活篩選步驟中分離菌的肉湯培養(yǎng)物各0.05ml和接種于膽鹽牛膽汁瓊脂中由低度膽汁到高度逐步培養(yǎng)馴化；重復膽汁存活篩選步驟。

進一步，將馴化得到的菌株分別進行牛膽囊動態(tài)生長模擬環(huán)境：取分離菌種的肉湯培養(yǎng)物各1鉑耳，分別接種于2ml滅菌的牛膽汁中，每6個小時上調和下調膽汁中的膽紅素濃度1％，37℃培養(yǎng)24h后置于室溫(大約18℃)下，后每隔24h取1鉑耳培養(yǎng)后的菌種涂布于麥糠凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。平板上有多量密集的菌落為存活，少量稀疏菌落為生長不良，無菌落為生長死亡。檢測生長較好菌落對葡萄糖醛酸的利用情況進行再次篩選。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述的血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的牛黃菌株。

本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：

本發(fā)明解決了現(xiàn)有牛黃不能更高效的產(chǎn)生β-g酶、牛黃形成過程中對牛本身的生長影響相對較大、在膽囊環(huán)境的生長周期較短，繁殖活力較弱的問題。與現(xiàn)有技術相比，穩(wěn)定繁殖時長可提高10％左右。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法流程圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例中的大腸桿菌escherichiacoliwj-zh-01于2016年10月27日由中國典型培養(yǎng)物保藏中心收入保藏，保藏號：m2016596。請求保藏人：四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院徐志文。保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國武漢武漢大學。保藏日期：2016年10月27日，保藏編號：cctccno:m2016596，分類命名：大腸桿菌escherichiacoliwj-zh-01。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的血清型的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

s101：原料采集：將屠宰后的雞立即結扎膽管。

s102：大腸桿菌篩選：無菌采集各膽內膽汁0.01ml分別接種于麥康凱瓊脂平板，同時另取1ml接種于普通肉湯增菌，37℃培養(yǎng)24-48h。麥糠凱瓊脂平板上出現(xiàn)直徑約2-3mm、圓形、隆起、光滑、濕潤的紅色菌落視為可疑，麥糠凱無菌落生長、肉湯清亮透明者視為無菌，麥糠凱上無紅色的菌落但是肉湯渾濁者可以再取0.1ml肉湯培養(yǎng)物轉接于麥糠凱平板上37℃培養(yǎng)24h從麥糠凱培養(yǎng)基上挑選標準菌落，接種于普通培養(yǎng)基上，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，挑選生長良好的菌落使用甘油于4℃條件下保存。

s103：毒素測驗：以保存的大腸桿菌標株o8為陽性對照，用膽囊分離出的26株大腸桿菌分別接種于1％葡萄糖、2％蛋白胨肉湯，于37℃增菌，培養(yǎng)36h后作兔腸結扎試驗，每腸段注射菌液1ml，對照腸段注入普通無菌肉湯，按常規(guī)判定結果。進行小鼠的中長期注射毒性檢測，篩選出對小鼠生長影響較小的菌種。

s104：膽汁存活篩選：取s103分離菌種的肉湯培養(yǎng)物各1鉑耳，分別接種于2ml滅菌的牛膽汁中，37℃培養(yǎng)24h后置于室溫(大約18℃)下，后每隔24h取1鉑耳涂布于麥糠凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。平板上有多量密集的菌落為存活，少量稀疏菌落為生長不良，無菌落為生長死亡。取存活菌落使用甘油于4℃條件下保存。

s105：高濃度膽汁耐受篩選：用肉湯配制含牛膽汁(經(jīng)高壓滅菌后冰箱內保存的)6％、10％、20％、40％、50％和100％的無菌培養(yǎng)基。使用5號膽鹽(上海長江生化制藥廠生產(chǎn)，膽酸含70-85％)配成膽酸含量為0.25％、0.5％、1.25％、2.5％、6.0％、10.0％、20.0％、25.0％、30.0％和35.0％的無菌肉湯。每管總量均為1ml。取2.2.4分離菌的肉湯培養(yǎng)物各0.05ml和接種于膽鹽牛膽汁瓊脂中由低度膽汁到高度逐步培養(yǎng)馴化。重復s104實驗過程。

s106：將馴化得到的菌株分別進行牛膽囊動態(tài)生長模擬環(huán)境：取分離菌種的肉湯培養(yǎng)物各1鉑耳，分別接種于2ml滅菌的牛膽汁中，每6個小時上調和下調膽汁中的膽紅素濃度1％，37℃培養(yǎng)24h后置于室溫(大約18℃)下，后每隔24h取1鉑耳涂布于麥糠凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。平板上有多量密集的菌落為存活，少量稀疏菌落為生長不良，無菌落為生長死亡。檢測生長較好菌落對葡萄糖醛酸的利用情況進行再次篩選。

s107：分離提純重復s102～s104，得到血清型的大腸桿菌。

本發(fā)明解決了現(xiàn)有牛黃不能更高效的產(chǎn)生β-g酶、牛黃形成過程中對牛本身的生長影響相對較大、在膽囊環(huán)境的生長周期較短，繁殖活力較弱的問題。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。