溫敏型谷氨酸棒桿菌、培養(yǎng)基、膠粒及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種溫敏型谷氨酸棒桿菌、培養(yǎng)基、膠粒及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能上的特異性變化，從而使得細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸向膜外滲透的模式。目前谷氨酸發(fā)酵采用的菌株一般為生物素缺陷型谷氨酸菌株和溫度敏感型谷氨酸突變菌株。其中生物素缺陷型谷氨酸菌株對(duì)于發(fā)酵底物中生物素波動(dòng)敏感性很高，而表面活性劑法發(fā)酵操作繁瑣以及青霉素法發(fā)酵產(chǎn)量低的缺陷。
[0003]相對(duì)于國(guó)內(nèi)目前使用的生物素缺陷型谷氨酸菌株，溫度敏感突變谷氨酸菌株僅需要控制溫度即可實(shí)現(xiàn)谷氨酸的生產(chǎn)，其代謝控制的步驟較為簡(jiǎn)便，具有更好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。但是，研究表明:傳統(tǒng)溫度敏感型谷氨酸菌株對(duì)于谷氨酸集聚前后環(huán)境條件變化較為敏感，關(guān)鍵點(diǎn)在于發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)變時(shí)間、以及谷氨酸分泌時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境影響條件。在單一的發(fā)酵體系中，多因素同時(shí)的改變本身的操作性較困難，同時(shí)所導(dǎo)致的不確定性因素較多

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服生物素缺陷型谷氨酸菌株對(duì)于發(fā)酵底物中生物素波動(dòng)敏感性很高，表面活性劑法操作繁瑣以及青霉素法產(chǎn)量低；以及傳統(tǒng)溫度敏感型谷氨酸菌株對(duì)于谷氨酸集聚前后環(huán)境條件變化較為敏感，均不利于谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)，而提供了一種溫敏型谷氨酸棒桿菌、培養(yǎng)基、發(fā)酵方法、膠粒及制備方法和應(yīng)用(此處最好與發(fā)明名稱一致，請(qǐng)確認(rèn))。本發(fā)明的溫敏型谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法能夠短時(shí)間內(nèi)提高谷氨酸棒桿菌的菌體密度，從而提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，且其膠粒的制備方法采用固定化包埋技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，包埋效率較高，在用于谷氨酸的連續(xù)化生產(chǎn)中能夠很好的消除生長(zhǎng)環(huán)境的波動(dòng)對(duì)谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)的影響。
[0005]固定化技術(shù)是提高生物催化劑利用效率和生物反應(yīng)速率的最有效方法之一，有助于實(shí)現(xiàn)高效率的連續(xù)化和重復(fù)化的生產(chǎn)過(guò)程，更有利于谷氨酸鈉的分離提取。因此采用固定化完成生長(zhǎng)階段的微生物密度較高的谷氨酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而投入到生產(chǎn)谷氨酸的環(huán)境中，可消除生長(zhǎng)環(huán)境的波動(dòng)對(duì)谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)的影響。
[0006]本發(fā)明最終是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的。
[0007]本發(fā)明提供了一種溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006。
[0008]本發(fā)明還提供了一種所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的培養(yǎng)基，其包含下列質(zhì)量的組分:8kg的葡萄糖，2kg的甘蔗糖蜜，5kg的玉米漿，12kg的KH2P04，0.24kg的MgS04.7Η20，0.26g的FeS04，0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡劑，以上質(zhì)量以12?14L的培養(yǎng)基計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
[0009]本發(fā)明還提供了一種所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其包含下列步驟:將所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006接種于所述的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，即可。其中，所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的接種量較佳地為15%?18%。所述的發(fā)酵培養(yǎng)期間，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值較佳地為7.0?7.2。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速度較佳地為180?240r/min ;溫度較佳地為32?33°C，時(shí)間較佳地為8?12h。
[0010]本發(fā)明還提供了一種溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006海藻酸鈉鈣鹽固定化細(xì)胞膠粒的制備方法，其包含下列步驟:
