本發(fā)明涉及病原菌的快速檢測方法技術領域，尤其是涉及一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清13型的方法。

背景技術：

副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis,hps)是一種重要的豬呼吸道病原菌，目前已至少鑒定出15個血清型，不同血清型菌株之間存在高毒力、中等毒力和無毒力等顯著差異，鑒定hps血清型對該病的診斷和防治具有重要意義。hps血清13型是高毒力菌株，又是我國目前流行最多、分布范圍最廣的血清型之一。目前該菌常規(guī)血清型鑒定方法為細菌分離培養(yǎng)和鑒定的基礎上，通過瓊脂擴散試驗與hps所有血清型的陽性血清進行反應來判定血清型，通常需要3-5天的時間，費時費力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準確鑒定出血清型，嚴重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測。

環(huán)介導等溫擴增技術(lamp，國際專利公開號wo00/28082)是2000年notomi等開發(fā)出的一種核酸擴增新技術，即針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物(如需要還可以添加環(huán)引物對)，利用一種鏈置換dna聚合酶(bstdnapolymerase)在65℃左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應，擴增結果可通過凝膠電泳進行檢測。用于lamp技術擴增的2對引物是針對靶基因序列的6個區(qū)段，因而具有比pcr更高的特異性，同時也具備不需要熱循環(huán)、擴增效率更高、不需要特殊儀器等優(yōu)點。

副豬嗜血桿菌感染的流行病學研究主要利用血清學分型方法開展，即在hps分離培養(yǎng)和鑒定的基礎上，通過瓊脂擴散試驗與hps所有血清型的陽性血清進行反應來判定血清型，通常需要3-5天的時間，費時費力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準確鑒定出血清型，嚴重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術目的是建立一種簡便、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度的hps血清13型lamp檢測方法。

為快速準確地鑒定hps血清13型，本發(fā)明參考genbank發(fā)表的副豬嗜血桿菌血清13型ia-84-17975菌株的糖脂轉(zhuǎn)移蛋白(glycolipidtransferproteingene，gltp)基因序列(登錄號kc795500.1)，運用引物設計軟件primerexplorer4.0，在線進行l(wèi)amp引物設計。按照引物設計原則，針對其6個特定區(qū)域設計4條引物：兩條外引物分別為上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；兩條內(nèi)引物分別為上游內(nèi)引物(fip)和下游內(nèi)引物(bip)，fip由f1的互補序列和正向序列f2構成，bip由b1的互補序列和正向序列b2構成，靶基因片段即為上游外引物f3與下游外引物b3之間的基因序列。依據(jù)primerexplorer4.0設計的引物，可獲得多個靶基因片段，然后運用blast進行序列比對，篩選出gltp基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，此gltp基因特異性片段經(jīng)lamp方法擴增，僅在恒溫條件下(62℃)反應60分鐘，即可將目的dna從幾個拷貝擴增到10⁹個拷貝，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物來判定結果。故而可作為一種運用lamp技術快速檢測hps血清13型方法的分子標記使用。

在此基礎上，本發(fā)明進一步提供一組環(huán)介導等溫擴增引物，其可特異性環(huán)介導等溫擴增所述的分子標記。根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，所述引物組包括上游外引物f3和下游外引物b3，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示；以及上游內(nèi)引物fip和下游內(nèi)引物bip，其核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

更進一步，本發(fā)明提供一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清13型的方法，以待測樣品細胞基因組dna為模板，利用權利要求3或4所述的特異性引物組進行環(huán)介導等溫擴增反應。所述待測樣品細胞基因組dna可以將待測樣品經(jīng)常規(guī)細菌培養(yǎng)后提取細菌基因組dna。

所述的方法，還包括步驟：設置陰性對照模板和陽性對照模板，陰性對照模板為超純水，陽性對照模板為hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna；利用凝膠電泳對環(huán)介導等溫擴增產(chǎn)物進行檢測，電泳結果出現(xiàn)特征性梯度狀電泳條帶判定為陽性，若無任何擴增產(chǎn)物則為陰性。

