本發(fā)明涉及多重pcr檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及檢測華北地區(qū)小麥蚜蟲及其寄生蜂的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥蚜蟲是世界性農(nóng)業(yè)害蟲，在我國小麥產(chǎn)區(qū)也廣泛分布，吸食小麥葉片汁液、影響光合作用、傳播小麥病毒病，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降。華北地區(qū)麥田蚜蟲種類有麥長管蚜sitobionavenae(fabricius)，禾谷縊管蚜rhopalosiphumpadi(linnaeus),麥二叉蚜schizaphisgraminum(rondani)，麥無網(wǎng)長管蚜metopolophiumdirhodum(walker)。小麥蚜蟲種群發(fā)生數(shù)量大，每年造成麥田大量減產(chǎn)，百株蚜量逾2000，小麥千粒重減少45％。

小麥蚜蟲寄生蜂群落是麥田生態(tài)系統(tǒng)中生物種群的重要組成部分，也是影響麥蚜種群變化的重要天敵類群之一。田間小麥蚜蟲的寄生率可達(dá)到70-80％，個別田塊甚至達(dá)到90％。因此，我們需要對蚜蟲-寄生蜂食物網(wǎng)關(guān)系和寄生蜂對蚜蟲的控制效率進(jìn)行深入全面的研究。傳統(tǒng)的研究方法包括解剖、飼養(yǎng)出蜂和形態(tài)學(xué)鑒定等，不僅費(fèi)時費(fèi)力，且有時由于蚜蟲和寄生蜂體型微小，很難根據(jù)形態(tài)鑒定特征鑒定到具體的物種。為了準(zhǔn)確評估小麥田寄生蜂對蚜蟲的控制作用，需要建立一套快速準(zhǔn)確的分子檢測方法，但目前未有針對麥田蚜蟲和寄生蜂的系統(tǒng)性標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。多重pcr檢測技術(shù)在pcr檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，可以實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)檢測多個物種的目標(biāo)。所以多重pcr檢測技術(shù)不僅具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在同一反應(yīng)中，同時檢測3-4個物種，不同物種可通過擴(kuò)增出的不同大小的特異性目標(biāo)條帶區(qū)分，大大提高檢測效率，為準(zhǔn)確鑒定物種和評估寄生蜂對蚜蟲的控制作用提供有效手段支撐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂的試劑盒及其應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)對小麥蚜蟲及其寄生蜂的快速檢測，為準(zhǔn)確鑒定物種和評估寄生蜂對蚜蟲的控制作用提供有效幫助。

引物是多重pcr的關(guān)鍵因素，本發(fā)明在設(shè)計(jì)引物時，(1)首先應(yīng)該在保守性高的核苷酸片段中選擇特異性較高的引物，但本發(fā)明設(shè)計(jì)引物的同時，不僅考慮了每種目標(biāo)物種之間的高度保守區(qū)，而且還必需保證每段高度保守區(qū)之間的特異性，這樣不同的目標(biāo)物種才易區(qū)分開。(2)避免引物之間形成二級結(jié)構(gòu)，例如自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)、上下游引物之間或者是引物與探針之間形成二聚體，同時引物避免與靶基因錯配，如果一個引物與靶基因多個地方結(jié)合，會造成非特異性片段出現(xiàn)。(3)引物的3’端必需保持高度保守，在退火過程中，引物的3’端是開始延伸的地方，這樣才能進(jìn)行最大效率的復(fù)制。(4)tm值為設(shè)計(jì)引物的重要決定因素，為引物的最佳退火溫度提供參考數(shù)據(jù)，上下游引物的tm值應(yīng)可能的接近，同時考慮到所有上下游引物tm值最多不能超過10℃，為多重pcr做準(zhǔn)備。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)線粒體dna序列，設(shè)計(jì)篩選得到16對分別針對小麥蚜蟲及其寄生蜂特異性引物，如表1。除一般的引物設(shè)計(jì)原則外，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)篩選引物：(1)擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100bp-500bp之間；(2)多重pcr檢測體系結(jié)果中，不同擴(kuò)增產(chǎn)物大小相差5bp以上。

表1引物序列信息

由此，本發(fā)明首先提供了一種同時檢測4種小麥蚜蟲的特異性引物對組合，含有以下引物對：

用于檢測麥無網(wǎng)長管蚜【metopolophiumdirhodum(walker)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.1-2所示；

用于檢測麥長管蚜【(sitobionavenae(fabricius)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.3-4所示；

用于檢測麥二叉蚜【(schizaphisgraminum(rondani)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.5-6所示；

