一株高黃酮類化合物耐受性大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一高黃酮類化合物耐受性大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株為受體，將其malE基因進(jìn)行沉默獲得，能顯著提高E.coli對黃酮類化合物的耐受性，外源添加黃酮類化合物刺激E.coli生長，相較于原始菌，工程菌的最大比生長速率相較于原始菌提高了2.15倍。
【專利說明】一株高黃酮類化合物耐受性大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高黃酮類化合物耐受性大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別是一種通過沉默malE基因獲得的對黃酮類化合物耐受能力提高的大腸桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]黃酮類化合物(Flavonoids)是自然界種類最多的多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的種類已超過8000多種。黃酮類化合物具有廣泛的藥學(xué)價值，具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學(xué)作用。隨著對黃酮類化合物生物活性研究的逐步深入，對其的開發(fā)利用也越來越多，對其的需求量也越來越大，近年來，黃酮類化合物的市場每年增長30%以上，在藥品和營養(yǎng)化學(xué)品領(lǐng)域上具有廣闊的應(yīng)用前景。但天然黃酮類物質(zhì)的獲得受到時間和區(qū)域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和臨床檢驗，并且化學(xué)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，用化學(xué)合成法很復(fù)雜，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此用微生物生產(chǎn)黃酮類化合物越來越受到人們的重視。
[0003]隨著黃酮類化合物的應(yīng)用范圍越來越廣，其需求量也在不斷的增大，從植物中提取有各種各樣的問題，因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物具有很大的應(yīng)用前景。目前，黃酮類化合物生物合成的代謝途徑已經(jīng)非常清楚，黃酮類化合物的基本骨架是由3個丙二酰輔酶A(malonylCoA)和I個香豆酰輔酶A (coumaroylCoA)在查爾酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他種類的黃酮是在母核的基礎(chǔ)上通過羥基、甲氧基取代或烷基化等化學(xué)反應(yīng)生成的。大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)完善，是生物技術(shù)生產(chǎn)平臺的首選，因此很早就有人通過 改造E.coli相關(guān)代謝途徑生產(chǎn)黃酮類化合物。目前很多研究成功通過基因工程等技術(shù)手段實現(xiàn)了多種黃酮類化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜蘆醇等。但是黃酮類化合物本身對E.coli生長具有一定的抑制作用，主要是通過以下幾種機(jī)制:①破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，改變細(xì)胞膜滲透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的功能，影響細(xì)菌的生長；②抑制核酸的合成，槲皮素，芳:黃素，五羥基黃酮等能夠抑制E.coli的DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性進(jìn)而抑制DNA的合成。蘆丁能夠促進(jìn)E.coli的DNA裂解，導(dǎo)致SOS反應(yīng)發(fā)生，從而抑制菌體的生長；③抑制能量代謝，通過抑制ATP合酶的活力進(jìn)而抑制胞內(nèi)ATP的含量，影響菌體的生長。因此利用E.coli生產(chǎn)黃酮類化合物必須要考慮黃酮類化合物對E.coli的毒性作用。
[0004]目前在國內(nèi)未有關(guān)于增加E.coli對黃酮類化合物耐受性的相關(guān)蛋白的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是是找出能提高E.coli對黃酮類化合物耐受性的相關(guān)蛋白并提供一種對黃酮類化合物高耐受性的大腸桿菌，通過將可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株中malE基因進(jìn)行沉默獲得。
[0006]所述工程菌含有沉默malE基因的質(zhì)粒。[0007]所述malE基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述malE基因克隆于E.coli BL21(DE3)菌株，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malE 并轉(zhuǎn)入 E.coli BL21(DE3)中。
[0009]本發(fā)明的提出的基礎(chǔ)及前期試驗:
[0010]I)在E.coli穩(wěn)定期時添加黃酮類化合物刺激后收集菌體細(xì)胞，提取膜蛋白，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)MalE蛋白的表達(dá)量有顯著的提高。
[0011]2)提高qPCR技術(shù)驗證該蛋白在這一生理過程中的mRNA水平。
