本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)。
背景技術(shù)：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)，又稱為震顫麻痹(paralysisagitans)，由中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少為主要原因，是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，也是中老年人最常見的錐體外系疾病。帕金森病全人群患病率約為0.3％，作為一種典型的老年慢性疾病，帕金森病在老年人群中患病率成倍增加，65歲以上老年人群患病率為1％～2％，85歲以上為3％～5％，并且呈現(xiàn)出男性稍多于女性的趨勢。該病的主要臨床特點為靜止性震顫、動作遲緩及減少、肌張力增高、姿勢不穩(wěn)等為主要特征。臨床上將pd分為特發(fā)性/散發(fā)性pd、家族性/遺傳性pd、繼發(fā)性pd和帕金森綜合征。迄今，帕金森病確切病因尚不十分清楚，并且尚無有限的治療和治愈手段，因此對于疾病的預防顯得尤為重要，而帕金森病多數(shù)與遺傳相關(guān)，對有帕金森病家族史及相關(guān)基因攜帶者的篩查，對預防帕金森病均能起到一定的積極作用。近年來遺傳學研究發(fā)現(xiàn)了α-synuclein(snca)、lrrk-2、gba、parkin、pink1、dj-1、atp13a2等致病基因，并且發(fā)現(xiàn)這些相關(guān)基因的突變與左旋多巴敏感的帕金森綜合征有關(guān)。但以往的分子學診斷依賴sanger測序，而常規(guī)的一代測序中每個基因需要多次pcr，dna用量大，花費高且實驗周期長，往往需要逐一檢測多個候選基因，在成本與耗時方面不能滿足大規(guī)模測序的需求。而靶向捕獲二代測序技術(shù)對于遺傳性帕金森病的分子診斷具有明顯優(yōu)勢，彌補了一代測序的缺陷，可實現(xiàn)同時篩查多個樣本及同一類疾病的多個致病基因，為遺傳性帕金森病的診斷開辟了新的領(lǐng)域。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對帕金森病致病突變檢測的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提出一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)，該方法能夠在一輪測序中檢測多個帕金森病相關(guān)致病突變位點突變狀況。該方法具有靈敏度高、針對性強、覆蓋全面、通量大、準確性高等優(yōu)點。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)，該方法用于非診斷及非治療目的，包括以下步驟：1)提取檢測對象的基因組dna；2)對提取的基因組dna進行定量，并取3μg建立文庫；3)對文庫進行定量操作；4)上機測序；5)數(shù)據(jù)分析得到致病位點相關(guān)信息。；其中，所述步驟2)中的建立文庫的具體步驟如下：a)將基因組dna進行片段化；b)將片段化的基因組dna進行末端修復和3'末端添加堿基a；c)將3'末端添加堿基a的產(chǎn)物連接擴增接頭，以便進行有效連接產(chǎn)物的富集；d)將連接產(chǎn)物進行pcr擴增，富集有效產(chǎn)物；e)使用探針對富集的模板中的目標區(qū)域進行捕獲；f)將捕獲的目標片段分離；j)加上完整接頭獲得捕獲文庫。為了進一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：優(yōu)選地，所述步驟1)中的基因組dna來源于人類。優(yōu)選地，所述步驟1)中的提取方法包括純化柱純化、磁珠純化或酚氯仿提取。優(yōu)選地，所述步驟2)中的定量方法包括基于熒光定量原理的定量裝置定量、q-pcr定量和電泳。優(yōu)選地，所述步驟a)中對dna進行片段化的方法包括超聲破碎、轉(zhuǎn)座酶酶切和限制性內(nèi)切酶酶切。優(yōu)選地，所述步驟e)中的探針為針對帕金森病相關(guān)基因、相關(guān)突變點設計得到。優(yōu)選地，所述步驟e)中的探針包括snca、parkin、uchl1、pink1、dj-1、lrrk2、atp13a2、gigyf2、htra2、pla2g6、fbxo7、vps35、eif4g1、dnajc13、synj1、chchd2、adh1c、mapt、tbp、il1b、atp6ap2、rab39b、dnajc6、gba、syt11、rab7l、nucks1、sipa1l2、acmsd、tmem163、stk39中的至少一種。優(yōu)選地，所述步驟e)中的捕獲方法包括液相探針捕獲、固相芯片雜交捕獲和pcr富集。優(yōu)選地，所述步驟3)中的定量方法包括基于熒光定量原理的定量裝置定量、q-pcr定量和電泳。優(yōu)選地，所述步驟4)中的上機測序通過二代測序平臺進行。優(yōu)選地，所述步驟5)的具體操作如下：通過對所得測序數(shù)據(jù)與人類基因組的參考序列進性對比，最終對所測基因的每個突變位點情況進行分析，得到致病突變相關(guān)信息。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明針對帕金森病相關(guān)突變檢測，提供了一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)，該方法能夠同時對一個樣本的多個帕金森病相關(guān)突變進行分析，具有靈敏度高、針對性強、覆蓋全面、通量大、準確性高等優(yōu)點。