本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一株有機氮類污染物降解菌劑------索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5及其應用。

背景技術：

有機氮化合物廣泛應用于石油、食品和醫(yī)藥工業(yè)，大都是有毒且難降解的有機物，不易受代謝過程的破壞，屬于污染面廣的難降解有機物，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康會產生潛在的長期危害。目前有機氮化合物（包括吡啶、喹啉、吡咯、咔唑及其衍生物等）被廣泛用于石油、焦化、制藥、染料和橡膠合成過程，隨生產廢水進入環(huán)境。其中吡啶和喹啉是典型的含氮雜環(huán)化合物，而且也是重要的工業(yè)污染物。吡啶對不同生物體表現(xiàn)出廣泛的毒性，具有致畸變特性和毒性，對健康具有潛在的危害性，吡啶美國環(huán)境保護署（unitedstatesenvironmentalprotectionagency，usepa）列為優(yōu)先控制物質之一。

2-氯-5-氯甲基吡啶（2-chloro-chloromethylpyridine，簡稱ccmp）是新型高效農藥吡蟲啉的關鍵中間體，也是這一類農藥分子中最具殺蟲活性的部分，而且通過它的烷基化反應、與雜環(huán)n-h的縮合反應以及氨化后與1-硝基-2，2-雙(硫甲基)乙烯的反應，還可制備一系列新的殺蟲殺螨劑，是合成農藥和醫(yī)藥的重要中間體。2-氯-5-氯甲基吡啶具有較強的致敏性和刺激性，隨吡蟲啉生產廢水進入環(huán)境會對生態(tài)和人體健康造成嚴重危害。微生物降解具有成本低、效率高、無二次污染、生態(tài)恢復性好等優(yōu)點，已在很多方面得到應用，所以篩選出ccmp降解菌對于處理吡蟲啉生產廢水具有重大意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一株有機氮類污染物降解菌劑-索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5，及其在降解含氮雜化化合物中的應用。

本發(fā)明提供的索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5，該菌株已于2017年5月15日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏號為cgmccno.14161。所述索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5是一株革蘭氏染色陽性菌，短桿狀，氧化酶陰性，氯化鈉耐受濃度為3%，能夠厭氧生長，生長溫度范圍為15℃-55℃。

所述的有機氮類污染物降解菌在降解有機氮類污染物中的應用

所述索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5在降解2-氯-5-氯甲基吡啶（ccmp）中應用。

含有所述索諾拉沙漠芽孢桿菌dx-5的菌劑，菌劑濃度為2.5-5.0×10⁸cfu/ml。

所述索諾拉沙漠芽孢桿菌dx-5菌劑的生產方法，包括：斜面種－搖瓶種－種子罐－生產罐－產品，所述產品的包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。

所述菌劑的生產方法，具體為：

1）將索諾拉沙漠芽孢桿菌dx-5的試管種接種于添加ccmp的lb培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；

2）將步驟1）培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即種子液；

3）將步驟2）所述種子液按10％的接種量接入生產罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，生產罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑；

步驟3）所述菌劑直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。

步驟1）中所述的lb培養(yǎng)基配方為：nacl10.00g/l,蛋白胨10.00g/l,酵母粉5.00g/l,ccmp100mg/l，ph7.0。

步驟2）所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為：ccmp100mg/l，葡萄糖8g/l，（nh4）2so41g/l，k2hpo42g/l，mgso40.5g/l，nacl1g/l%，caco30.5g/l，酵母膏2g/l，ph值7.2-7.5。

步驟2）所述種子罐和步驟3）所述的生產罐的培養(yǎng)過程中，無菌空氣的通氣量為1：0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，步驟2）和3）的整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時。

有益效果：

本發(fā)明提供的索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5可以在24h內降解100mg/lccmp。將其應用于吡蟲啉生產廢水中可有效提高廢水的可生化性（b/c比），在接種的24h內，吡蟲啉生產廢水的b/c比可從0.09上升至0.58。

附圖說明

圖1索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5在lb固體培養(yǎng)基生長的菌落照片；

圖2索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5利用ccmp的生長降解曲線；

圖3不同溫度索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5降解ccmp的降解情況；

圖4不同ph對索諾拉沙漠芽孢桿菌（bacillussonorensis）dx-5降解ccmp的影響；

圖5dx-5菌劑對吡蟲啉生產廢水的降解效果。

具體實施方式

實施例1ccmp降解菌dx-5的篩選及分離

取從生產吡蟲啉的某農藥廠生產車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0ml加入100mlccmp濃度為100mg/l的含有吡啶的無機鹽培養(yǎng)基中，其配方為：每升含100mg/lccmp，1.50gk2hpo4，0.50gkh2po4，0.20gmgso4×7h2o、1.00gnacl，1.00g(nh4)2so4，ph7.0。于160r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24h按5%的接種量轉接到新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉接5次。

