技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于乳酸菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高活性飼用植物乳桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》所列菌種，屬于人及動物腸道中的正常菌群，進(jìn)入腸道后可有效定殖。植物乳桿菌代謝碳水化合物產(chǎn)生乳酸，有利于降低腸道環(huán)境ph，抑制有害菌的生長。植物乳桿菌代謝過程中還會產(chǎn)生過氧化氫，細(xì)菌素等物質(zhì)，對致病菌有一定的殺滅作用，而且不會有藥物殘留。鑒于植物乳桿菌的以上特性，越來越多的廠家選擇其作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)菌種之一。

傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵多選用mrs培養(yǎng)基，價格昂貴，發(fā)酵后的活菌數(shù)低于1×10⁹cfu/ml，在益生菌有效使用劑量固定的情況下，低發(fā)酵水平等于變相的增加了成本。低成本的培養(yǎng)基，高效的可放大的發(fā)酵工藝對于推進(jìn)益生菌產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化有重大指導(dǎo)及實踐意義。

總之，篩選一株高活性植物乳桿菌，并開發(fā)一種低成本、高產(chǎn)量，能長期保持活性的植物乳桿菌微生態(tài)制劑，對于發(fā)展綠色飼料，保證食品安全具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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（一）發(fā)明目的：

本發(fā)明的第一個目的是提供一株飼用植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747。

采集60日齡健康仔豬的糞便，從中分離、篩選，鑒定出一株植物乳桿菌lactobacillusplantarum，命名為wei-70，并于2015年11月26日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為cgmccno.11747，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所郵編:100101電話：86-10-64807596。

植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747為革蘭氏陽性細(xì)菌，圓端桿狀，，無芽孢，無鞭毛；兼性厭氧，最適生長溫度為30-40℃，最適ph為6.0-7.0。在mrs培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h以上，活菌數(shù)可接近1×10⁹cfu/ml。

本發(fā)明的第二個目的是提供植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的高密度液體培養(yǎng)方法。

本發(fā)明提供的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的高密度液體培養(yǎng)方法，是將該菌接種至專用的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的主要成分如下：

麥芽糊精20g/l、玉米漿粉32g/l，三水合乙酸鈉3g/l，三水合磷酸氫二鉀2g/l，檸檬酸銨2g/l，七水合硫酸鎂0.6g/l，一水合硫酸錳0.1g/l、吐溫801g/l，ph值為6.5。

在上述培養(yǎng)方法中，接種比例為1%；培養(yǎng)溫度為34-37℃；靜置或不通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為16-20h。

在50l發(fā)酵罐條件下，利用上述培養(yǎng)基在37℃，轉(zhuǎn)速100rpm，不通氣的條件下發(fā)酵24h后獲得的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的發(fā)酵液的活菌數(shù)可達(dá)到5.0×10⁹-6.0×10⁹cfu/ml。而同樣條件下，植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在mrs培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的活菌數(shù)只有9.2×10⁸cfu/ml，優(yōu)化后的培養(yǎng)基使活菌數(shù)提高了5倍以上。

本發(fā)明的第三個目的是提供植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747作為微生態(tài)制劑的制備方法，將菌種經(jīng)一級種子搖瓶和50l發(fā)酵罐富集后的發(fā)酵液通過高速管式離心機(jī)收集菌泥，與菌體保護(hù)劑混合均勻，先于-70℃預(yù)凍4-5h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中，在以下凍干參數(shù)下進(jìn)行凍干：真空度小于30pa，冷阱溫度為-40℃至-50℃，凍干41h，干燥后獲得活性菌粉，將菌粉用粉碎機(jī)破碎后與同樣粒度的玉米芯粉混合，獲得微生態(tài)制劑產(chǎn)品。

所述高速管式離心機(jī)收集菌體的轉(zhuǎn)速為15000-20000rpm。

所述菌體保護(hù)劑配方為：每1000ml水中含有：脫脂奶粉100g，谷氨酸鈉10g，海藻糖10g，甘油30g。

所述菌泥與菌體保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1:5。

飼用植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747可以作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品應(yīng)用在調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡中。