優(yōu)選的，所述環(huán)介導等溫擴增反應的反應體系包括：10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；用滅菌超純水補足體系至25μl；

其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

所述環(huán)介導等溫擴增反應的反應條件如下：95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應60min，最后80℃反應10min終止反應。

所述方法中使用的試劑優(yōu)選制作為快速檢測副豬嗜血桿菌血清13型的試劑盒，包括所述特異性引物組。

優(yōu)選的包括：

10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；使用時用滅菌超純水補足體系至25μl；

其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

本發(fā)明通過提供一種副豬嗜血桿菌血清13型的特異性基因片段及具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測樣品中是否存在副豬嗜血桿菌血清13型特異性基因片段進而確定樣品是否為副豬嗜血桿菌血清13型。本發(fā)明檢測試劑和檢測方法具有敏感性高(對hps血清13型基因組dna的檢測敏感度為2.5pg，對hps血清13型菌液的檢測敏感度為20cfu/ml)、特異性強(僅檢測hps血清13型參考菌株和分離菌株為陽性，而對hps其它血清型參考和分離菌株、以及其它種屬的細菌檢測均為陰性)、方便快捷(整個檢測在3小時內(nèi)完成，與現(xiàn)有的瓊脂擴散試驗檢測血清型相比省時2-3天)、不需要特殊儀器(在恒溫水浴鍋中就可反應)、適用范圍廣(適用于獸醫(yī)科研檢測實驗室、檢驗檢疫部門、養(yǎng)殖企業(yè)等)等優(yōu)點，可解決副豬嗜血桿菌血清13型的現(xiàn)場快速檢測和基層普及應用的難題。

附圖說明

圖1：lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性結果，其中m：dl2000dnamarker；1-18孔所用模板對應的菌株與表3中的菌株序號一致，其中15孔出現(xiàn)陽性條帶，為hps血清13型參考菌株hs1079。

圖2：lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性結果，其中m：dl2000dnamarker；1-19孔所用模板對應的菌株與表4中的菌株序號一致，20孔為hps血清13型參考菌株hs1079作為陽性對照。

圖3：lamp檢測hps血清13型基因組dna的敏感性結果，其中m：dl2000dnamarker；模板dna的量分別標注于泳道上面，檢測結果顯示本發(fā)明的檢測限為2.5pg。

圖4：lamp檢測hps血清13型菌液的敏感性結果，其中m：dl2000dnamarker；泳道上面的標注為菌液的稀釋度，檢測結果顯示本發(fā)明的檢測限0.5個菌，敏感性為0.02cfu/μl(20cfu/ml)。

圖5：lamp檢測臨床分離hps菌株結果，其中m：dl2000；1-22孔所用模板對應的菌株與表5中的菌株序號一致，結果顯示只有孔道18、19、20、21、22這5株hps血清13型菌株出現(xiàn)典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性。

圖6：lamp反應中dntps濃度的優(yōu)化結果。

圖7：lamp反應中bstdna聚合酶用量的優(yōu)化結果。

圖8：lamp反應中mg²⁺濃度的優(yōu)化結果。

圖9：lamp反應中betaine濃度的優(yōu)化結果。

圖10：lamp反應中反應溫度的優(yōu)化結果。

圖11：lamp反應中反應時間的優(yōu)化結果。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1lamp引物的設計和合成

參考genbank發(fā)表的副豬嗜血桿菌血清13型ia-84-17975菌株的糖脂轉(zhuǎn)移蛋白(glycolipidtransferproteingene，gltp)基因序列(登錄號kc795500.1)，運用引物設計軟件primerexplorer4.0，在線進行l(wèi)amp引物設計。按照引物設計原則，針對其6個特定區(qū)域設計4條引物：兩條外引物分別為上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；兩條內(nèi)引物分別為上游內(nèi)引物(fip)和下游內(nèi)引物(bip)，fip由f1的互補序列和正向序列f2構成，bip由b1的互補序列和正向序列b2構成，靶基因片段即為上游外引物f3與下游外引物b3之間的基因序列。依據(jù)primerexplorer4.0設計的引物，可獲得多個靶基因片段，然后運用blast進行序列比對，篩選出gltp基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名稱和序列見表1。