用于檢測禾谷縊管蚜【(rhopalosiphumpadi(linnaeus)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.7-8所示。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對組合在制備小麥蚜蟲檢測試劑盒中的用途。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂的特異性引物對組合，含有以下引物對：

用于檢測麥無網(wǎng)長管蚜【metopolophiumdirhodum(walker)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.1-2所示；

用于檢測麥長管蚜【(sitobionavenae(fabricius)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.3-4所示；

用于檢測麥二叉蚜【(schizaphisgraminum(rondani)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.5-6所示；

用于檢測禾谷縊管蚜【(rhopalosiphumpadi(linnaeus)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.7-8所示；

用于檢測翼蚜外蚜繭蜂(paronvolucrehaliday)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.9-10所示；

用于檢測烏茲別克蚜繭蜂(aphidiusuzbekistanicusluzhetski)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.11-12所示；

用于檢測阿爾蚜繭蜂(aphidiuservihaliday)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.13-14所示；

用于檢測煙蚜繭蜂【aphidiusgifuensis(ashmead)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.15-16所示；

用于檢測脊柄金小蜂屬(asaphes)的通用引物對的核苷酸序列如seqidno.17-18所示；

用于檢測蚜蟲寬緣金小蜂【pachyneuronaphidis(bouché)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.19-20所示；

用于檢測【phaenoglyphisvillosa(hartig)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.21-22所示；

用于檢測alloxystasp1的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.23-24所示；

用于檢測alloxystasp2的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.25-26所示；

用于檢測alloxystasp3的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.27-28所示；

用于檢測合溝細(xì)蜂【dendroceruscarpenteri(curtis)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.29-30所示；

用于檢測黃足分盾細(xì)蜂【dendroceruslaticeps(hedicke)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.31-32所示。

本發(fā)明所述的脊柄金小蜂屬asaphes包括寬肩阿莎金小蜂【asaphessuspensus(nees)】和蚜繭蜂金小蜂(asaphesvulgariswalker)。

本發(fā)明還提供一種檢測試劑盒，含有上述特異性引物對組合，且所述特異性引物對組合構(gòu)成3個多重pcr檢測體系和5個單重pcr檢測體系，其中：第1個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.1-8所示；第2個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.9-16所示；第3個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.17-22所示；

5個單重pcr檢測體系所用的特異性引物序列分別如seqidno.23-32所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的上述試劑盒還包括multiplexmastermix，ddh2o，牛血清蛋白溶液(bsa，10μg/μl)、四甲基氯化銨(tmac，5m)、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明的試劑盒，其工作程序包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的核酸；

(2)以步驟(1)的核酸為模板，分別進(jìn)行3個多重pcr和5個單重pcr；

(3)分析pcr產(chǎn)物；

第1個多重pcr檢測體系中：

若pcr產(chǎn)物片段為97bp，則為麥無網(wǎng)長管蚜；

若pcr產(chǎn)物片段為156bp，則為麥長管蚜；

若pcr產(chǎn)物片段為296bp，則為麥二叉蚜；

若pcr產(chǎn)物片段為395bp，則為禾谷縊管蚜；

第2個多重pcr檢測體系中：

若pcr產(chǎn)物片段為185bp，則為翼蚜外蚜繭蜂；

若pcr產(chǎn)物片段為246bp，則為烏茲別克蚜繭蜂；

若pcr產(chǎn)物片段為433bp，則為阿爾蚜繭蜂；

若pcr產(chǎn)物片段為554bp，則為煙蚜繭蜂；

第3個多重pcr檢測體系中：

若pcr產(chǎn)物片段為173bp，則為脊柄金小蜂屬；

若pcr產(chǎn)物片段為328bp，則為蚜蟲寬緣金小蜂；

若pcr產(chǎn)物片段為413bp，則為phaenoglyphisvillosa；

5個單重pcr檢測體系中：

若pcr產(chǎn)物片段為244bp，則為alloxystasp1；

若pcr產(chǎn)物片段為193bp，則為alloxystasp2；

若pcr產(chǎn)物片段為223bp，則為alloxystasp3；

若pcr產(chǎn)物片段為100bp，則為合溝細(xì)蜂；

若pcr產(chǎn)物片段為137bp，則為黃足分盾細(xì)蜂。

所述多重pcr反應(yīng)，其工作體系為：

所述mp1為第1個多重pcr，mp2為第2個多重pcr，mp3為第3個多重pcr。

進(jìn)一步地，本發(fā)明試劑盒的5個單重pcr體系試劑組分皆為ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；10μm的上下游引物各1.0μl，dna模板，1.5μl。

