本發(fā)明屬于生物環(huán)保技術領域，具體涉及一種新的生活污水高效脫氮菌及其應用。

背景技術：

中國目前有行政村60多萬個，村莊人口有7.6億，其中96％村莊缺乏污水處理系統(tǒng)。農(nóng)村污水基數(shù)大，但受農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展水平和生產(chǎn)、生活方式等發(fā)展水平影響，不同地區(qū)農(nóng)村的污水排放特征差別很大。目前城鎮(zhèn)污水處理廠采用的技術和運行模式不適合用于農(nóng)村分散型污水的處理。隨著國家對農(nóng)村開發(fā)力度加大，諸如農(nóng)家樂、村辦企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)等不斷增多，農(nóng)村污水類型不斷增加，污水中含鹽量、氮磷等含量不斷升高，加之化肥和農(nóng)藥的使用，這增加了污水治理難度。污水無序排放造成地表水、地下水的污染，水庫、池塘和河道等水體變黑，富營養(yǎng)化嚴重，惡臭污染大氣，嚴重影響居住環(huán)境和身心健康。加之，農(nóng)村地區(qū)經(jīng)濟較為落后，高耗能、較高費用的技術很難推廣應用。當前，必需尋找一種成本較低、無二次污染、應用范圍廣和適應性強的技術，且適合在中國農(nóng)村地區(qū)推廣應用。微生物脫氮法與物理、化學法相比較,以它高效率、低成本、無二次污染等不可比擬的優(yōu)點已被人們所認可。本發(fā)明新型高效脫氮菌可直接應用于農(nóng)村生活污水治理中，具有較好的脫氮效果。通過投加該菌，可有效提高對農(nóng)村生活污水中氮的去除效率。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的生活污水高效脫氮菌及其應用。所述生活污水高效脫氮菌是從天津生活污水中分離篩選得到的，該菌可以應用在污水處理中，特別是農(nóng)村生活污水處理中。

本發(fā)明提供的生活污水高效脫氮菌，該菌分類命名為：假單胞菌pseudomonassp.，為新種，于2016年12月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc；地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為：cgmccno.13454。

優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌菌株的16srdna序列如seqidno:1所示，其長度為1498bp。

優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌菌株具有以下表型特征：在30～37℃下，瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～72h后，菌落白色，半透明，圓形，表現(xiàn)光滑，邊緣整齊；菌體短桿狀，0.4×0.8μm～2.0μm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；其生長的溫度為15～42℃，nacl濃度為0％～4％，ph為6～11。

優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌菌株與序列相似的模式菌株進行dan-dna雜交，同源性低于40％。

具體地，所述序列相似的模式菌株為：pseudomonasalcaliphilaal15-21^t、pseudomonastoyotomiensisht-3^t和pseudomonaschengduensismbr^t。

優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌具有硝化反硝化功能。

所述生活污水高效脫氮菌菌株經(jīng)鑒定為假單胞菌屬新種，故分類命名為：假單胞菌pseudomonassp.。

優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌去除氨氮效果為起始氨氮濃度小于500mg/l。

更優(yōu)選地，所述生活污水高效脫氮菌去除氨氮效果為起始氨氮濃度小于100mg/l。此時，脫氮率可達到95％以上。

本發(fā)明提供上述脫氮菌在生活污水凈化中的應用。

特別地，所述污水為農(nóng)村生活污水。

本發(fā)明的生活污水高效脫氮菌為篩選自農(nóng)村生活污水中的土著微生物，將其用于含鹽量高的農(nóng)村生活污水中，其經(jīng)濟效益可觀，將會大大節(jié)約污水處理成本，也不需要考慮菌種的安全性，適合在我國聚集地較為分散的農(nóng)村地區(qū)使用。本發(fā)明生活污水高效脫氮菌具有良好的脫氮效果，通過投加該菌，可有效提高土著微生物對農(nóng)村生活污水中氮的去除效率。本發(fā)明新型高效脫氮菌可直接應用于農(nóng)村生活污水治理中，具有較好的脫氮效果。通過投加該菌，可有效提高對農(nóng)村生活污水中氮的去除效率。

保藏說明

菌種名稱：生活污水高效脫氮菌

分類命名：假單胞菌pseudomonassp.