[0012]3)通過ncbi查出該基因的核苷酸序列設(shè)計引物并克隆。
[0013]4)將基因與載體連接得到重組表達(dá)載體；
[0014]5)將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)后得到重組菌株； [0015]6)重組菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后通過qPCR驗證其mRNA水平是否下降即基因是否被
沉默；
[0016]7)通過在黃酮類化合物存在的環(huán)境下生長曲線的測定，驗證該蛋白的過量表達(dá)是否提高了 E.coli對黃酮類 化合物的耐受能力。
[0017]下面是本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述:
[0018]MalE蛋白的發(fā)現(xiàn)
[0019]挑取E.coli BL21 (DE3)單菌落用LB培養(yǎng)基活化后，按I %接種量接種于25mLLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)到穩(wěn)定期(IOh)添加lg/L黃酮類化合物(蘆丁，柚皮素，白藜蘆醇)刺激3h后收集菌體細(xì)胞。按照FOCUS? Global Fractionation說明書提取膜蛋白，并用2_DClean-Up試劑盒除去蛋白樣品中的離子，最后用非干擾性蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品中的濃度，最后按照450 μ L含有800ng的濃度水化上樣，使用24cm的pH4_7的膠條進(jìn)行IEF，然后平衡兩次后用13.5%的SDS-PAGE進(jìn)行第二向，結(jié)束后用R250進(jìn)行染色12h，脫色后用ImageScanner III儀器對膠進(jìn)行拍照，獲得清楚圖像后用TOQuest進(jìn)行圖譜分析，挖出差異較大的點(diǎn)進(jìn)行脫色，酶解等步驟，然后利用MALD1-T0F/MS質(zhì)譜對肽段樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，通過檢索Matrix Science數(shù)據(jù)庫,確定蛋白種類。
[0020]qPCR
[0021]收集菌體的方法同上，利用天根公司的RNAprep Pure Cell/Bacteria試劑盒提取菌株細(xì)胞的總RNA,利用TaKaRa公司的PrimcScript'1' RT reagent試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 構(gòu)建 cDNA 文庫，利用 TaKaRa 公司的 SYBR Premix ExTaq 試劑盒和 LightCycler480IIReal Time PCR儀器進(jìn)行qPCR反應(yīng)，具體程序如下:95°C預(yù)變性30s ；95°C 5s — 55°C 20s，40次循環(huán)(PCR反應(yīng))；95°C 10s — 65°C Imin — 95°C 10s (溶解曲線分析)。為保證試驗的重現(xiàn)性，每個樣品3個平行，然后取平均值作為計算的基礎(chǔ)。
[0022]質(zhì)粒及重組菌的構(gòu)建
[0023]將從ncbi上查到的malE的基因序列設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別連接到克隆載體PMD19-T測序，獲得正確的轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行雙酶切連接到本實驗室構(gòu)建的pRSF-PTasRNA質(zhì)粒上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malE，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，提取構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL2KDE3)菌中獲得沉默了malE基因的重組菌株。
[0024]生長曲線驗證[0025]用M9 培養(yǎng)基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 % 葡萄糖，ImM 硫酸鎂，0.5 μ g/mLthiamine-HCl)活化工程菌(加入I %的氯霉素)和原始菌，按照I %的接種量接種入分別含有l(wèi)g/L蘆丁，柚皮素或者白藜蘆醇，IPTG(0，100，200，400禮)19培養(yǎng)基中，301: 200r/min培養(yǎng)，每隔Ih測0D_，直至菌株生長到穩(wěn)定期。獲得菌株的生長曲線圖，然后根據(jù)公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生長速率圖，然后得出最大比生長速率μ_。
[0026]本發(fā)明提供的工程菌耐黃酮類化合物能力提高，外源添加黃酮類化合物刺激Ε.coli生長，相較于原始菌，工程菌的最大比生長速率相較于原始菌提高了 2.15倍。
【具體實施方式】
[0027]實施例1MalE的發(fā)現(xiàn)