本發(fā)明試劑盒pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，退火溫度退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃后延伸10分鐘；各體系退火溫度為：

mp1-mp3分別為第1-3個多重pcr；sp1-sp5分別為第1-5個單重pcr。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對組合或含有該特異性引物對組合的試劑盒在檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明根據(jù)genbank中公布的基因序列(accessionno.見下表2)，設(shè)計(jì)一系列特異性引物，而這些引物僅對目標(biāo)物種有擴(kuò)增效果，對麥田其它蚜蟲和寄生蜂無擴(kuò)增能力，產(chǎn)物片段大小和靈敏度dna濃度檢出限見表2。

表2目標(biāo)物種對應(yīng)genbank序列號、片段大小及dna濃度檢出限

本發(fā)明在小麥蚜蟲、寄生蜂檢測方面具有很高的價值，通過三次多重pcr和五次單重pcr能夠?qū)?種小麥蚜蟲及其12種寄生蜂實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，耗時短、簡便快速的優(yōu)點(diǎn)，特別是在檢測大量樣品時，大大縮短檢測時間和降低人力，提高檢測效率，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中mp1混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2麥無網(wǎng)長管蚜,3,4麥長管蚜,5,6麥二叉蚜,7,8禾谷縊管蚜,9,10翼蚜外蚜繭蜂,11,12烏茲別克蚜繭蜂,13,14阿爾蚜繭蜂,15,16煙蚜繭蜂,17,18寬肩阿莎金小蜂,19,20蚜繭蜂金小蜂,21,22蚜蟲寬緣金小蜂,23,24phaenoglyphisvillosa,25,26alloxystasp.,27,28蚜蟲跳小蜂,29,30syrphophaguseliavae,31,32syrphophagussp.,33,34syrphophagustaeniatus,35,36合溝細(xì)蜂,37,38黃足分盾細(xì)蜂，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中mp2混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2翼蚜外蚜繭蜂,3,4烏茲別克蚜繭蜂,5,6阿爾蚜繭蜂,7,8煙蚜繭蜂,9,10寬肩阿莎金小蜂,11,12蚜繭蜂金小蜂,13,14蚜蟲寬緣金小蜂,15,16phaenoglyphisvillosa,17,18alloxystasp.,19,20蚜蟲跳小蜂,21,22syrphophaguseliavae,23,24syrphophagussp.,25,26syrphophagustaeniatus,27,28合溝細(xì)蜂,29,30黃足分盾細(xì)蜂,31,32麥無網(wǎng)長管蚜,33,34麥長管蚜,35,36麥二叉蚜,37,38禾谷縊管蚜，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中mp3混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2寬肩阿莎金小蜂,3,4蚜繭蜂金小蜂,5,6蚜蟲寬緣金小蜂,7,8phaenoglyphisvillosa,9,10翼蚜外蚜繭蜂,11,12烏茲別克蚜繭蜂,13,14阿爾蚜繭蜂,15,16煙蚜繭蜂,17,18alloxystasp.,19,20蚜蟲跳小蜂,21,22syrphophaguseliavae,23,24syrphophagussp.,25,26syrphophagustaeniatus,27,28合溝細(xì)蜂,29,30黃足分盾細(xì)蜂,31,32麥無網(wǎng)長管蚜,33,34麥長管蚜,35,36麥二叉蚜,37,38禾谷縊管蚜，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中sp1目標(biāo)物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2alloxystasp1,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網(wǎng)長管蚜,9麥長管蚜,10禾谷縊管蚜,11alloxystasp3,12alloxystasp2,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細(xì)蜂,20黃足分盾細(xì)蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中sp2目標(biāo)物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2alloxystasp2,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網(wǎng)長管蚜,9麥長管蚜,10禾谷縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細(xì)蜂,20黃足分盾細(xì)蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中sp3目標(biāo)物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2alloxystasp3,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網(wǎng)長管蚜,9麥長管蚜,10禾谷縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp2,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細(xì)蜂,20黃足分盾細(xì)蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例7中sp4目標(biāo)物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2合溝細(xì)蜂,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網(wǎng)長管蚜,9麥長管蚜,10禾谷縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13alloxystasp2,14phaenoglyphisvillosa,15蚜蟲跳小蜂,16syrphophaguseliavae,17syrphophagussp.,18syrphophagustaeniatus,19蚜蟲寬緣金小蜂,20黃足分盾細(xì)蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例8中sp5目標(biāo)物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