柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及到新的柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柱狀黃桿菌(JUavotmctorium columnare)隸屬于擬桿菌門、黃桿菌綱、黃桿菌目、黃桿菌科，是革蘭氏陰性的能滑動的需氧桿菌。它是一種世界范圍內(nèi)流行的淡水魚類的重要致病菌，其感染會導致魚類出現(xiàn)爛鰓、體表潰瘍、鰭條腐爛、出血等癥狀，稱為柱形病。柱狀黃桿菌嚴重危害我國重要經(jīng)濟魚類，如草魚、青魚、鱖、鯉、鯽、團頭魴、鰻鱺、巨脂鯉、銀鱸、鮭、鱒、白鯧、羅非魚等。被感染的魚類具有很高的死亡率，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來數(shù)以億計的巨大經(jīng)濟損失，是我國重要的魚類病原菌。我國很重視柱狀黃桿菌的研究，目前主要集中細菌的快速鑒定和疫苗研發(fā)。如“一種檢測無鱗魚致病菌柱狀黃菌的方法和檢測試劑盒”(申請?zhí)?CN201010180832)。此專利采用PCR技術(shù)鑒定菌種，沒有涉及到選擇性培養(yǎng)基配方和柱狀黃桿菌的分離純化方法?！爸鶢铧S桿菌基因重組疫苗的制備方法”(申請?zhí)?CN201310478221)。此專利為柱狀黃桿菌基因重組疫苗制備方法，也沒有涉及到選擇性培養(yǎng)基配方和柱狀黃桿菌的分離純化方法。
[0003]在魚類疾病的研究中，快速分離病原菌是從事疾病研究的首要環(huán)節(jié)。但是，目前還缺乏快速分離該菌的選擇性培養(yǎng)基。在病原菌的分離過程中，只要有一個雜菌的存在，就會導致整個細菌分離的失敗。因此，開展細菌的純化技術(shù)研究是必須的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基，其特征在于:它是在柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2 μ g/mL、多粘菌素B使其終濃度為20 U/mL,倒平板而得到的柱狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基；
或為在柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基的配方中去除瓊脂，滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2 μ g/mL、多粘菌素B使其終濃度為20 U/mL而得到的柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基。
[0006]按上述方案,所述的柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基為常規(guī)Shieh固體培養(yǎng)基。
[0007]按上述方案，所述的常規(guī)Shieh固體培養(yǎng)基為:稱取蛋白胨5 g、酵母提取物
0.5 g、Noble 瓊脂 10 g、K2HPO4 0.1 g、KH2PO4 0.05 g、乙酸鈉 0.01 g、NaHCO3 0.05 g、MgSO4.7H20 0.3 g、BaCl2.H2O 0.01 g、FeSO4.7H20 0.001 g、CaCl2.2H20 0.0067 g 加入到1000 mL蒸懼水中，調(diào)pH至7.2,滅菌而得。
[0008]按上述方案，所述的滅菌溫度120°C，滅菌時間為20min。
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種利用上述柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基分離純化柱狀黃桿菌的方法，步驟如下:
1)、在魚類病灶上，采用無菌操作，將細菌通過劃平板法接種到柱狀黃桿菌常規(guī)固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，至培養(yǎng)基上觀察到柱狀黃桿菌的典型黃色菌落；
2)、挑選上述步驟培養(yǎng)得到的單一黃色菌落，劃線接種到柱狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)
3)、挑選上述步驟培養(yǎng)得到的單一黃色菌落，再次接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)；
4)將上述步驟培養(yǎng)得到的黃色菌液按照10倍系列稀釋，均勻涂布到狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)；
5)挑選最低稀釋倍數(shù)出現(xiàn)細菌的平板上的單一黃色菌落，接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)，然后經(jīng)確證為純的柱狀黃桿菌菌種后，進行低溫保存或干燥保存，即得分離純化后的柱狀黃桿菌。
[0010]按上述方案，所述的培養(yǎng)為26-28°C培養(yǎng)24-26小時。