附圖說明圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的檢測帕金森病相關(guān)突變位點的方法流程示意圖；具體實施方式本發(fā)明提供了一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)，包括以下步驟：1)提取檢測對象的基因組dna；2)對提取的基因組dna進行定量，并取3μg建立文庫；3)對文庫進行定量操作；4)上機測序；5)數(shù)據(jù)分析得到致病位點相關(guān)信息；其中，所述步驟2)中的建立文庫的具體步驟如下：a)將基因組dna進行片段化；b)將片段化的基因組dna進行末端修復和3'末端添加堿基a；c)將3'末端添加堿基a的產(chǎn)物連接擴增接頭，以便進行有效連接產(chǎn)物的富集；d)將連接產(chǎn)物進行pcr擴增，富集有效產(chǎn)物；e)使用探針對富集的模板中的目標區(qū)域進行捕獲；f)將捕獲的目標片段分離；j)加上完整接頭獲得捕獲文庫。本發(fā)明提供了一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法(pdcap)，主要技術(shù)流程：提取基因組dna、文庫制備、文庫質(zhì)檢定量、上機測序及數(shù)據(jù)分析。具體如下：根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，目標基因捕獲的方法不受限制。可以使用pcr富集的方法捕獲目標基因。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，可以使用生物素標記的液相探針與待測樣品中的目標區(qū)域進行雜交，之后使用鏈霉親和素標記的磁珠將雜交產(chǎn)物分離出來，最后通過pcr富集目標區(qū)域同時在目標區(qū)域兩側(cè)連接完整的接頭，形成文庫。由此，可以將目標基因序列從基因組中捕獲并富集。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，基因組dna樣本的來源并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實施例，基因組dna樣本是從受檢人的血漿中分離。根據(jù)本發(fā)明的進一步的實施例，基因組dna樣本是從帕金森病患者血漿中分離的。由此，可以有效地對帕金森病患者的基因組dna樣本進行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，探針是針對帕金森病32個基因的相關(guān)位點進行設計。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用純化柱純化基因組dna，之后進行凝膠回收電泳，確認dna質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，基因組dna純化定量之后，取3μg進行dna片段化，其中使用的片段化方法包括但不限于超聲破碎、轉(zhuǎn)座酶酶切、限制性內(nèi)切酶酶切，優(yōu)先選用超聲破碎。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將片段化dna進行末端修復及3'末端添加堿基a。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將3'末端添加堿基a的產(chǎn)物連接擴增接頭。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將連接產(chǎn)物進行pcr擴增。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將生物素標記探針與富集的樣品中的目標區(qū)域進行雜交。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用鏈霉親和素標記磁珠將雜交有目標區(qū)域dna的探針捕獲下來。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用pcr富集捕獲的目標區(qū)域dna，同時在兩端加上完整的文庫接頭序列。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，將文庫定量，使用的熒光定量分析儀定量包括但不限于qubit。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用以下引物序列進行第一次pcr擴增：primerf:5’-acactctctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.1)primerr:5’-gtactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.2)根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用illumina公司通用的建庫pcr引物進行第二次pcr擴增，包括一條通用的上游引物，和一條帶有標簽(index)序列的下游引物，使用高效的pcr擴增酶進行pcr。使用帶有標簽(index)序列的引物進行pcr以后，可以將不同來源的文庫進行混合，然后上機測序。