本發(fā)明屬于腫瘤標(biāo)志物及應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種胃癌分子標(biāo)志物hsa_circ_0006633及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一，每年死于胃癌的人數(shù)占了全球死亡人數(shù)的10.4％，列腫瘤死亡原因的第三位。胃癌具有起病隱匿、早期易漏診、易轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等特點，且我國受到經(jīng)濟及醫(yī)療條件等多方面制約，早期胃癌的診斷率不足10％，患者被診斷時往往已經(jīng)處于胃癌進展期，其5年生存率約4～27％。當(dāng)前胃鏡活檢及其病理結(jié)果作為診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，因其高費用和操作的有創(chuàng)性使其在早期胃癌的篩查過程中受到了很大的限制。同時x線鋇餐造影、腹部ct、腹部mri等檢查方法則缺少較高的靈敏度。盡管血清腫瘤標(biāo)志物(如癌胚抗原、ca19-9)的檢測在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，但由于其均為非特異性的腫瘤相關(guān)抗原，靈敏度及特異度均有一定的局限性。

環(huán)狀rna(circularrna，circrna)是一類由5'末端和3'末端反向共價連接形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼rna分子。隨著rna測序和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)circrna大量存在于真核細(xì)胞中。因circrna具有豐富性、穩(wěn)定性、保守性等特點，具有一定的組織、時序和疾病特異性，其成為近年研究的新熱點。越來越多的研究表明，circrna作為一類具有重要調(diào)控功能的生物分子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后都有密切關(guān)系。

鑒于胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟的過程，涉及到大量的基因參與及復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，胃癌的病理生理機制迄今尚未完全闡明，對于其早期診斷及進一步治療有極大的限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種胃癌分子標(biāo)志物hsa_circ_0006633及其應(yīng)用，本發(fā)明首先設(shè)計能擴增hsa_circ_0006633的特異性pcr反向引物，通過pcr產(chǎn)物測序的方法證實了引物擴增的特異性和胃癌組織hsa_circ_0006633的存在性；并通過qrt-pcr方法大樣本驗證hsa_circ_0006633在不同階段胃組織中的水平及變化規(guī)律，證明hsa_circ_0006633具有較好的胃癌相關(guān)性；通過構(gòu)建roc曲線明確了胃癌組織hsa_circ_0006633的胃癌臨床診斷價值；結(jié)合腫瘤臨床病理因素，明確了胃癌組織hsa_circ_0006633表達水平與腫瘤臨床病理因素的聯(lián)系。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的胃癌組織中特異性表達下調(diào)hsa_circ_0006633具有作為新型胃癌篩查分子標(biāo)志物的潛質(zhì)。

本發(fā)明的一種胃癌分子標(biāo)志物hsa_circ_0006633，其核苷酸序列為aaagttgtacaagggattgatttaaaccaaattcgaggacttgggtttgatgccacgtgttctctggttgttttggataagcagtttcacccattaccagtcaaccaggaaggggattcccatcgaaacgtcatcatgtggctggaccatcgagcagtcagtcaagttaacaggatcaatgagaccaagcacagtgtcctccagtacgtcgggggggtgatgtctgtggaaatgcaggccccgaaacttctgtggctgaaagagaacttgagagagatttgctgggataaggcgggacatttctttgatctcccggacttcttatcgtggaaggcaacaggtgtcacagcacg如seqidno.1所示。

所述胃癌分子標(biāo)志物為環(huán)狀rnahsa_circ_0006633，定位人類1號染色體59805629～59844509區(qū)域，由fggy基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切形成。

用于hsa_circ_0006633檢測的特異性pcr反向引物為：

上游序列為：5’-ctcccggacttcttatcgtgg-3’；如seqidno.2所示

下游序列為：5’-cgatggtccagccacatgat-3’如seqidno.3所示。

所述hsa_circ_0006633在胃異型增生組織、胃癌組織中低表達。

本發(fā)明的一種胃癌分子標(biāo)志物hsa_circ_0006633的應(yīng)用，應(yīng)用于研究胃癌組織的表達情況。

本發(fā)明在前期采用circrna芯片檢測了3對胃癌組織及其配對癌旁組織中circrna表達譜的差異，通過比較目標(biāo)circrna在芯片中的熒光強度、改變倍數(shù)、鏈的長度、p值以及生物信息學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀rnahsa_circ_0006633在胃癌組織中顯著低表達，作為進一步研究對象。