[0011]按上述方案，所述步驟4)中進行10倍系列稀釋后得到稀釋度為10_5~10_8的體系。
[0012]按上述方案，在進行一次選擇分離后未能得到純的柱狀黃桿菌后，再重復步驟2)到步驟5)，直到獲得純的柱狀黃桿菌菌種。
[0013]按上述方案，所述柱狀黃桿菌的確證包括進行形態(tài)學實驗，生理生化實驗和細菌16S rDNA基因測序?qū)嶒?，基于形態(tài)學特征，生理生化特征和16S rDNA基因序列特征進行確證。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供的柱狀黃桿菌選擇性培養(yǎng)基，可以從環(huán)境和魚類病灶中快速分離到柱狀黃桿菌，為研究該細菌提供純的菌種，由此便于柱狀黃桿菌導致的相關(guān)疾病的研究。
[0015]【具體實施方式】:
以下結(jié)合實例對本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步的描述:
實施例1:
柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基為常規(guī)Shieh固體培養(yǎng)基。所述的常規(guī)Shieh固體培養(yǎng)基為:稱取蛋白胨5 g、酵母提取物0.5 g、Noble瓊脂10 g、K2HPO4 0.1 g、KH2PO4 0.05 g、乙酸鈉 0.01 g、NaHCO3 0.05 g、MgSO4.7H20 0.3 g、BaCl2.H2O 0.01 g、FeSO4.7H20 0.001 g、CaCl2.2H20 0.0067 g加入到1000 mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.2，滅菌而得。
[0016]柱狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基:在上述柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2 μ g/mL、多粘菌素B使其終濃度為20 U/mL，倒平板而得；
柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基:在上述柱狀黃桿菌常規(guī)培養(yǎng)基的配方中去除瓊脂，滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2 μ g/mL、多粘菌素B使其終濃度為20 U/mL而得。
[0017]黃顙魚柱狀黃桿菌的分離
1、取上述制備的柱狀黃桿菌常規(guī)固體培養(yǎng)基、選擇性固體培養(yǎng)基和選擇性液體培養(yǎng)基，備用；
2、挑取病魚黃顙魚尾部病灶，劃線接種到柱狀黃桿菌常規(guī)固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基上可以觀察到柱狀黃桿菌的典型黃色菌落。
[0018]3、挑選上述培養(yǎng)得到的單一黃色菌落，劃線接種到柱狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)48小時。
[0019]4、挑選上述培養(yǎng)得到的單一黃色菌落，接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)24小時；
5、將黃色菌液按照10倍系列稀釋(稀釋后稀釋度為10_5~10_8)，均勻涂布到狀黃桿菌選擇性固體培養(yǎng)基上，在28 °C培養(yǎng)48小時；
6、挑選10_8稀釋平板上的單一黃色菌落，接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)24小時，得到較純培養(yǎng)物；
7、菌株確證:
用步驟6)得到的純化菌液做革蘭氏染色，細菌呈紅色，形態(tài)單一。
[0020]收集步驟6)得到的純化菌液，采用通用引物，做菌液PCR擴16S rDNA并測序，具體如下:
I)引物序列:27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ； 1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，27F序列如 SEQ ID NO:1 所示，1492R序列如 SEQ ID NO:2所示。
[0021]2)反應(yīng)體系:菌液 I yL，27F:l μ L (10 μ M), 1492R:1 μ L (10 μ Μ), 2 X TaqMix (康為世紀公司):10 μ L, dd H2O:7 μ L。
[0022]3)反應(yīng)程序:預(yù)變性 95 °C，5 min ;變性 95°C，30 s，退火 55°C，40 8，延伸，72°〇，2min, 35個循環(huán)；終止延伸72°C，10 min。
[0023]4)將擴增得到的DNA產(chǎn)物，直接送公司測序，獲得下列測序結(jié)果(1409 bp),序列如 SEQ ID NO:3 所示:
TGTCGCGGCTACCATGCAGTCGAGGGGTAGAAGGAGCTTGCTCCTTTGAGACCGGCG