一種應(yīng)用于大腸桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種應(yīng)用于大腸桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法、大腸桿菌種子液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系非常密切的一類細(xì)菌，學(xué)名稱作“大腸埃希菌”，屬于腸道桿菌大類中的一種。它是寄生在人體大腸里對(duì)人體無(wú)害的一種單細(xì)胞生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，培養(yǎng)容易，它是生物學(xué)上重要的實(shí)驗(yàn)材料。
[0003]正常情況下，大多數(shù)大腸桿菌是非常安分守己的，不但不會(huì)給我們的身體健康帶來(lái)任何危害，反而還能競(jìng)爭(zhēng)性抵御致病菌的進(jìn)攻，同時(shí)還能幫助合成維生素K2，與人體是互利共生的關(guān)系。只有在機(jī)體免疫力降低、腸道長(zhǎng)期缺乏刺激等特殊情況下，才會(huì)興風(fēng)作浪，移居到腸道以外的地方，例如膽囊、尿道、膀胱、闌尾等地，造成相應(yīng)部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大腸桿菌通常被看作機(jī)會(huì)致病菌。
[0004]各種動(dòng)物大腸桿菌滅活疫苗的制備中，首要環(huán)節(jié)就是大腸桿菌的培養(yǎng)。為了獲得理想的活菌濃度，業(yè)界對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)工藝進(jìn)行了大量研宄。影響大腸桿菌培養(yǎng)菌濃度的因素有很多，如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時(shí)間、菌種接種量以及細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于:提供一種應(yīng)用于大腸桿菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法、大腸桿菌種子液制備方法，培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單，獲得理想的高活菌濃度。
本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)如下:一種應(yīng)用于大腸桿菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，由下列物質(zhì)組成:蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化鈉5.0g、葡萄糖0.2g、十二燒基硫酸鈉
0.lg、瓊脂12.0g、混合顯色底物6.77g、蒸餾水100ml、自然pH 2%去氧膽酸鈉溶液4ml、鏈霉素溶液 0.66ml、孟加拉紅溶液 0.33ml、ΚΗ2Ρ04.3Η20 0.lg、MgS04*7H20 0.05g。。
[0006]進(jìn)一步地，為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述鏈霉素溶液濃度為lOOOOu/ml。
[0007]進(jìn)一步地，為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基pH為7.2?7.4。
[0008]一種大腸桿菌種子液的制備方法，其特征在于:包括以下步驟，
(1)稱量，按培養(yǎng)基的配方比例依次準(zhǔn)確稱取蛋白胨、酵母膏粉、氯化鈉、葡萄糖、十二烷基硫酸鈉、混合顯色底物、自然PH 2%去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液、孟加拉紅溶液、KH2PO4.3Η20,MgSO4.7Η20 放入燒杯中；
(2)溶化，在上述燒杯中加入適量蒸餾水、攪拌，加熱溶解，按配方比例稱取瓊脂，加熱溶化；
(3)調(diào)節(jié)PH；
(4)分裝將培養(yǎng)基分裝入三個(gè)試管和三角燒瓶中，試管裝量不超過(guò)管高的1/5，三角燒瓶的量不超過(guò)1/2，分裝完后，加塞；
(5)包扎加塞后，用麻繩將試管捆綁，在棉塞外包一層牛皮紙，作好記錄； (6)滅菌將上述培養(yǎng)基以0.lMPa，121°C，25min高壓蒸汽滅菌；
(7)倒平板取已消毒的培養(yǎng)皿，在無(wú)菌操作臺(tái)上用三角燒瓶中的培養(yǎng)基倒置三個(gè)平板培養(yǎng)基，冷卻；
(8)擱置斜面，取滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50°C，將試管口端擱在玻璃棒上，擱置斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半；
(9)取制備的大腸桿菌種子，用接種環(huán)在已制備的的斜面上接種大腸桿菌；
(10)所述步驟(9)接種好的斜面放入37°C的恒溫箱培養(yǎng)箱子中培養(yǎng)24小時(shí)；
(11)在無(wú)菌條件下，取一支保存的大腸桿菌斜面，用無(wú)菌生理鹽水將菌種進(jìn)行沖洗，再用無(wú)菌生理鹽水將其按梯度進(jìn)行稀釋，分別吸取溶液土布平板，然后再37°C培養(yǎng)箱中過(guò)夜；
(12)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)好、特征明顯的單個(gè)菌落，接種于新鮮滅菌的大腸桿菌培養(yǎng)基中370C 170r/min恒溫培養(yǎng)18小時(shí)作大腸桿菌種子培養(yǎng)液。
[0009]一種培養(yǎng)大腸桿菌的方法，包括以下步驟:
(O 一級(jí)種子的制備，大腸桿菌菌種分別接種于含0.1%微量鹽溶液的培養(yǎng)基中，37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，劃線接種瓊脂平板上培養(yǎng)，再接種馬丁瓊脂斜面，37°C條件下培養(yǎng)20?24小時(shí)，作為一級(jí)種子；
(2)二級(jí)種子的制備，將大腸桿菌菌株的一級(jí)種子液接種到培養(yǎng)基中，37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子，置3?7°C條件下保存；