[0028]用接種針在Ε.coli BL21(DE3)平板上挑取單菌落接種于25mL LB培養(yǎng)基，活化12h。按照I %的接種量分別接種于4瓶25mL LB培養(yǎng)基，置于37°C搖床(200rpm)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，其中三瓶分別添加25 μ L用DMSO溶解的濃度為0.lg/L的蘆丁，柚皮素和白藜蘆醇(終濃度為lg/L)，另外一瓶添加25 μ L DMSO作為對照，培養(yǎng)3h后8000rpm低溫離心收集菌體，用去離子水洗3次后按照FOCUS? Global Fractionation說明書提取膜蛋白，并用2-D Clean-Up試劑盒除去蛋白樣品中的離子,最后用非干擾性蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品中的濃度，最后按照450 μ L含有800ng的濃度水化上樣，使用24cm的pH4_7的膠條進(jìn)行IEF，然后平衡兩次后用13.5%的SDS-PAGE進(jìn)行第二向，結(jié)束后用R250進(jìn)行染色12h，脫色后用ImageScanner III儀器對膠進(jìn)行拍照，獲得清楚圖像后用TOQuest進(jìn)行圖譜分析，其中一個膠點(diǎn)在有蘆丁，柚皮素和白藜蘆醇的樣品中相較于對照組均有2倍以上的下調(diào)，將此點(diǎn)挖出進(jìn)行脫色，脫水，酶解等步驟，然后利用MALD1-T0F/MS質(zhì)譜對肽段樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，通過檢索Matrix Science數(shù)據(jù)庫得出此點(diǎn)是E.coli屬的MalE蛋白。
[0029]實施例2耐黃酮類化合物工程菌的構(gòu)建
[0030]將從ncbi上查到的malE的基因前140bp和上游的40bp設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別連接到克隆載體PMD19-T測序，獲得正確的轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行雙酶切連接到質(zhì)粒pRSF-PTasRNA上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malE，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli JM109,涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固體培養(yǎng)基加20g/L瓊脂，121°C滅菌15min)，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，得到正確的單菌落進(jìn)行發(fā)酵提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，得到正確的單菌落即為重組菌株，也即獲得高耐受黃酮類化合物的E.coli BL2KDE3)工程菌。
[0031]實施例3高耐受黃酮類化合物E.coli BL21 (DE3)工程菌生長曲線測定
[0032]挑取工程菌和含有空質(zhì)粒pRSF-PTasRNA的E.coli BL21 (DE3)單菌落接種到含有I %卡那霉素的M9培養(yǎng)基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 %葡萄糖，ImM硫酸鎂，0.5 μ g/mL thiamine-HCl)中活化IOh后，按I %接種量接入含有I %卡那霉素，lg/L黃酮類化合物(蘆丁，柚皮素，白藜蘆醇)，以及不同濃度的IPTG(0，100, 200, 400 μ Μ)的Μ9培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)，每隔Ih測一次OD6tltl直至菌株生長到穩(wěn)定期。根據(jù)公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生長速率圖，然后得出最大比生長速率μ_，發(fā)現(xiàn)在有l(wèi)g/L蘆丁的環(huán)境中工程菌的^ max為0.42，而原始菌株的為0.23，生長速率提升了 1.83倍；在lg/L的柚皮素環(huán)境中工程菌的μ_為0.39，而原始菌株的為0.21，生長速率提升了 1.86倍；在lg/L的白藜蘆醇環(huán)境中工程菌的μ_為0.28，而原始菌株的為0.13，生長速率提升了 2.15倍。
[0033]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界 定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一株高黃酮類化合物耐受性大腸桿菌,其特征在于將可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株中malE基因進(jìn)行沉默。
2.權(quán)利要求1所述的大腸桿菌，其特征在于所述malE基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌，其特征在于所述可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。
4.權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌，其特征在于所述黃酮類化合物為蘆丁，柚皮素或白藜蘆醇。
5.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)根據(jù)所查E.coli BL21(DE3)中malE基因的前140bp和上游的30bp序列設(shè)計引物進(jìn)行克??； 2)將基因與載體連接得到重組表達(dá)載體； 3)將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli后得到重組菌株。
6.權(quán)利要求1獲得的大腸桿菌在黃酮類化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P7/22GK103923862SQ201410169642
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】陳堅, 周景文, 王奎, 李江華, 堵國成 申請人:江南大學(xué)