飼用植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747可以作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品應(yīng)用在預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉中。

（二）意義：

本發(fā)明提供了一株植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747，并優(yōu)化了該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，實現(xiàn)了降低成本、提高發(fā)酵活菌數(shù)的效果。植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以此工藝進(jìn)行50l發(fā)酵罐水平的發(fā)酵，活菌數(shù)最高可達(dá)到6.0×10⁹cfu/ml，是mrs培養(yǎng)基的6倍以上。在此基礎(chǔ)上制作的微生態(tài)制劑凍干粉活菌數(shù)最高可達(dá)7.0×10¹¹cfu/g。

本發(fā)明提供的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747具有顯著的益生特性，動物服用后可以通過胃液和膽鹽，并在腸道中存活。按照上述培養(yǎng)方法和后處理方法制備的微生態(tài)制劑產(chǎn)品，用作畜禽微生物飼料添加劑，可以抑制腸道有害菌的增殖，調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，提高畜禽生產(chǎn)能力、抗病能力，最終減少飼用抗生素的使用。

附圖說明

圖1為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在人工胃液（ph2.0）中的存活曲線。

圖2為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在豬膽鹽溶液（膽鹽濃度20g/l）中的存活曲線。

圖3為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747對人工胃腸消化液的耐受性。圖中前2h（虛線為界）是菌株在人工胃液中的存活曲線，隨后的22h是菌株從人工胃液轉(zhuǎn)接至人工腸液后的存活曲線。

圖4為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵碳源的優(yōu)化。

圖5為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵氮源的優(yōu)化。

圖6為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化。

圖7為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵ph的優(yōu)化。

圖8為植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在50l發(fā)酵罐條件下的生長曲線。

具體實施方式:

下列具體實例可以更好地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的應(yīng)用范圍并不僅限于以下實例。

實施例一：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的分離和鑒定：

稱取60日齡健康仔豬的糞便25g，放入盛有225ml滅菌的0.85%生理鹽水的三角瓶中（三角瓶中預(yù)先放入20粒無菌玻璃珠），37℃，180rpm震蕩30min，吸取1ml懸濁液做十倍遞增梯度稀釋，選取2-3個適宜稀釋度，吸取1ml稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做兩個平行；向加有稀釋液的培養(yǎng)皿中加入融化后冷卻至46℃的mrs瓊脂培養(yǎng)基，小心轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使試樣與培養(yǎng)基充分混合，37℃培養(yǎng)48-72h。從培養(yǎng)皿上挑選不同形態(tài)的菌落劃線純化，分別保藏并進(jìn)行16srdna的測序鑒定。

實施例二：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747耐受低ph胃液、豬膽鹽和人工胃腸消化液：

從植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的保藏斜面（mrs培養(yǎng)基）挑一環(huán)菌苔接于裝有100ml液體mrs培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于37℃，靜置培養(yǎng)18h，將菌液在6000rpm的條件下離心10min，棄去上清，用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌一次，再用同體積生理鹽水懸浮。吸取10ml懸浮菌液分別接于裝有90mlph分別為1、2、3、4、5的人工胃液和90ml人工豬膽鹽溶液的250ml三角瓶中，豬膽鹽濃度分別為3g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l，每種條件做三個平行，同時以不加膽鹽的樣品為對照。然后在37℃，靜置培養(yǎng)180min，分別于初始接種、30min、60min、120min、180min對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，繪制活菌數(shù)變化曲線，計算菌株在不同ph人工胃液和不同濃度豬膽鹽中保溫180min時的存活率。菌液在人工胃液中保溫2h后吸取10ml菌懸液接于裝有90ml人工腸液的250ml三角瓶中，同樣在37℃，靜置培養(yǎng)，分別于初始接種、0.5h、1h、1.5h、2h、6h、12h、18h、24h對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，繪制活菌數(shù)變化曲線。