菌株編號：68

保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機構簡稱：cgmcc

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2016年12月15日

保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13454

附圖說明

圖1為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株菌體形態(tài)電鏡照片。

圖2為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株菌落形態(tài)照片。

圖3為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株與相關種的16srdna序列發(fā)育樹。

圖4為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株脫氮效果。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株的分離鑒定：

(1)培養(yǎng)基：

①硝化脫氮培養(yǎng)基：硫酸銨0.48g，琥珀酸4.71g，微量元素溶液50ml，溶解后用蒸餾水定容至1l，ph控制在7.0～7.2。(固體培養(yǎng)基，加入2％瓊脂)

所述微量元素溶液：k2hpo4·3h2o6.5g，mgso4·7h2o2.5g，nacl2.5g，feso4·7h2o0.05g，mnso4·h2o0.04g，溶解后用蒸餾水定容至1l；

②反硝化脫氮培養(yǎng)基：好氧反硝化培養(yǎng)基：kno30.36g，na2hpo4·7h2o7.9g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o0.1g，琥珀酸鈉2.81g，微量元素溶液2ml，溶解后用蒸餾水定容至1l，ph7.0～7.5。微量元素溶液：edta50.0g，znso42.2g，cacl25.5g，mncl2·4h2o5.06g，feso4·7h2o5.0g，cuso4·5h2o1.57g，cocl2·6h2o1.61g，溶解后用蒸餾水定容至1l，ph7.0。

(2)硝化菌株的分離篩選

用無菌移液管取10ml天津生活污水，置于容量為250ml的三角瓶(其中含有100ml無菌脫氮培養(yǎng)基)中，搖床富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃，轉(zhuǎn)速160rpm，每一代培養(yǎng)三天。采用二苯胺試劑檢測氨氧化菌的存在。

采用極限稀釋的方法將含有硝酸菌的培養(yǎng)液進行平板涂布，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，選取單一菌落進行多次平板分區(qū)劃線。在顯微鏡下觀察無雜菌時，菌株純化結束。

將純化好的10％的菌株接種于100ml新鮮液體硝化培養(yǎng)基中，30℃、120rpm搖床培養(yǎng)48h后，測定氨氮去除率，選取氨氮去除率高于85％的菌株作為選到的硝化脫氮菌。

(3)反硝化菌株的篩選

將10％的接種量接種于100ml新鮮液體反硝化培養(yǎng)基中，30℃、120rpm搖床培養(yǎng)48h后，測定硝酸鹽氮去除率，選取去除率高于90％的菌株作為選到的反硝化脫氮菌。

圖1為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株菌體形態(tài)電鏡照片。圖2為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株菌落形態(tài)照片。由圖1和圖2可見，所述菌株具有以下表型特征：在30～37℃下，瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～72h后，菌落白色，半透明，圓形，表現(xiàn)光滑，邊緣整齊；菌體短桿狀，0.4×0.8μm～2.0μm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；其生長的溫度為15～42℃，nacl濃度為0％～4％，ph為6～11。

(4)16srdna序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過16srdna的pcr擴增與測序，得到16srdna基因序列長度為1498bp(參見seqidno:1)。提交genbank進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明生活污水高效脫氮菌屬于假單胞菌(pseudomonassp.)。采用mega5.0軟件，鄰位連接法顯示該菌株與相關種的16srdna序列發(fā)育樹，進行1000次的相似度重復計算，圖3中發(fā)育樹節(jié)點只顯示bootstrap值大于50％數(shù)值(參見圖3。圖3為本發(fā)明菌株與相關種的16srdna序列發(fā)育樹)。

(5)微生物菌種dan-dna雜交

本發(fā)明生活污水高效脫氮菌與序列相似的模式菌株進行dan-dna雜交，同源性低于40％。具體地，本發(fā)明生活污水高效脫氮菌與pseudomonasalcaliphilaal15-21^t的雜交同源性為35.4％，本發(fā)明生活污水高效脫氮菌與pseudomonastoyotomiensisht-3^t的雜交同源性為33.3％，本發(fā)明生活污水高效脫氮菌與pseudomonaschengduensismbr^t的雜交同源性35.4％。

實施例2脫氮效果實驗

將本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株接種于100ml不同氮含量的脫氮培養(yǎng)基中，起始氨氮濃度分別為50mg/l，未接菌種的培養(yǎng)基為空白對照，37℃，轉(zhuǎn)速為160rpm，搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)30h。取培養(yǎng)液分別在10000rpm下離心6分鐘，經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾，測定培養(yǎng)液中的氨氮(ammonianitrogen)、硝氮(nitratenitrogen)、亞硝酸鹽氮(nitritenitrogen)、以及總氮(totalnitrogen)的含量。具體測定結果見圖4。圖4為本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌株脫氮效果。

由圖4可以看出，起始氨氮濃度為50mg/l,去除率可以達到100％。且亞硝酸氮累計均較少，說明本發(fā)明菌株具有較好的硝化反硝化功能。起始氨氮濃度小于500mg/l的范圍均可發(fā)揮脫氮功能，且起始氨氮濃度小于100mg/l時，效果最佳。

實施例3農(nóng)村生活污水降解實驗

將本發(fā)明生活污水高效脫氮菌菌液直接投加到格柵過濾后的的實際農(nóng)村生活污水中，接種量為10％體積。培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速度為180rpm。結果：處理3天后，水體中總氮的去除率可達到80％。

sequencelisting

<110>農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所

<120>一種新的生活污水高效脫氮菌及其應用

<130>y161366-oi

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1498

<212>dna

<213>假單胞菌（pseudomonassp.）

<400>1

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