表1lamp所用引物名稱及序列

實施例2用作模板的hps細菌基因組dna提取

取分離培養(yǎng)的hps菌株，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌后，離心取上清液1.0μl用于lamp反應模板。

實施例3lamp反應體系的建立

lamp反應體系總量為25μl，反應組分見表2。

表2lamp反應體系的組分及添加量

lamp反應在pcr儀中進行，首先95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應60min，最后80℃反應10min終止反應。利用瓊脂糖凝膠電泳對lamp擴增產(chǎn)物進行檢測，電泳結果出現(xiàn)特征性梯度狀電泳條帶判定為陽性，若無任何擴增產(chǎn)物則為陰性。

實施例4lamp反應體系中主要影響因子的篩選和優(yōu)化

對lamp反應體系中主要影響因子如dntps濃度、bstdna聚合酶用量、鎂離子濃度、betaine濃度、反應溫度、反應時間等分別篩選優(yōu)化的基礎上建立本發(fā)明lamp反應體系。

(1)dntps濃度的優(yōu)化

反應體系中dntps的濃度依次為0.4mmol/l、0.8mmol/l、1.2mmol/l、1.6mmol/l、2.0mmol/l、2.4mmol/l、2.8mmol/l，從而確定dntps最小的適宜添加濃度。結果如圖6所示，dntps濃度在0.8mmol/l～2.8mmol/l時均出現(xiàn)梯形條帶，當濃度處于2.4～2.8mmol/l時擴增條帶較亮。

(2)bstdna聚合酶用量的優(yōu)化

反應體系中bstdna聚合酶以0.5μl、0.7μl、0.9μl、1.1μl、1.3μl、1.5μl的用量依次加入，從而在節(jié)約的原則下確定bstdna聚合酶的最佳用量。結果如圖7所示，bstdna聚合酶加入量在0.5μl～1.5μl范圍內(nèi)均能產(chǎn)生梯形條帶，且0.7μl～1.3μl范圍內(nèi)的酶加入量反應條帶較亮，因此從較經(jīng)濟的角度認為0.7μlbstdna聚合酶為最佳添加量。

(3)鎂離子濃度的優(yōu)化

向反應體系中單獨加入mg²⁺的濃度依次為0.0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、4.0mmol/l，在這幾個梯度濃度中優(yōu)化出適宜的mg²⁺濃度。結果如圖8所示，反應體系中添加mg²⁺濃度為0～4.0mmol/l時，均能擴增出梯形條帶，mg²⁺添加濃度為1.5～3.0mmol/l時條帶較亮。(4)betaine(甜菜堿)濃度的優(yōu)化

向反應體系中加入betaine的濃度依次為0.0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.4mol/l、0.8mol/l、1.6mol/l，在這幾個梯度濃度中優(yōu)化出適宜的betaine濃度。結果如圖9所示，反應體系中添加betaine濃度為0或高濃度1.6mol/l時無梯形條帶產(chǎn)生，0.1～0.8mol/l時均能擴增出梯形條帶，其中以0.4～0.8mol/l時擴增梯形條帶較亮。(5)反應溫度的優(yōu)化

為了分析溫度對lamp試驗的影響，設計梯度溫度依次為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，其他反應條件不變，在這幾個反應溫度中優(yōu)化出適宜溫度。結果如圖10所示，60.0～61.0℃時無梯形條帶，61.0～65.0℃下均能擴增出梯形條帶，而以62℃條件下擴增產(chǎn)物較亮。

(6)反應時間的優(yōu)化

反應體系相同，按30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min不同時間進行l(wèi)amp擴增，從而確定出適宜的反應時間。結果如圖11所示，反應時間為30min時無梯形條帶產(chǎn)生，35～65min范圍內(nèi)均可產(chǎn)生梯形條帶，且60-65min時擴增條帶較亮。