結(jié)果分析：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在ph2.0的人工胃液中保持180min，存活率達(dá)到85%以上，結(jié)果見圖1；在濃度為20g/l的人工豬膽鹽溶液中保持180min，存活率超過70%，結(jié)果見圖2。植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在人工胃腸消化液中保持24h，活菌數(shù)可以維持在10⁷cfu/ml，這個時間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發(fā)揮益生作用，結(jié)果見圖3。

實施例三：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的抑菌活性：

1、培養(yǎng)平板的制備：

從植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的保藏斜面（mrs培養(yǎng)基）挑一環(huán)菌苔接種于液體mrs培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)18h，取0.1ml菌液涂布于mrs平板，37℃，培養(yǎng)48h。

2、抑菌活性檢測平板的制備：

將指示菌的lb培養(yǎng)液稀釋100倍后，吸取0.1ml菌液涂布于lb平板。37℃，過夜培養(yǎng)。所述指示菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌。

3、抑菌活性的測定：

用無菌打孔器在植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747的培養(yǎng)平板上打孔，然后將菌塊放于涂好指示菌的lb平板上，37℃，培養(yǎng)20h，觀察并測量抑菌圈直徑。

4、結(jié)果分析：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747對4種指示菌都有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑大小為30-35mm。

實施例四：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵碳源的優(yōu)化：

1、配制不含葡萄糖的mrs培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝至500ml三角瓶中，裝液量300ml/瓶。

2、稱取適量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚異麥芽糖、麥芽糊精、乳清粉、糖蜜作為碳源，分別加入到上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分溶解后，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)ph至6.5，補水至300ml/瓶，每瓶中c的終濃度均為0.67m。121℃滅菌20分鐘，制成不同的碳源培養(yǎng)基。

3、用5ml無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全沖洗下來，全部接種到上述碳源培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8ml菌懸液，37℃靜置培養(yǎng)24h后測定活菌數(shù)。每種碳源培養(yǎng)基做三個重復(fù)。

4、結(jié)果分析：碳源優(yōu)化實驗結(jié)果表明，植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以麥芽糊精作為碳源發(fā)酵24h后，可以獲得最大活菌數(shù)。因此，確定麥芽糊精作為發(fā)酵最佳碳源，結(jié)果見圖4。

實施例五：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵氮源的優(yōu)化：

1、用麥芽糊精替代mrs培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制不含有機(jī)氮源（即不含蛋白胨、牛肉膏及酵母膏）的mrs培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝至500ml三角瓶中，裝液量300ml/瓶。

2、稱取適量的魚蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿、玉米漿粉、尿素、硝酸鈉和硫酸銨，分別加入到上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分溶解后，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)ph至6.5，補水至300ml/瓶，每瓶中總氮的含量均為2.59g/l。121℃滅菌20分鐘，制成不同的氮源培養(yǎng)基。

3、用5ml無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全沖洗下來，全部接種到上述氮源培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8ml菌懸液，37℃靜置培養(yǎng)24h后測定活菌數(shù)。每種氮源培養(yǎng)基做三個重復(fù)。

4、結(jié)果分析：氮源優(yōu)化實驗結(jié)果表明，植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747以玉米漿粉作為氮源發(fā)酵24h后，可以獲得最大活菌數(shù)。因此，確定玉米漿粉作為發(fā)酵最佳氮源，結(jié)果見圖5。

實施例六：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化：

、配制植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747培養(yǎng)基，成份如下：玉米漿粉32g/l、麥芽糊精20g/l，三水合乙酸鈉3g/l，三水合磷酸氫二鉀2g/l，檸檬酸銨2g/l，七水合硫酸鎂0.6g/l，一水合硫酸錳0.1g/l、吐溫801g/l，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)ph至6.5，分裝至500ml三角瓶中，裝液量300ml/瓶。121℃滅菌20min。

2、用5ml無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全沖洗下來，全部接種到上述培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8ml菌懸液，分別于31℃、34℃、37℃、40℃和43℃靜置培養(yǎng)24h后測定活菌數(shù)。每種培養(yǎng)溫度做三個重復(fù)。