結(jié)果；從左至右分別為1,2黃足分盾細(xì)蜂,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網(wǎng)長管蚜,9麥長管蚜,10禾谷縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13alloxystasp2,14phaenoglyphisvillosa,15蚜蟲跳小蜂,16syrphophaguseliavae,17syrphophagussp.,18syrphophagustaeniatus,19蚜蟲寬緣金小蜂,20合溝細(xì)蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例9中mp1混合引物溶液各目標(biāo)物種的dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1麥無網(wǎng)長管蚜coi-1000,2麥無網(wǎng)長管蚜coi-500,3麥無網(wǎng)長管蚜coi-100,4麥無網(wǎng)長管蚜coi-50,5麥無網(wǎng)長管蚜coi-10,6麥無網(wǎng)長管蚜coi-5,7麥長管蚜coi-1000,8麥長管蚜coi-500,9麥長管蚜coi-100,10麥長管蚜coi-50,11麥長管蚜coi-10,12麥長管蚜coi-5,13麥二叉蚜coi-1000,14麥二叉蚜coi-500,15麥二叉蚜coi-100,16麥二叉蚜coi-50,17麥二叉蚜coi-10,18麥二叉蚜coi-5,19禾谷縊管蚜coi-1000,20禾谷縊管蚜coi-500,21禾谷縊管蚜coi-100,22禾谷縊管蚜coi-50,23禾谷縊管蚜coi-10,24禾谷縊管蚜coi-5,25mssrmixcoi-1000,26mssrmixcoi-500,27mssrmixcoi-100,28mssrmixcoi-50,29mssrmixcoi-10,30mssrmixcoi-5，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例10中mp2混合引物溶液各目標(biāo)物種的dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1翼蚜外蚜繭蜂coi-1000,2翼蚜外蚜繭蜂coi-500,3翼蚜外蚜繭蜂coi-100,4翼蚜外蚜繭蜂coi-50,5翼蚜外蚜繭蜂coi-10,6翼蚜外蚜繭蜂coi-5,7烏茲別克蚜繭蜂coi-1000,8烏茲別克蚜繭蜂coi-500,9烏茲別克蚜繭蜂coi-100,10烏茲別克蚜繭蜂coi-50,11烏茲別克蚜繭蜂coi-10,12烏茲別克蚜繭蜂coi-5,13阿爾蚜繭蜂coi-1000,14阿爾蚜繭蜂coi-500,15阿爾蚜繭蜂coi-100,16阿爾蚜繭蜂coi-50,17阿爾蚜繭蜂coi-10,18阿爾蚜繭蜂coi-5,19煙蚜繭蜂coi-1000,20煙蚜繭蜂coi-500,21煙蚜繭蜂coi-100,22煙蚜繭蜂coi-50,23煙蚜繭蜂coi-10,24煙蚜繭蜂coi-5,25paaamixcoi-1000,26paaamixcoi-500,27paaamixcoi-100,28paaamixcoi-50,29paaamixcoi-10,30paaamixcoi-5，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例11中mp3混合引物溶液各目標(biāo)物種的dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1寬肩阿莎金小蜂coi-1000,2寬肩阿莎金小蜂coi-500,3寬肩阿莎金小蜂coi-100,4寬肩阿莎金小蜂coi-50,5寬肩阿莎金小蜂coi-10,6寬肩阿莎金小蜂coi-5,7蚜繭蜂金小蜂coi-1000,8蚜繭蜂金小蜂coi-500,9蚜繭蜂金小蜂coi-100,10蚜繭蜂金小蜂coi-50,11蚜繭蜂金小蜂coi-10,12蚜繭蜂金小蜂coi-5,13蚜蟲寬緣金小蜂coi-1000,14蚜蟲寬緣金小蜂coi-500,15蚜蟲寬緣金小蜂coi-100,16蚜蟲寬緣金小蜂coi-50,17蚜蟲寬緣金小蜂coi-10,18蚜蟲寬緣金小蜂coi-5,19p.villosacoi-1000,20p.villosacoi-500,21p.villosacoi-100,22p.villosacoi-50,23p.villosacoi-10,24p.villosacoi-5,25aappmixcoi-1000,26aappmixcoi-500,27aappmixcoi-100,28aappmixcoi-50,29aappmixcoi-10,30aappmixcoi-5，“m”代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，“nc”代表陰性對照。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例12中sp1目標(biāo)物種特異性引物dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1alloxystasp1.16s-1000,2alloxystasp1.16s-500,3alloxystasp1.16s-100,4alloxystasp1.16s-50,5alloxystasp1.16s-10,6alloxystasp1.16s-5，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例13中sp2目標(biāo)物種特異性引物dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1alloxystasp2.16s-1000,2alloxystasp2.16s-500,3alloxystasp2.16s-100,4alloxystasp2.16s-50,5alloxystasp2.16s-10,6alloxystasp2.16s-5，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖14為本發(fā)明實(shí)施例14中sp3目標(biāo)物種特異性引物dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1alloxystasp3.16s-1000,2alloxystasp3.16s-500,3alloxystasp3.16s-100,4alloxystasp3.16s-50,5alloxystasp3.16s-10,6alloxystasp3，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖15為本發(fā)明實(shí)施例15中sp4目標(biāo)物種特異性引物dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1合溝細(xì)蜂16s-1000,2合溝細(xì)蜂16s-500,3合溝細(xì)蜂16s-100,4合溝細(xì)蜂16s-50,5合溝細(xì)蜂16s-10,6合溝細(xì)蜂16s-5，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