實施例5具體檢測方法的建立

(1)細菌培養(yǎng)。取擬鑒定血清型的hps分離菌株，接種于5ml添加終濃度100μg/ml煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。

(2)細菌基因組dna的提取。取過夜培養(yǎng)的菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌后，離心取上清液1.0μl作為lamp反應模板。

(3)hps分離株的lamp檢測。按照表2中的lamp反應體系將除bstdna聚合酶外的其它組分加入0.2ml反應管中，放入pcr儀中，95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反應60min，最后80℃反應10min終止反應。同時設置陰性對照和陽性對照。

(4)lamp擴增產(chǎn)物的電泳檢測。利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測：取9μllamp擴增產(chǎn)物加1μl10×上樣緩沖液混勻，以dl2000dnamarker作為相對分子量標準，用含核酸染色劑的1.5％瓊脂糖凝膠在100v電壓下電泳約30min，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析結果。電泳圖片顯示lamp特征性梯度狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶則結果為陰性。

實施例6特異性實驗

取甘油保存的hps不同血清型菌株，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。針對用于鑒定lamp菌種間特異性試驗所用的其它種屬細菌菌株，同樣取適量甘油保存的相應菌株，劃線培養(yǎng)于tsa平板，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5mltsb培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。利用promega公司的細菌全基因組dna提取試劑盒抽提細菌基因組dna，操作步驟簡述為：取2ml培養(yǎng)12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄凈上清，留取菌體沉淀；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉淀重懸；80℃培養(yǎng)5min，使菌體裂解，然后使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養(yǎng)30min，并冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉(zhuǎn)移至一個干凈的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現(xiàn)線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，并用干凈的吸水紙將管內(nèi)殘液吸干；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發(fā)；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養(yǎng)1h水化dna，并定期敲打離心管，也可在4℃過夜水化dna；將提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通過凝膠電泳和紫外分光光度計分析其質(zhì)量和濃度。核酸濃度測定：用紫外分光光度計分別測定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計算純度，高質(zhì)量dna的od260/280的值在1.8左右。細菌基因組dna完整性測定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測dna的大小，根據(jù)其亮度和擴散管程度來判斷dna的完整性。

(1)lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性

分別以表3中的18株副豬嗜血桿菌不同血清型的參考菌株基因組dna作為模板，利用優(yōu)化后的lamp反應體系和程序進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定hps血清型特異性。檢測結果見表3和圖1，hps血清13型參考菌株hs1079的孔內(nèi)有明顯的階梯狀條帶，其它血清型孔內(nèi)無條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明的lamp反應體系對hps不同血清型菌株具有高特異性。

(2)lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性

分別以表4中的19株其它種屬細菌菌株基因組dna作為模板，利用優(yōu)化后的lamp反應體系和程序進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定lamp方法對其它種屬細菌的特異性。檢測結果見表4和圖2，hps血清13型參考菌株hs1079的孔內(nèi)有明顯的階梯狀條帶，其它種屬細菌菌株孔內(nèi)無條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明的lamp反應體系對其它種屬細菌菌株具有高特異性。

表3lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性

注：檢測結果中“-”為陰性；“+”為陽性。

表4lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性

注：檢測結果中“-”為陰性。

實施例7敏感性實驗

(1)lamp檢測hps血清13型基因組dna的敏感性

取甘油保存的hps血清13型參考菌株hs1079，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。利用promega公司的細菌全基因組dna提取試劑盒抽提細菌基因組dna，操作步驟簡述為：取2ml培養(yǎng)12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄凈上清，留取菌體沉淀；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉淀重懸；80℃培養(yǎng)5min，使菌體裂解，然后使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養(yǎng)30min，并冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉(zhuǎn)移至一個干凈的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現(xiàn)線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，并用干凈的吸水紙將管內(nèi)殘液吸干；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發(fā)；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養(yǎng)1h水化dna，并定期敲打離心管，也可在4℃過夜水化dna；將提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通過凝膠電泳和紫外分光光度計分析其質(zhì)量和濃度。核酸濃度測定：用紫外分光光度計分別測定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計算純度，高質(zhì)量dna的od260/280的值在1.8左右。細菌基因組dna完整性測定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測dna的大小，根據(jù)其亮度和擴散管程度來判斷dna的完整性。