3、結(jié)果分析：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在34℃和37℃條件下靜置培養(yǎng)24h，可以獲得最大活菌數(shù)。因此，確定最適培養(yǎng)溫度為34-37℃，結(jié)果見圖6。

實施例七：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747最適發(fā)酵初始ph的優(yōu)化：

、配制植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747培養(yǎng)基，成份如下：玉米漿粉32g/l、麥芽糊精20g/l，三水合乙酸鈉3g/l，三水合磷酸氫二鉀2g/l，檸檬酸銨2g/l，七水合硫酸鎂0.6g/l，一水合硫酸錳0.1g/l、吐溫801g/l，分裝至500ml三角瓶中，裝液量300ml/瓶，分別用冰醋酸或40%naoh溶液調(diào)ph為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。121℃滅菌20min。

2、用5ml無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747斜面上的菌苔完全沖洗下來，全部接種到上述培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8ml菌懸液，37℃靜置培養(yǎng)24h后測定活菌數(shù)。每種ph做三個重復(fù)。

3、結(jié)果分析：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747在ph6.5，37℃靜置培養(yǎng)24h的條件下，可以獲得最大活菌數(shù)。因此，確定最適發(fā)酵ph為6.5，結(jié)果見圖7。

實施例八：植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747發(fā)酵培養(yǎng):

用5ml無菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)的wei-70斜面上的菌苔完全沖洗下來，吸取0.8ml菌懸液接種至裝有300ml專用發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于37℃，靜置培養(yǎng)18h，以1%的接種量接于裝有30lph為6.5的專用液體發(fā)酵培養(yǎng)基的50l發(fā)酵罐中，于37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，轉(zhuǎn)速控制在100rpm，不通氣，培養(yǎng)20h，ph降至4.0左右，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液活菌數(shù)最大可達(dá)6.0×10⁹cfu/ml。

結(jié)果分析：50l發(fā)酵罐發(fā)酵后的活菌數(shù)最高達(dá)到6.0×10⁹cfu/ml，是相同條件下在mrs培養(yǎng)基中發(fā)酵活菌數(shù)的6倍以上。植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.1174750l發(fā)酵罐生長曲線圖見圖8。

植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747專用發(fā)酵培養(yǎng)基，成份如下：玉米漿粉32g/l、麥芽糊精20g/l，三水合乙酸鈉3g/l，三水合磷酸氫二鉀2g/l，檸檬酸銨2g/l，七水合硫酸鎂0.6g/l，一水合硫酸錳0.1g/l、吐溫801g/l，ph為6.5。

實施例九：植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747發(fā)酵液的真空冷凍干燥處理：

將實施例八所述的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747發(fā)酵液經(jīng)過高速管式離心機(jī)，在15000-20000rpm的條件下離心收集菌體。為了降低真空冷凍干燥處理成本，提高凍干后菌粉產(chǎn)品的存活率，選擇了4種保護(hù)劑配方（見表1）加以比較。將4種經(jīng)滅菌的保護(hù)劑按照體積質(zhì)量比5:1與離心后的菌體均勻混合，-70℃預(yù)凍4-5h，置于-40℃至-50℃的真空冷凍干燥機(jī)的冷阱中，真空度30pa以下，凍干41h左右。取出菌粉，測定活菌數(shù)，計算存活率。

結(jié)果分析，保護(hù)劑4適合用于植物乳桿菌（lactobacillusplantarum）wei-70cgmccno.11747發(fā)酵液的真空冷凍干燥處理，存活率可達(dá)93%，菌粉活菌數(shù)可達(dá)5.0×10¹¹-7.0×10¹¹cfu/g。因此菌體保護(hù)劑配方確定為：每1000ml水中含有：脫脂奶粉100g，谷氨酸鈉10g，海藻糖10g，甘油30g。

表1.保護(hù)劑編號及配方

飼用植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747可以用于調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，也可以作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品用于預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉。

序列表

<110>北京偉嘉盛邦生物技術(shù)有限公司北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司

<120>一株高活性飼用植物乳桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用

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