本發(fā)明屬于食品
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及植物乳桿菌st菌株及其在酸茶加工的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：中國是茶的國度，也是茶文化的起源地，對茶的描述最早可以追溯到上古的神農(nóng)時期，當(dāng)代的陸羽《茶經(jīng)》中就有記載：“茶之為飲，發(fā)乎神農(nóng)氏”。飲茶在我國已有幾千年的歷史，是人們普遍喜愛的日常飲料，目前已與可可、咖啡并稱為世界三大無酒精飲料之一。國內(nèi)外大量研究表明，茶葉中含有茶多酚、生物堿、茶多糖、茶色素等多種活性成分，其中茶多酚具有清除自由基、抗癌、抗突變、殺菌、降血壓、抗輻射、防止心血管疾病和糖尿病等多種多種保健功能。兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65％～80％，主要包括兒茶素(ec)、沒食子兒茶素(egc)、兒茶素沒食子酸酯(ecg)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)4種物質(zhì)。云南省地處中國西南部，得天獨厚的自然條件和悠久的種茶歷史，孕育了豐富的茶樹種質(zhì)資源，是世界上茶樹的起源中心、原產(chǎn)地。居住在云南各地的少數(shù)民族種茶、制茶、愛茶，幾乎每個民族都保留著各具特色的飲(吃)茶方式，形成了自己獨特的飲食習(xí)慣和民間養(yǎng)生保健方法，創(chuàng)造了燦爛的名族文化。德昂族是我國跨境民族之一，長期居住在云南德宏、保山、臨滄等地的偏遠山區(qū)，歷史上因交通閉塞、生產(chǎn)力落后、生活水平低等因素，缺醫(yī)少藥，倍受疾病的折磨。德昂族被稱為“古老的茶農(nóng)”，在與疾病的抗?fàn)幹?，德昂族?jīng)過長期的生活實踐，逐漸孕育出了酸茶等一些具有鮮明民族特色的民間養(yǎng)生保健方法，并延續(xù)至今?，F(xiàn)如今德昂酸茶制作工藝是在每年5、6月份在高溫高濕時節(jié)，德昂族采集大葉種茶樹鮮葉，經(jīng)晾曬、沖洗、蒸(煮)茶和揉茶，裝入竹筒之中，埋入地下發(fā)酵60-70天后，開水沖泡；也可以在發(fā)酵后再經(jīng)壓制和干燥制成茶磚，開水沖泡后飲用。從酸茶的加工工藝可以看出，目前酸茶的加工方法還僅僅停留在傳統(tǒng)經(jīng)驗上，酸茶產(chǎn)品普遍存在加工周期長、質(zhì)量不穩(wěn)定、品質(zhì)不統(tǒng)一、安全性難以保證等弊端。因此，規(guī)范酸茶加工方法，提高酸茶品質(zhì)，保證質(zhì)量穩(wěn)定，讓“藏在深閨人不識、微酸微苦味甘甜”的德昂族酸茶被世界認可，具有廣闊前景和重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明從自然發(fā)酵酸茶中分離得到植物乳桿菌st，將植物乳桿菌st接種到酸茶發(fā)酵過程中，可以顯著提高酸茶中兒茶素總量，提高酸茶品質(zhì)，同時可以縮短加工周期，保證產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)方案是：植物乳桿菌st，該植物乳桿菌2017年4月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.13911，分類命名為植物乳桿菌st。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。該植物乳桿菌具有抑制主要腐敗菌和食源致病菌生長及促進茶多酚生物轉(zhuǎn)化的能力，將植物乳桿菌st接種到酸茶加工過程中，可以縮短加工周期，保證產(chǎn)品質(zhì)量、提高酸茶品質(zhì)。應(yīng)用植物乳桿菌st加工酸茶的方法，其步驟如下：(1)清洗茶樹鮮葉，瀝干表面水分，將清洗后茶葉進行蒸汽殺青；蒸汽殺青的時間點以茶鮮葉青草氣消失，葉色變黃為適度；(2)揉茶后，將茶葉置于玻璃瓶內(nèi)，壓緊；(3)接種植物乳桿菌st凍干菌粉，接種量為茶鮮葉重量0.02％，搖晃混勻；(4)密封玻璃瓶，置于25-37℃環(huán)境，發(fā)酵15d；(5)瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成型。本發(fā)明與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，可顯著縮短酸茶生產(chǎn)周期。增加酸茶中主要兒茶素含量，提高酸茶品質(zhì)，而且加工過程可控，酸茶產(chǎn)品質(zhì)量一致。具體實施方式實例1植物乳桿菌st的篩選、鑒定1.植物乳桿菌st的篩選在無菌條件下，稱取1g左右的酸茶樣品，加入到10ml的pbs中，勻漿5min后，按1％的比例接種到含0.1％維生素c的mrs肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h。將富集后的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，在碳酸鈣-mrs固體培養(yǎng)基鋪板，37℃厭氧培養(yǎng)24h，從平板中挑取溶鈣圈大的單菌落。2.植物乳桿菌st的鑒定將從酸茶中分離得到的乳酸菌疑似菌株，擴大培養(yǎng)后采用甘油方法進行保存。并對疑似菌株進行分子生物學(xué)鑒定，具體方法為：(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因組；(2)以正向引物f:5’-agagtttgatcctggctcag-3’和反向引物r:5’-tacggctaccttgttacgactt-3’進行16srdnapcr擴增。