以濃度為100ng/μl的hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna為初始模板，分別以超純水進行系列稀釋，每個梯度各取1μl加入反應管中，反應體系中細菌基因組dna的量分別為100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、2.5pg、1pg、0.5pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg，以超純水作為陰性對照，擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定敏感性結果。結果如圖3所示，從第8泳道至第14泳道均出現(xiàn)lamp反應典型的階梯狀電泳條帶，而且隨著模板dna濃度的增加，條帶亮度逐漸增強。結果表明，本發(fā)明建立的lamp方法最低限度能檢測到2.5pg的hps血清13型參考菌株hs1079基因組dna，且隨著模板dna濃度的增加，lamp擴增產(chǎn)物量也隨之增多。

(2)lamp檢測hps血清13型菌液的敏感性

取甘油保存的副豬嗜血桿菌13型參考菌株hs1079，劃線培養(yǎng)于添加終濃度100μg/mlnad的tsa平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。自培養(yǎng)平板上挑取單菌落接種于5ml添加終濃度100μg/mlnad的tsb培養(yǎng)基中，于37℃搖床中振搖培養(yǎng)過夜。經(jīng)分光光度計測得菌液濃度od600為0.6，將菌液用超純水倍比稀釋至10^-12，從10^-4、10^-6和10^-8管中各取出100μl分別涂在tsa平板上，過夜培養(yǎng)后計算細菌的菌落數(shù)。同時從每個稀釋度管中取出1μl作為模板dna進行l(wèi)amp擴增，擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定敏感性結果。結果如圖4所示，從第10泳道至第15泳道均有典型的梯狀條帶，最低限度至少能檢測到10^-5。平板計數(shù)結果顯示在10^-6培養(yǎng)基中是50cfu/ml、10^-4培養(yǎng)基中是4000cfu/ml，倍比計算得到10^-5約500cfu/ml，模板取量為1μl，所以該lamp反應檢測的最低含菌量為0.5個菌，即靈敏性為0.02cfu/μl(20cfu/ml)。

實施例8lamp檢測臨床分離hps菌株

取表5中的20株hps臨床分離株(已利用瓊脂擴散試驗鑒定血清型)，分別過夜培養(yǎng)后取菌液1ml，離心后棄上清液，菌沉淀重懸于50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌后，離心取上清液1.0μl用于lamp反應用模板dna。以優(yōu)化后的lamp反應體系及程序進行擴增，核酸電泳觀察lamp擴增結果。lamp檢測結果如圖5所示，在所有hps分離菌株中，只有5株血清13型菌株出現(xiàn)典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性反應，提示本發(fā)明建立的lamp檢測方法可用于臨床hps分離株血清13型的檢測和鑒定。

表5lamp檢測臨床分離hps不同血清型菌株的結果

注：檢測結果中“-”為陰性；“+”為陽性。

序列表

<110>北京市農(nóng)林科學院

<120>一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清13型的方法

<130>p1710106

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtatcgaagttcttctgtgta22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaagtaagataaagccttggat23

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aggaagcccaaaagagattgcgtcttcacgatttgaggga40

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

catttgattgttatatgggacccgcactcaatattttctggttcacat48

<210>5

<211>198

<212>dna

<213>gltp基因片段

<400>5

tgtatcgaagttcttctgtgtattgtatgtcttcacgatttgagggacttccattggtgt60

taattgaagcaatctcttttgggcttcctgttgtttcatttgattgttatatgggacccg120

ctgaaattatcaaaaactcaggaatactatgtgaaccagaaaatattgagtctttatcca180

aggctttatcttactttt198