圖16為本發(fā)明實(shí)施例16中sp5目標(biāo)物種特異性引物dna濃度梯度檢測結(jié)果；從左至右分別為1黃足分盾細(xì)蜂16s-1000,2黃足分盾細(xì)蜂16s-500,3黃足分盾細(xì)蜂16s-100,4黃足分盾細(xì)蜂16s-50,5黃足分盾細(xì)蜂16s-10,6黃足分盾細(xì)蜂16s-5，“m”代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，“nc”代表陰性對照。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。

實(shí)施例1多重pcr體系mp1對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、目標(biāo)蚜蟲物種基因組的制備

單頭麥無網(wǎng)長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜分別放入1.5ml離心管中進(jìn)行組織研磨并提取dna，將貯存不同蚜蟲dna溶液的離心管標(biāo)注上物種名，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2、合成多重pcr體系mp1中所需引物，見表1中的mp1體系對應(yīng)的4對引物。將各對引物按比例配制成混合引物溶液，各條引物在反應(yīng)體系中的終濃度為見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，2.0μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl和dna模板，1.5μl。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，63℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以mp1體系中目標(biāo)蚜蟲物種(麥無網(wǎng)長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜)為模板，并以麥田常見寄生蜂種類15種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的麥無網(wǎng)長管蚜擴(kuò)增出97bp的條帶，3、4泳道對應(yīng)的麥長管蚜擴(kuò)增出156bp的條帶，5、6泳道對應(yīng)的麥二叉蚜擴(kuò)增出296bp的條帶，7、8泳道對應(yīng)的禾谷縊管蚜擴(kuò)增出395bp的條帶，即mp1的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.33、34、35、36。

實(shí)施例2多重pcr體系mp2對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、目標(biāo)寄生蜂物種基因組的制備

單頭翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂分別放入1.5ml離心管中進(jìn)行組織研磨并提取dna，將貯存不同寄生蜂dna溶液的離心管標(biāo)注上物種名，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2、合成多重pcr體系mp2中所需引物見表1中的mp2體系對應(yīng)的引物。將各對引物按比例配制成混合引物溶液，各條引物在反應(yīng)體系中的終濃度表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.8μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl；5mtmac，0.2μl和dna模板，1.5μl。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，61℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以mp2體系中目標(biāo)蚜蟲物種(翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂)為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類15種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的翼蚜外蚜繭蜂擴(kuò)增出185bp的條帶，3、4泳道對應(yīng)的烏茲別克蚜繭蜂擴(kuò)增出246bp的條帶，5、6泳道對應(yīng)的阿爾蚜繭蜂擴(kuò)增出433bp的條帶，7、8泳道對應(yīng)的煙蚜繭蜂擴(kuò)增出554bp的條帶，即mp1的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.37、38、39、40。

實(shí)施例3多重pcr體系mp3對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、目標(biāo)寄生蜂物種基因組的制備

脊柄金小蜂屬、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa提取方法參見實(shí)施例2。

2、合成多重pcr體系mp3中所需引物，體系中引物序列和各條引物在反應(yīng)體系中的終濃度見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，2.0μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl和dna模板，1.5μl。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以mp3體系中目標(biāo)蚜蟲物種(寬肩阿莎金小蜂、蚜繭蜂金小蜂、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa)為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類15種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的寬肩阿莎金小蜂擴(kuò)增出173bp的條帶，3、4泳道對應(yīng)的蚜繭蜂金小蜂擴(kuò)增出173bp的條帶，5、6泳道對應(yīng)的蚜蟲寬緣金小蜂擴(kuò)增出328bp的條帶，7、8泳道對應(yīng)的phaenoglyphisvillosa擴(kuò)增出413bp的條帶，即mp1的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.41、42、43。

實(shí)施例4單重pcr體系sp1對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、alloxystasp1基因組的制備參見實(shí)施例2。

2、合成alloxystasp1的特異性引物見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；上下游引物各1.0μl；dna模板，1.5μl。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以sp1體系中alloxystasp1為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的alloxystasp1擴(kuò)增出244bp的條帶，sp1的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.44。