(3)將大腸桿菌菌株的二級(jí)種子液接種到含0.1%微量鹽溶液的培養(yǎng)基，二級(jí)種子液接種量為培養(yǎng)基體積總量的2?3%，菌株種子在37°C條件下于微生物搖床內(nèi)培養(yǎng)11?13小時(shí)。
[0010]進(jìn)一步地，為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述搖床轉(zhuǎn)速為120?160轉(zhuǎn)/分鐘。
[0011]進(jìn)一步地，為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘。
[0012]進(jìn)一步地，為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，菌株種子在37°C條件下雨微生物搖床內(nèi)培養(yǎng)12小時(shí)。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
本發(fā)明提供一種應(yīng)用于大腸桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，通過(guò)本培養(yǎng)基，能快速對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)優(yōu)化了微生物發(fā)酵培養(yǎng)菌條件，培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單，能夠獲得理想的高活菌濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0015]實(shí)施例1:
1、準(zhǔn)備兔大腸桿菌菌種:大腸桿菌EC45菌株；菌株向農(nóng)業(yè)部下屬中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所建立的中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)購(gòu)買。菌種標(biāo)準(zhǔn):
①形態(tài)和生化特性:培養(yǎng)物涂片為革蘭氏陰性桿菌。生化特性應(yīng)符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。
②培養(yǎng)特征:接種麥康凱式培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，肉眼觀察呈粉紅色，菌落隆起，表面光滑。低倍顯微鏡下45度折光觀察，邊緣整齊，呈鮮艷的金光。 ③血清學(xué)特性:EC45為02。
④毒力:大腸桿菌EC45毒力測(cè)定。取2月齡兔3只，胸部肌肉注射大腸桿菌EC24菌株的普通肉湯菌液0.5ml (含活菌2?5X108 CFU)，觀察10日，應(yīng)全部發(fā)病。
⑤免疫原性:各菌株按本發(fā)明分別制備單價(jià)蜂膠滅活疫苗進(jìn)行免疫原性鑒定。取2月齡兔3只，經(jīng)頸部皮下注射0.5ml, 21日后連同條件相同的對(duì)照兔3只，分別經(jīng)胸部肌肉注射一個(gè)最小感染劑量(IMID)的對(duì)應(yīng)制苗用強(qiáng)毒菌液0.5ml (含活菌3?4X 108CFU)，觀察7曰。
純粹:按照《中國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
2、制備兔大腸桿菌菌株的一級(jí)種子液:將兔大腸桿菌菌種分別接種于含0.1%微量鹽溶液的培養(yǎng)基(蛋白胨15.0g、酵母膏粉3.0g、氯化鈉5.0g、葡萄糖0.2g、十二燒基硫酸鈉0.lg、瓊脂12.0g、混合顯色底物6.77g、蒸餾水100ml、自然pH 2%去氧膽酸鈉溶液4ml、鏈霉素溶液 0.66ml、孟加拉紅溶液 0.33ml、KH2PO4.3Η20 0.lg、MgSO4*7H20 0.05g，PH7.2)中，37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，劃線接種麥康凱氏瓊脂平板上培養(yǎng)，各菌株選取符合上述“培養(yǎng)特征”標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落8個(gè)，再分別接種馬丁瓊脂斜面若干支，37°C條件下培養(yǎng)20小時(shí)，作為一級(jí)種子，置8°C條件下保存?zhèn)溆茫?0日內(nèi)用完。
[0016]3、制備兔大腸桿菌菌株的二級(jí)種子液:將兔大腸桿菌菌株的一級(jí)種子液接種到上述培養(yǎng)基中，37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子，置3°C條件下保存，且3日內(nèi)用完。
4、將兔大腸桿菌菌株的二級(jí)種子液接種到含0.1%微量鹽溶液的上述培養(yǎng)基，其pH值范圍為7.4 ;二級(jí)種子液接種量為培養(yǎng)基體積總量的3%，菌株種子在37°C條件下于微生物發(fā)酵罐內(nèi)通入新鮮氧氣，通氣量為3升/分鐘，攪拌速度控制為160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)11小時(shí)。所得菌液活菌數(shù)較高，活菌濃度為4.8 X 109 CFU/ml。
[0017]實(shí)施例2:
1、準(zhǔn)備兔大腸桿菌菌種:兔大腸桿菌EC24菌株；菌株向農(nóng)業(yè)部下屬中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所建立的中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)購(gòu)買。菌種標(biāo)準(zhǔn):
①形態(tài)和生化特性:培養(yǎng)物涂片為革蘭氏陰性桿菌。生化特性應(yīng)符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。
②培養(yǎng)特征:接種麥康凱式培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，肉眼觀察呈粉紅色，菌落隆起，表面光滑；低倍顯微鏡下45度折光觀察，邊緣整齊，呈鮮艷的金光。
[0018]③血清學(xué)特性:EC24為078。
④毒力:兔大腸桿菌EC24毒力測(cè)定。取I月齡