通過primerpremier引物設(shè)計軟件，本發(fā)明自主設(shè)計了用于人hsa_circ_0006633檢測的特異性pcr反向引物(divergentprimer)，該引物上游序列為5’-ctcccggacttcttatcgtgg-3’；下游序列為5’-cgatggtccagccacatgat-3’。通過對該引物pcr產(chǎn)物測序，驗證了引物擴增的特異性(圖1)。

本發(fā)明通過組織rna提取、總rna的定量、總rna逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量pcr檢測方法大樣本驗證了hsa_circ_0006633在胃癌患者胃癌組織及其配對癌旁組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006633在79.2％的胃癌組織中顯著低表達。然后進一步檢測并橫向比較了hsa_circ_0006633在健康人胃黏膜組織、胃癌前病變(異型增生)組織及胃癌組織中的水平及變化規(guī)律，最終發(fā)現(xiàn)與健康胃組織相比，hsa_circ_0006633表達水平在胃異型增生組織及胃癌組織中顯著下調(diào)，而其在胃異型增生組織與胃癌組織中表達無顯著性差異，提示了hsa_circ_0006633可能在胃癌的起始階段發(fā)揮作用。

本發(fā)明通過構(gòu)建受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲線發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006633的曲線下面積為0.741，具有良好的臨床診斷價值。當(dāng)截斷值為8.165時，其靈敏度和特異度分別為60.42％和81.25％，具有較高的靈敏度和特異度。結(jié)合腫瘤臨床病理因素分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中hsa_circ_0006633的表達水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p＝0.037)、組織cea水平(p＝0.041)密切相關(guān)。通過上述驗證說明了hsa_circ_0006633具有良好的胃癌相關(guān)性。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)胃癌相關(guān)環(huán)狀rnahsa_circ_0006633，并通過pcr產(chǎn)物測序鑒定了其存在性，通過大樣本驗證發(fā)現(xiàn)其在胃異型增生組織及胃癌組織中表達水平顯著下調(diào)，在胃異型增生組織及胃癌組織中無顯著性差異；通過構(gòu)建roc曲線發(fā)現(xiàn)其具有良好的靈敏度和特異度。且在胃癌組織中hsa_circ_0006633的表達水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織cea水平密切相關(guān)，具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性。本發(fā)明同時驗證了circrna可通過qrt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測，為hsa_circ_0006633作為胃癌篩查標(biāo)志物的可行性及其臨床診斷價值提供了重要的意義。

有益效果

本發(fā)明通過研究首次發(fā)現(xiàn)并證明了hsa_circ_0006633胃癌組織中低表達，大樣本檢測并分析了其在胃黏膜不同病變階段組織中的表達規(guī)律，顯示hsa_circ_0006633具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性，同時驗證了circrna可通過qrt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測，為hsa_circ_0006633作為胃癌診斷的可行性及其臨床診斷價值提供了重要的意義，可作為胃癌篩查標(biāo)志物；

本發(fā)明通過circrna芯片、實時熒光定量pcr檢測等技術(shù)，結(jié)合簡便、經(jīng)濟、實用的特點，探究circrna作為胃癌篩查標(biāo)志物的可行性，在臨床診斷及應(yīng)用中具有重要的意義。