[0011](1)將2%?3%的海藻酸鈉水溶液(質(zhì)量百分比)，滅菌融化后冷卻至室溫；
[0012](2)將20%?40%的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的菌懸液與步驟⑴中的海藻酸鈉水溶液以1:9的體積比混合，充分?jǐn)嚢柚瞥删鶆虻幕旌弦海?br>[0013](3)用電子蠕動(dòng)泵通過(guò)硅膠管將混合液吸入后由另一管口擠壓出；
[0014](4)將擠壓出的珠粒滴入2%?4%的CaCl2水溶液中，固定化4?8h，即可。
[0015]本發(fā)明還提供了一種上述制備方法制得的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒。
[0016]本發(fā)明的固定化溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒，其包埋率較佳地在95%以上，連續(xù)發(fā)酵6次以上。
[0017]本發(fā)明還提供了一種所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒在谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的谷氨酸的生產(chǎn)方法，其包含下列步驟:將上述固定化溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒，采用柱式流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行谷氨酸的連續(xù)化反應(yīng)，即可。其中，所述的流化床生物反應(yīng)器中條件控制為:葡萄糖的含量為12?18g/L，溫度較佳地為36?38°C，pH值較佳地為7.2?7.4。
[0019]本發(fā)明谷氨酸的生產(chǎn)方法，谷氨酸產(chǎn)量> 100g/L。
[0020]在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0021]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0023]1、本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法，通過(guò)掌握溫度敏感型菌株的生長(zhǎng)曲線，采用高密度菌體發(fā)酵技術(shù)，短時(shí)期內(nèi)提高谷氨酸棒桿菌的菌體密度，從而提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，減少培養(yǎng)體積、強(qiáng)化下游分離提取，縮短谷氨酸生產(chǎn)周期。
[0024]2、利用海藻酸鈉固定化技術(shù)，方法簡(jiǎn)單，包埋效率較高，保持了細(xì)胞的多酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并避免了谷氨酸分泌累積的反饋抑制，有利于后期谷氨酸鈉的分離提取；制備得到的溫度敏感型谷氨酸棒桿菌膠粒具有良好的透氣性，而通過(guò)柱式流化床生物反應(yīng)器，有利于底物和產(chǎn)物分子的擴(kuò)散交換和氧的傳遞，非常適合溫度敏感型谷氨酸發(fā)酵突變菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。
[0025]3、本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)方法解決了生物素缺陷型谷氨酸菌株對(duì)于發(fā)酵底物中生物素波動(dòng)敏感性很高，表面活性劑法操作繁瑣以及青霉素法產(chǎn)量低；以及傳統(tǒng)溫度敏感型谷氨酸菌株對(duì)于谷氨酸集聚前后環(huán)境條件變化較為敏感，均不利于谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)的難題。
[0026]4、與傳統(tǒng)谷氨酸溫度敏感菌株發(fā)酵技術(shù)相比，采用固定化技術(shù)制得細(xì)胞膠粒，再進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵工藝，生產(chǎn)效率提高20?30% ;同時(shí)由于后期生物轉(zhuǎn)化體系較為純凈，更有利于后期谷氨酸鈉的分離提取，有利于谷氨酸大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。
[0028]實(shí)施例1
[0029]溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含下列質(zhì)量的組分:8kg的葡萄糖,2kg 的甘鹿糖蜜，5kg 的玉米衆(zhòng)，12kg 的 KH2P04,0.24kg 的 MgS04.7H20,0.26g 的 FeS04,
0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡劑，以上質(zhì)量以12L的發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
[0030]溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的發(fā)酵方法，其包含下列步驟:將15%的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006，在32?33°C和180r/min的條件下，接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)8h，即可。在發(fā)酵培養(yǎng)期間，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制在7.0?7.2之間。
[0031]溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒的制備方法，其包含下列步驟:
[0032](1)稱取適量的海藻酸鈉，加入蒸餾水活生理鹽水，配制成約2?3%的海藻酸鈉水溶液(質(zhì)量比)，滅菌融化后冷卻至室溫；
[0033](2)將20%?40%的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006菌懸液與步驟(1)中的海藻酸鈉水溶液以1:9的體積比混合，充分?jǐn)嚢柚瞥删鶆虻幕旌弦海?br>[0034](3)用電子蠕動(dòng)泵通過(guò)硅膠管將混合液吸入后由另一管口擠出，并滴入2%的CaCl2水溶液中，固定化4h，形成直徑為2mm的均勻固定化溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒，用無(wú)菌水洗滌后備用。
[0035]上述制備方法制得的固定化溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒，其包埋率在95%以上，可連續(xù)發(fā)酵6次以上。
[0036]谷氨酸的生產(chǎn)方法，其包含下列步驟:將上述溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒，采用柱式流化床生物反應(yīng)器進(jìn)行谷氨酸的連續(xù)化反應(yīng)，即可。其中，所述的流化床生物反應(yīng)器中葡萄糖的含量為12?18g/L，溫度為36°C，pH值為7.2。上述谷氨酸的生產(chǎn)方法，谷氨酸產(chǎn)量彡100g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006。2.—種如權(quán)利要求1所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的培養(yǎng)基，其特征在于，其包含下列質(zhì)量的組分:8kg的葡萄糖，2kg的甘蔗糖蜜，5kg的玉米漿，12kg的ΚΗ2Ρ04，0.24kg的MgS04.7Η20，0.26g的FeS04，0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡劑，以上質(zhì)量以12?14L的培養(yǎng)基計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。3.—種如權(quán)利要求1所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006發(fā)酵培養(yǎng)的方法,其特征在于包含下列步驟:將所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006接種于如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，即可。4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的接種量為15%?18% ;在發(fā)酵培養(yǎng)期間，發(fā)培養(yǎng)基的pH值為7.0?7.2 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速度為180?240r/min ;溫度為32?33°C，時(shí)間為8?12h。5.一種溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006海藻酸鈉鈣鹽固定化細(xì)胞膠粒的制備方法，其特征在于包含下列步驟: (1)將2%?3%的海藻酸鈉水溶液，滅菌融化后冷卻至室溫； (2)將含20%?40%的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的菌懸液與步驟(1)中的海藻酸鈉水溶液以1:9的體積比混合，充分?jǐn)嚢柚瞥删鶆虻幕旌弦海? (3)用電子蠕動(dòng)泵通過(guò)硅膠管將混合液吸入后由另一管口擠壓出； (4)將擠壓出的珠粒滴入2%?4%的CaCl2水溶液中，固定化4?8h，即可。6.一種如權(quán)利要求5所述的制備方法制得的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒。7.一種所如權(quán)利要求6所述的溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006膠粒在谷氨酸連續(xù)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溫敏型谷氨酸棒桿菌、培養(yǎng)基、膠粒及制備方法和應(yīng)用。該培養(yǎng)基，包含葡萄糖，甘蔗糖蜜，玉米漿，KH2PO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4，MnSO4，生物素和消泡劑。該發(fā)酵培養(yǎng)方法為：將溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006接種于所述的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，即可。該TCT006固定化細(xì)胞膠粒的制備方法包含：(1)將海藻酸鈉水溶液，滅菌融化后冷卻至室溫；(2)將溫敏型谷氨酸棒桿菌TCT006的發(fā)酵液與海藻酸鈉水溶液混合；(3)通過(guò)硅膠管將混合液吸入后擠壓出；(4)將擠壓出的珠粒滴入CaCl2水溶液中，固定化，即可。本發(fā)明使谷氨酸鈉易于分離提取，有利于大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低。
【IPC分類】C12R1/15, C12N11/10, C12P13/14, C12N11/04, C12N1/20
【公開號(hào)】CN105274018
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410290140
【發(fā)明人】吳堅(jiān)
【申請(qǐng)人】上海冠生園天廚調(diào)味品有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2014年6月24日