實(shí)施例5單重pcr體系sp2對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、alloxystasp2基因組的制備參見實(shí)施例2。

2、alloxystasp2的特異性引物見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，參見實(shí)施例4。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以sp2體系中alloxystasp2為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的alloxystasp2擴(kuò)增出193bp的條帶，sp2的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.45。

實(shí)施例6單重pcr體系sp3對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、alloxystasp3基因組的制備參見實(shí)施例2。

2、合成alloxystasp3的特異性引物見表1。

3、pcr擴(kuò)增體系見實(shí)施例4，pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定

取5.0μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經(jīng)gelred染色后，在凝膠成像儀中可以顯示擴(kuò)增dna條帶，根據(jù)條帶大小判斷是否為目標(biāo)物種及混合引物溶液特異性。

5、結(jié)果以sp3體系中alloxystasp3為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的alloxystasp3擴(kuò)增出223bp的條帶，sp2的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.46。

實(shí)施例7單重pcr體系sp4對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、合溝細(xì)蜂基因組的制備參見實(shí)施例2。

2、合成合溝細(xì)蜂的特異性引物見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)，參見實(shí)施例4。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，62℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定參見實(shí)施例6。

5、結(jié)果以sp4體系中合溝細(xì)蜂為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖7所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的合溝細(xì)蜂擴(kuò)增出100bp的條帶，sp4的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)?；厥丈鲜瞿繕?biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.47。

實(shí)施例8單重pcr體系sp5對目標(biāo)物種的特異性擴(kuò)增效果

1、黃足分盾細(xì)蜂基因組的制備同實(shí)施例2。

2、合成黃足分盾細(xì)蜂的特異性引物見表1。

3、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系以10μl計(jì)參見實(shí)施例4。

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，63℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

4、pcr產(chǎn)物鑒定同實(shí)施例6。

5、結(jié)果以sp5體系中黃足分盾細(xì)蜂為模板，并以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖8所示，僅有1、2泳道對應(yīng)的合溝細(xì)蜂擴(kuò)增出137bp的條帶，sp4的引物僅對目標(biāo)物種dna具有擴(kuò)增作用，說明本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)。回收上述目標(biāo)物種條帶，測序所得條帶如seqidno.48。

實(shí)施例9多重pcr體系mp1對目標(biāo)物種最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例1提取單頭麥無網(wǎng)長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜dna，coi通用引物(forward:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’,reverse:5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例1中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例1中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖9所示，單獨(dú)dna模板檢出限皆為50拷貝，混合dna模板達(dá)到100拷貝。

實(shí)施例10多重pcr體系mp2對目標(biāo)物種最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例2提取單頭翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂dna，coi通用引物(forward:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’,reverse:5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例2中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例2中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖10所示，單獨(dú)dna模板檢出限皆為50拷貝，混合dna模板達(dá)到100拷貝。

實(shí)施例11多重pcr體系mp3對目標(biāo)物種最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例3提取脊柄金小蜂屬、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa的dna，16s通用引物(forward:5’-cacctgtttatcaaaaacat-3’,reverse:5’-tcgatttgaactcaratcatgta-3’)擴(kuò)增寬肩阿莎金小蜂和蚜繭蜂金小蜂序列，coi通用引物(forward:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’,reverse:5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’)擴(kuò)增蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例3中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例3中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖11所示，單獨(dú)dna模板檢出限皆為10拷貝，混合dna模板達(dá)到100拷貝。

實(shí)施例12單重pcr體系sp1對alloxystasp1最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例4提取單頭alloxystasp1的dna，16s通用引物(forward:5’-cacctgtttatcaaaaacat-3’,reverse:5’-tcgatttgaactcaratcatgta-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例4中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例4中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖12所示單獨(dú)dna模板檢出限為50拷貝。

實(shí)施例13單重pcr體系sp2對alloxystasp2最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例5提取單頭alloxystasp2的dna，16s通用引物(forward:5’-cacctgtttatcaaaaacat-3’,reverse:5’-tcgatttgaactcaratcatgta-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例5中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例5中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖13所示，單獨(dú)dna模板檢出限為500拷貝。

實(shí)施例14單重pcr體系sp3對alloxystasp3最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例6提取單頭alloxystasp3的dna，16s通用引物(forward:5’-cacctgtttatcaaaaacat-3’,reverse:5’-tcgatttgaactcaratcatgta-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例6中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例6中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖14所示，單獨(dú)dna模板檢出限為500拷貝。

實(shí)施例15單重pcr體系sp4對合溝細(xì)蜂最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例6提取單頭合溝細(xì)蜂的dna，coi通用引物(forward:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’,reverse:5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例7中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例7中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖15所示，單獨(dú)dna模板檢出限為500拷貝。