取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml無菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml無菌水中，充分混勻配成10^-2的富集液，以此類推，對富集液進行梯度稀釋。以此類推，對富集液進行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含ccmp的濃度為100mg/l無機鹽固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h。24h后從以上的無機鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0ml的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，lb液體培養(yǎng)基配方為：nacl10.00g/l,蛋白胨10.00g/l,酵母粉5.00g/l,ph7.0于8000r/min的條件下離心2min，倒去上清液，加入3.0ml的無菌水搖勻，仍于8000r/min的條件下離心2min，按此方法用無菌水洗兩遍后，加入3.0ml無菌水重懸該菌。吸取1.0ml該菌液加入100mlccmp濃度為100mg/l的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于160r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)24h后，用高效液相色譜測其降解效果。通過上述方法篩選到一株對ccmp降解率最高的菌株，命名為dx-5，dx-5在lb固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為，淡黃色，表面光滑（見附圖1）。利用高鹽法提取ccmp降解菌株dx-5的基因組，利用16s通用引物pcr獲得16srdna序列，由南京金斯瑞測序公司獲得序列信息，在ncbi上利用blast在genbank中與其他的16srdna序列進行同源性比較，同時通過構建系統(tǒng)進化樹將菌株鑒定為dx-5為索諾拉沙漠芽孢桿菌。

實施例2菌株dx-5以ccmp為碳源生長及對ccmp的降解作用

將dx-5單菌落接種于20ml液體lb培養(yǎng)基（nacl10.00g/l,蛋白胨10.00g/l,酵母粉5.00g/l,ccmp100mg/l，ph7.0）中，于160r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)至od600=1.0，在含100mg/lccmp的無機鹽培養(yǎng)基（每升含100mg/lccmp，1.50gk2hpo4，0.50gkh2po4，0.20gmgso4×7h2o、1.00gnacl，1.00g(nh4)2so4，ph7.0）中，按5%的接種量接種dx-5，于30℃振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣測定600nm處的吸光度以及ccmp濃度。由圖2可以看出，菌株dx-5可以在24h內完全降解濃度為100mg/l的ccmp，同時菌株生長量明顯，od600由接種時的0.05增加至0.6左右。

實施例3索諾拉沙漠芽孢桿菌dx-5的搖瓶降解實驗

3.1溫度對dx-5降解效率的影響

在含100mg/lccmp的無機鹽培養(yǎng)基中，其配方為：每升含100mg/lccmp，1.50gk2hpo4、0.50gkh2po4、0.20gmgso4×7h2o、1.00gnacl、1.00g(nh4)2so4，ph7.0，置于溫度分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的搖床培養(yǎng)，24小時取樣測定ccmp濃度，結果見圖3。結果由圖3可以看出，菌株降解ccmp的最適溫度為30℃；當溫度范圍為25-35℃范圍內，菌株對ccmp的降解率均可超過80%。

3.2ph對dx-5降解效率的影響

ph值是影響微生物生長和生存的另一個重要環(huán)境因素，微生物生長有一個適宜的ph值范圍，超過適宜生長的ph值范圍，大多數(shù)微生物都不能很好人的生長。

在含100mg/lccmp的無機鹽培養(yǎng)基中，其配方為：每升含100mg/lccmp，1.50gk2hpo4、0.50gkh2po4、0.20gmgso4×7h2o、1.00gnacl、1.00g(nh4)2so4，ph7.0，按5%的接種量接種dx-5于培養(yǎng)液中，ph值分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0，于30℃振蕩培養(yǎng)，24小時取樣測定。結果由圖4可以看出，ph過高或過低都會影響dx-5對ccmp的降解，最優(yōu)ph范圍為7。

實施例4dx-5菌劑在吡蟲啉生產廢水處理中的應用

dx-5菌劑的制備：

1）將索諾拉沙漠芽孢桿菌dx-5接種于添加ccmp的lb培養(yǎng)基（nacl10.00g/l,蛋白胨10.00g/l,酵母粉5.00g/l，2-氯-5氯-甲基吡啶100mg/l，ph7.0）中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；

2）將步驟1）培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入種子罐（2-氯-5氯-甲基吡啶100mg/l，葡萄糖8g/l，（nh4）2so41g/l，k2hpo42g/l，mgso40.5g/l，nacl1g/l%，caco30.5g/l，酵母膏2g/l，ph值7.2-7.5），培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即種子液；

3）將步驟2）所述種子液按10％的接種量接入生產罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，生產罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，無菌空氣的通氣量為1：0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，步驟2）和步驟3）的整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑；所述菌劑直接分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。

將dx-5菌劑投加至裝有100ml吡蟲啉生產廢水的250ml三角瓶中，調ph為6-7，按1%的接種量接種dx-5菌劑，每隔2h取樣監(jiān)測ccmp濃度以及廢水的可生化性。由圖5可以看出，在接種的24h內，吡蟲啉生產廢水的b/c比可從0.09上升至0.58。