附圖說明

圖1為hsa_circ_0006633的pcr產(chǎn)物測序圖，驗證了引物擴增的特異性；

圖2為兩個組織標(biāo)本中g(shù)apdh的擴增曲線圖(樣本1為胃癌組織標(biāo)本，樣本2為健康胃組織標(biāo)本)；

圖3為兩個組織標(biāo)本中g(shù)apdh的解鏈曲線圖(樣本1為胃癌組織標(biāo)本，樣本2為健康胃組織標(biāo)本)；

圖4為兩個組織標(biāo)本中hsa_circ_0006633的擴增曲線圖(樣本1為胃癌組織標(biāo)本，樣本2為健康胃組織標(biāo)本)；

圖5為兩個組織標(biāo)本中hsa_circ_0006633的解鏈曲線圖(樣本1為胃癌組織標(biāo)本，樣本2為健康胃組織標(biāo)本)；

圖6為hsa_circ_0006633在胃癌組織中顯著低表達；

圖7為hsa_circ_0006633在胃癌前病變組織及胃癌組織中顯著下調(diào)，在胃癌前病變組織及胃癌組織中無顯著性差異；

圖8為hsa_circ_0006633的roc曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

1.樣本采集及處理

對胃癌患者進行外科手術(shù)治療，切除病變組織。在胃癌病灶和遠(yuǎn)離病灶部位5cm處分別切取黃豆樣大小組織一塊，用手術(shù)刀切成厚度不超過0.5cm的組織小塊，浸泡入1mlrnafixer非液氮型樣品rna保存液(北京百泰克)中，放入-80℃超低溫冰箱中備用。

2.組織rna提取

1)將組織標(biāo)本從-80℃超低溫冰箱中取出，室溫解凍。從rnafixer非液氮型樣品rna保存液取出組織塊，用濾紙吸干后，多位點剪取50mg～100mg組織，置于2ml無rnase離心管中，加入trizol試劑1ml，用手持式勻漿器充分勻漿至無可見固體后，室溫靜置10min；

2)加入0.2ml三氯甲烷，旋渦震蕩15s(或手動顛倒2min)，靜置3min。4℃條件下12000rpm離心15min，小心取上層水相400μl轉(zhuǎn)移至新的1.5ml無rnase離心管中；

3)在上一步中加入等體積異丙醇，旋渦震蕩5s混勻，4℃條件下靜置20min；4℃條件下12000rpm離心10min后棄去上清液體，加入預(yù)冷的75％乙醇1ml，輕輕洗滌沉淀(上下顛倒，使沉淀浮起即可)。4℃條件下12000rpm離心3min，棄去乙醇后，再次短暫離心15s，用槍頭吸除離心管底殘余液體，室溫放置3～5min適度晾干。取10μl無rnase水復(fù)溶總rna，反復(fù)吹打混勻，置于冰上備用。

3.總rna的定量

取0.5ml無rnase離心管加入98μl無rnase水后，再加2μl樣品總rna，旋渦震蕩并離心；用smartspecplus分光光度計測定樣品總rna濃度。a260/a280在1.8～2.0范圍內(nèi)可認(rèn)為總rna度可靠。

4.總rna逆轉(zhuǎn)錄

用goscript逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,rt)試劑盒(購于美國promega公司)對上一步的rna提取液進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作依該試劑盒說明書：在0.5ml離心管中加入9.5μlrna提取液、1μlrandomprimers、1μlpcrnucleotidemix、2μlmgcl2、1μlreversetranscriptase、4μlreactionbuffer和0.5μlribonucleaseinhibitor；在25℃保溫5分鐘，42℃1小時，再在70℃保溫15分鐘，加入80μl無rnase水，就得到cdna溶液，置于-20℃冰箱短期保存。

5.實時熒光定量pcr檢測

用mastermix檢測試劑盒(購于美國promega公司)對上步的cdna溶液進行熒光定量pcr(儀器購于美國stratagene公司)，擴增的上下游引物為gapdh特異性擴增上下游引物和circrna特異性擴增上下游引物，具體操作依檢測試劑盒和熒光定量pcr儀說明書進行：

1)在薄壁透明熒光定量pcr反應(yīng)管中分別加入各1μlhsa_circ_0006633特異性擴增上下游引物或gapdh上下游引物，12.5μlqpcrmastermix，5.5μl無rnase水和5μlcdna。所用的gapdh特異性擴增上下游引物序列為：上游序列為5’-tcgacagtcagccgcatcttcttt-3’(如seqidno.4所示)，下游序列為5’-accaaatccgttgactccgacctt-3’(如seqidno.5所示)；hsa_circ_0006633特異性擴增上下游引物序列為：上游序列為5’-ctcccggacttcttatcgtgg-3’(如seqidno.2所示)，下游序列為5’-cgatggtccagccacatgat-3’(如seqidno.3所示)。