實(shí)施例16單重pcr體系sp5對黃足分盾細(xì)蜂最低檢出限的測定

1、通用引物擴(kuò)增按實(shí)施例6提取單頭黃足分盾細(xì)蜂的dna，coi通用引物(forward:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’,reverse:5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’)擴(kuò)增，反應(yīng)體系以10μl計(jì)，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)。

2、檢出限測定pcr產(chǎn)物送測序并檢測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，原模板溶液單獨(dú)進(jìn)行稀釋并混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數(shù)。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例7中的描述。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物也按實(shí)施例7中的凝膠電泳分析判斷。

3、結(jié)果如圖16所示，單獨(dú)dna模板檢出限為500拷貝。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種小麥蚜蟲及其寄生蜂的多重pcr檢測試劑盒

<130>khp171112741.5

<160>66

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agctattttattaattttatctttaccagtc31

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgctggatcaaaaaatgaagtg22

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

caccatcattaataataataatctgtagtttc32

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttgatgagattcctgctaaatgc23

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cctgatatatcatttccacgattaaac27

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

attgatcaagggaacaatggg21

<210>7

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ggtataattggttcatcccttagaatc27

<210>8

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<212>dna

<213>人工序列

<400>8

attgatgagattcctgctaaatgtag26

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

caattttwaatatacgattaaatggrataac31

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tgggtcaccccctccaga18

<210>11

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

attattaattcgtatagagttaagagttactaga34

<210>12

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cctctaattaataataaaattaaagatggaac32

<210>13

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tcatgcttttgtaataattttctttatg28

<210>14

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

tcctgctaaaacaggtaatgataatag27

<210>15

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

attaggtttatctataagattattaattcgg31

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<212>dna

<213>人工序列

<400>16

gatctgtcaataatatagtaatagctccc29

<210>17

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

caatgaattttaaatagctgcagtatc27

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<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gggtcttctcgtcttttaattaaata26

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<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

ggatttggaaattatttaattcctatat28

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<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ttgctcatgcaaataaaggaataa24

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<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

taatattatcagcaccagatatagcg26

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<212>dna

<213>人工序列

<400>22

tcctataggrtcaaaaaaagaagtatttat30

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<212>dna

<213>人工序列

<400>23

gaaagattaaataagatattaactatataaatttaatt38

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<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

cactcttttaattatttcataaattaatgtaaa33

<210>25

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gacgataagaccctatagaactttatattta31

<210>26

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

ccctaaggtaacttaatttattaatttatatg32

<210>27

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

tttttaattttattttaaagtaaaaaatcttt32

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<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

rttttagtaatttataaattaacactcttatttg34

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<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ccctcactaattttacttatcaatagaatg30

<210>30

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

cagcgtgtcttagattagacgttaag26

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<212>dna

<213>人工序列

<400>31

gggtcaattaattttctgtcaactt25

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<212>dna

<213>人工序列

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gccccagctaaaacggga18

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<212>dna

<213>人工序列

<400>33

agctattttattaattttatctttaccagtcttagctggtgctattacaatattattaac60

tgatcgaaatttaaacacttcattttttgatccagca97

<210>34

<211>156

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

caccatcattaataataataatctgtagtttcttaatcaataatggaacaggtacaggat60

gaactatttacccacctttatcaaataatattgcacataataatatttcagtagatttaa120

ctattttttcattgcatttagcaggaatctcatcaa156

<210>35

<211>296

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

cctgatatatcatttccacgattaaacaatatcagattttgattattaccaccttcacta60

ataataataatttgtagttttataatcaataatggaacaggaacaggatgaacaatttac120

ccaccattatctaataatattgctcataacaatatttcagttgatttaacaattttttct180

ttacatttagcaggaatctcctcaattctaggagcaattaactttatttgtacaatttta240

aatataatacctaataatataaaattaaatcaaatcccattgttcccttgatcaat296

<210>36

<211>395

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

ggtataattggttcatcccttagaatcttaattcgactagaactaagtcaaattaattca60

attattaataataatcaattatataatgtaattgttacaattcacgcttttattataatt120

ttttttataactataccaattgttattggtggttttggaaattgattaattcctataata180

ataggatgccctgatatatcattcccacgattaaataatattagattttgattattacct240

ccttcattaataataataatttgtagttttataattaataacggaacaggaacaggatga300

acaatttatccccctttatctaataatattgctcataataatatttcagttgatttaaca360

attttttctctacatttagcaggaatctcatcaat395

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<211>185

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

caattttwaatatacgattaaatggrataacwatagatcaaaytcctttatttgtttgat60

cagtwttaattacagtaattttattattaytatctttaccagttttrgcaggagcaatya120

ctatattattaactgaycgaaatwtaaatactacattttttgatttttctggagggggtg180

accca185

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<212>dna

<213>人工序列

<400>38

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aataaataatataagattttgattattagttccatctttaattttattattaattagagg240