表1pcr擴增體系table1thepcrsystemforamplificationof16srdnapcr反應(yīng)條件為預(yù)變性(95℃，4min)；變性(94℃，30s)，退火(55℃，30s)，延伸(72℃，1.5min)，30個循環(huán)，最后延伸(72℃，10.0min)；對16srdna擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，拍照，記錄檢測結(jié)果；將擴增成功的pcr產(chǎn)物用冰袋保存寄到華大科技公司測序，測得菌株16srdna序列后，在ncbi上使用blast程序比對，與植物乳桿菌同源性大于99％，基于凡是16srdna可變區(qū)序列的同源性大于97.5％的便可認為是同一個種的標(biāo)準，該菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌st。實例2植物乳桿菌st的抑菌特性采用瓊脂打孔擴散法，研究植物乳桿菌st對主要腐敗菌和食源性致病菌生長繁殖的抑制作用。植物乳桿菌st接種于mrs肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，4℃，5000rpm，離心10min，收集上清液。上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，用氫氧化鈉中和至ph6.5。將20μl培養(yǎng)24h的指示菌菌液(大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌和單胞李斯特菌)加入到融化并冷卻到45℃的1.2％tsa固體培養(yǎng)基中，劇烈混合后迅速倒入平皿中，待培養(yǎng)基凝固后用牛津杯在培養(yǎng)基上打孔(直徑8mm)，吸取90μl植物乳桿菌st培養(yǎng)液上清注入小孔中，鼠李糖乳桿菌gg為參照，滅菌的mrs液體培養(yǎng)基為空白對照，室溫下擴散4h后，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑。植物乳桿菌st對三株腸道致病菌的抗菌活性結(jié)果表2所示，植物乳桿菌st能顯著抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏、福氏志賀氏菌和單胞李斯特菌的生長，抗菌活性優(yōu)于參考益生菌菌株鼠李糖乳桿菌gg。表2植物乳桿菌st對腸道致病菌的抑制作用注：-,無抑菌圈；+,抑菌圈直徑<3mm；++,抑菌圈直徑在3-6mm之間；+++,抑菌圈直徑>6mm實例3植物乳桿菌st的茶多酚生物轉(zhuǎn)化能力將曬青毛茶水浸提液中接種植物乳桿菌st，37℃厭氧發(fā)酵48小時后，10000g，離心10分鐘，收集上清液，0.22μm無菌濾膜過濾，hplc-dad方法檢測egc、ec、egcg、ecg的含量。結(jié)果如表3所示，與毛茶浸提液相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的主要兒茶素總量提高了28.4％(p<0.05)，egc含量從原先的未檢出增加到95.2μg/ml(p<0.05)，ec含量增加了600％(p<0.05)，egcg含量降低了40.8％(p<0.05)，ecg含量降低了39.5％(p<0.05)。結(jié)果表明，植物乳桿菌st液態(tài)發(fā)酵酸茶促進了兒茶素的生物轉(zhuǎn)化，egc和ec含量顯著增加。實例4接種植物乳桿菌st生產(chǎn)酸茶實驗1采摘茶樹鮮葉，用自來水清洗干凈，瀝干表面水分，經(jīng)蒸汽殺青和揉茶，表3酸茶植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵對酸茶中兒茶素含量注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。置于無菌玻璃瓶內(nèi)，按茶鮮葉重量的0.02％稱取植物乳桿菌st凍干菌粉，用少量無菌水混合后，均勻噴灑到茶葉表面，壓緊茶鮮葉，不接種植物乳桿菌st組為對照。密封玻璃瓶，37℃發(fā)酵15d。瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成茶磚。采用酒石酸亞鐵分光光度法檢測茶多酚重量，hplc方法檢測兒茶素類含量。檢測結(jié)果如表4所示，與自然發(fā)酵酸茶相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的茶多酚總量無顯著變化，兒茶素總量提高了30.8％(p<0.05)，egc含量增加了70％(p<0.05)，ec含量增加了78.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量無顯著變化，egcg含量降低了39.8％(p<0.05)，egc含量降低了39.4％(p<0.05)。表4植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶與自然發(fā)酵酸茶茶主要化學(xué)成分比較注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。實例5接種植物乳桿菌st生產(chǎn)酸茶實驗2采摘茶樹鮮葉，用自來水清洗干凈，瀝干表面水分，經(jīng)蒸汽殺青和揉茶，置于無菌玻璃瓶內(nèi)，按茶鮮葉重量的0.02％稱取植物乳桿菌st凍干菌粉，用少量無菌水混合后，均勻噴灑到茶葉表面，壓緊茶鮮葉，不接種植物乳桿菌st組為對照。密封玻璃瓶，37℃發(fā)酵15d。瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成茶磚。采用酒石酸亞鐵分光光度法檢測茶多酚重量，hplc方法檢測兒茶素類含量。檢測結(jié)果如表5所示，與自然發(fā)酵酸茶相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的茶多酚總量無顯著變化，兒茶素總量提高了29.8％(p<0.05)，egc含量增加了72.1％(p<0.05)，ec含量增加了75.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量無顯著變化，egcg含量降低了40.9％(p<0.05)，egc含量降低了40.5％(p<0.05)。表5植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶與自然發(fā)酵酸茶茶主要化學(xué)成分比較注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12