2)pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性15秒，56℃退火30秒，70℃延伸30秒，共45個循環(huán)；解鏈曲線分析：95℃1分鐘，56℃30秒；然后緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.2℃/秒。最后得到組織樣本中g(shù)apdh表達水平的擴增曲線(附圖2)和解鏈曲線(附圖3)，從擴增曲線可以得到所檢測的二個標(biāo)本的ct值分別為20.16和24.42；從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個標(biāo)本的gapdh均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。本例樣本cdna的ctgapdh值≤30，rna(即cdna)質(zhì)量合格。同理得hsa_circ_0006633的擴增曲線(附圖4)和解鏈曲線(附圖5)，從擴增曲線可以得到所檢測的二個組織標(biāo)本的ct值分別為29.64和31.66，從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個標(biāo)本的hsa_circ_0006633均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。通過hsa_circ_0006633的pcr產(chǎn)物測序，驗證了引物擴增的特異性(附圖1)。

6.環(huán)狀rnahsa_circ_0006633表達水平計算

利用同一標(biāo)本中hsa_circ_0006633和gapdh的ct值，根據(jù)公式δct＝ctcircrna-ctgapdh計算出該hsa_circ_0006633的δct值，根據(jù)δct值的大小就可判斷該hsa_circ_0006633的相對表達水平；δct值越小，其對應(yīng)circrna的表達水平越高；而δct值越大，其對應(yīng)circrna的表達水平越低。

7.胃癌組織hsa_circ_0006633表達水平分析

借助qrt-pcr技術(shù)，大樣本驗證hsa_circ_0006633在胃癌組織及其配對癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006633在79.2％的胃癌組織中顯著低表達(附圖6)。接下去檢測并橫向比較了hsa_circ_0006633在健康人胃黏膜組織、胃癌前病變(異型增生)組織及胃癌組織中的水平及變化規(guī)律，最終發(fā)現(xiàn)其在胃異型增生組織及胃癌組織中表達顯著下調(diào)，提示hsa_circ_0006633在胃癌的起始階段發(fā)揮作用(附圖7)。通過構(gòu)建roc曲線發(fā)現(xiàn)胃癌組織hsa_circ_0006633曲線下面積為0.741，胃癌組織中hsa_circ_0006633具有較高的靈敏度和特異度。當(dāng)其截斷值為8.165時，靈敏度和特異度分別為60.42％和81.25％(附圖8)。結(jié)合腫瘤臨床病理因素，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中hsa_circ_0006633的表達水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織cea水平密切相關(guān)(表1)。

本發(fā)明通過上述研究首次發(fā)現(xiàn)并證明了hsa_circ_0006633胃癌組織中低表達，大樣本檢測并分析了其在胃黏膜不同病變階段組織中的表達規(guī)律，顯示hsa_circ_0006633具有極好的胃癌組織特異性和胃癌相關(guān)性，同時驗證了circrna可通過qrt-pcr方法實現(xiàn)定量檢測，為hsa_circ_0006633作為胃癌診斷的可行性及其臨床診斷價值提供了重要的意義，可作為胃癌篩查標(biāo)志物。

表1.胃癌組織hsa_circ_0006633表達水平(δct)與患者臨床病理因素相關(guān)性分析

sequencelisting

<110>葉,國良

<120>一種胃癌分子標(biāo)志物hsa_circ_0006633及其應(yīng)用

<130>1

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>353

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaagttgtacaagggattgatttaaaccaaattcgaggacttgggtttgatgccacgtgt60

tctctggttgttttggataagcagtttcacccattaccagtcaaccaggaaggggattcc120

catcgaaacgtcatcatgtggctggaccatcgagcagtcagtcaagttaacaggatcaat180

gagaccaagcacagtgtcctccagtacgtcgggggggtgatgtctgtggaaatgcaggcc240

ccgaaacttctgtggctgaaagagaacttgagagagatttgctgggataaggcgggacat300

ttctttgatctcccggacttcttatcgtggaaggcaacaggtgtcacagcacg353

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctcccggacttcttatcgtgg21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgatggtccagccacatgat20

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcgacagtcagccgcatcttcttt24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

accaaatccgttgactccgacctt24