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<212>dna

<213>人工序列

<400>39

tcatgcttttgtaataattttctttatggttatrcctattataattggtggatttggtaa60

ttgattaattcctttaatattaggagcccctgatatagcttttcctcgaataaataatat120

aagattttgattattaattccatctttaattttattattagttagaggtttaataaattc180

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tgtagcagtagattttgctattttttcattacatttagcaggkrtttcctctattatagg300

agctattaattttattagtactatttttaatatacgatcttataatattaaaatagatca360

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tgttttagcagga433

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<212>dna

<213>人工序列

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tatagttatacccatcataattggtggatttggtaattgattaattcctttaatattagg180

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tttaattttattattaattagaggtttaataaattcaggtgttggtacaggttgaactgt300

ttatcctcctttatcgttgacattaggycatagaggtgtagcggtagattttgctatttt360

ttcattacatttagcaggtatttcttctattataggagctattaattttattagaactat420

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attaattactgctattttgttattattatcattacctgttttagcgggagctattactat540

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<212>dna

<213>人工序列

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aaattttattataagttaaaattcttatatttaattaaaagacgagaagaccc173

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<212>dna

<213>人工序列

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ggatttggaaattatttaattcctatatttcttggatctcctgatatagcttttcctcga60

ataaataatataagattttgattattacctccaagattaattttattaatttctagaata120

tttattggttcaggaactggaactggttgaacagtataycctcctttatcttcaaatatg180

tctcataatggtccatctgttgatttatcaattttttctcttcatattgctggagtatca240

tcaattataggatctattaattttatttcaacaattattaatataaaaatttataaaatt300

gaaattattcctttatttgcatgagcaa328

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<212>dna

<213>人工序列

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taatattatcagcaccagatatagcgttycctcgtcttaataatataagatactgattat60

tattaccagcattaattttattartttcaagaatatttattgatcaaggrgcaggaacag120

gatgaacagtttayccccctttrtcttctaatttaagacaytcaggaatttcagtwgatt180

taacaatttttgctttacatttaaggggrgtttcttcaattttaggrtcaattaatttta240

ttactacaattttaaatatacgagtaatttcaatagataaaatttctttatttatttgrt300

ctatcttcctaacaacaattttattattattatctttaccggttctagcrggaggaatta360

caatattattatttgatcgtaatataaatacttctttttttgaycctatagga413

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<212>dna

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gaaagattaaataagatattaactatataaatttaattaaaattttaattttatttttaa60

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aatttaaataaaaatttttattatttaaattaataattatataatattatattgggggta180

taaaaaaattaaaataatttttttatataattttacattaatttatgaaataattaaaag240

agtg244

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<212>dna

<213>人工序列

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gacgataagaccctatagaactttatatttaaataatatataaaaatttaattattaaaa60

attattaattttaaatattatattgggggtataaaaaaattaaaataatttttttatttt120

aaataacatttataagtgattaataatataaagagtgtttacatataaattaataaatta180

agttaccttaggg193

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<212>dna

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tttttaattttattttaaagtaaaaaatctttaatatttttattagacgataagacccta60

tagaactttatattataataattaaataaaaatttaattatgtaaattaattaayttata120

atattatattgggggtataaaaaaattaaahaaatttttttattttaaataatacttata180

agtraaattcaaataagagtgttaatttataaattactaaaay223

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<212>dna

<213>人工序列

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ccctcactaattttacttatcaatagaatgattaatgatcaaggaactggaacagggtga60

actctatacccccccttaacgtctaatctaagacacgctg100

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<213>人工序列

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cccgttttagctggggc137

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>25

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<213>人工序列

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taaacttcagggtgaccaaaaaatca26

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ggtcaacaaatcataaagatattgg25

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taaacttcagggtgaccaaaaaatca26

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tcgatttgaactcaratcatgta23

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<212>dna

<213>人工序列

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cacctgtttatcaaaaacat20

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

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tcgatttgaactcaratcatgta23

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<212>dna

<213>人工序列

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cacctgtttatcaaaaacat20

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

tcgatttgaactcaratcatgta23

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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ggtcaacaaatcataaagatattgg25

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<212>dna

<213>人工序列

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taaacttcagggtgaccaaaaaatca26

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<211>25

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<213>人工序列

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ggtcaacaaatcataaagatattgg25

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<211>26

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taaacttcagggtgaccaaaaaatca26