pcr引物序列如下：truesequniversalprimer:5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；(seqidno.3)trueseqprimer-indexx:5’-caagcagaagacggcatacgagatnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’；(seqidno.4)其中，下劃線n部分的堿基可以依據(jù)illumina的官方說明使用多種堿基組合，從而產(chǎn)生更多的、不同標簽的引物，用于不同的文庫的區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，為了有效提高建庫各步驟中的產(chǎn)物純度、減少雜質(zhì)干擾、有利于后續(xù)步驟的進行，可以對文庫制備中各步驟的產(chǎn)物進行純化回收，純化方法包括但不限于磁珠純化、純化柱純化、瓊脂糖膠電泳純化，優(yōu)選磁珠純化。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，使用q-pcr的方法對測序文庫進行質(zhì)檢定量，其中以iluminap5、p7作為引物，使用illuminaphixcontrolkitv3作為標準品。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，通過高通量測序平臺進行測序，優(yōu)選illuminamiseq平臺，并進行數(shù)據(jù)分析，確定是否存在突變。下面結(jié)合實施例1，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1本實施例是采用miseq測序技術(shù)對受檢人血漿中的基因組dna進行檢測，具體操作步驟如下:1、按照說明書操作，使用roche的highpurepcrtemplatepreparationkit提取受檢人的血漿中的基因組dna。2、使用超聲破碎儀將基因組dna破碎成500bp左右的小片段。本實施例中，使用covaris超聲破碎儀，按照標準操作，將3μgdna片段化。3、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用50μl去核酸酶水洗脫，具體操作如下：4、使用t4dna聚合酶、klenowdna聚合酶、t4pnk進行末端修復。反應體系如下：成份體積(μl)dnasample48nuclease-freewater35.210×endrepairbuffer10dntpmix1.6t4dnapolymerase1klenowdnapolymerase2t4polynucleotidekinase2.2反應條件為：20℃，30min。5、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用32μl洗脫，具體操作如下：6、使用exo(-)klenow酶進行3'端加a堿基。反應體積如下：成份體積(μl)dnasample30nuclease-freewater1110×klenowpolymerasebuffer5datp1exo(-)klenow3反應條件為：37℃，30min。7、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用15μl洗脫，具體操作如下：8、使用tadna連接酶在模板兩端加接頭序列。反應體系如下：成份體積(μl)dnasample13nuclease-freewater15.55×t4dnaligasebuffer10adaptormix10t4dnaligase1.5反應條件為：20℃，15min。9、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用32μl洗脫，具體操作如下：10、對連接產(chǎn)物進行擴增，反應體系如下：成份體積(μl)indexingadaptor-ligatedlibrary15nuclease-freewater21primerf1.25primerr1.255×pcrbuffer10100mmdntpmix0.5dnapolymerase1pcr反應條件為：98℃預變性2min；98℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共循環(huán)4次；最終72℃延伸10min。由此，獲得pcr產(chǎn)物。備注：primerf:5’-acactctctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；(seqidno.1)primerr:5’-gtactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’。(seqidno.2)11、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用30μl洗脫，具體操作如下：12、使用生物素標記的探針與樣品雜交，反應如下體系：成份體積(μl)library3.4hybridizationbuffer13captureliprary7blockbuffer5.6反應條件為：95℃，5min變性，之后保持在65℃，16-24h。13、使用鏈霉親和素標記的磁珠，通過生物素與鏈霉親和素結(jié)合，將雜交有樣品目標序列的探針捕獲到磁珠上。步驟如下：14、使用dna聚合酶對捕獲到的目標序列進行擴增。反應體系如下：成份體積(μl)captureondna14nuclease-freewater22.55×pcrbuffer10truesequniversalprimer1trueseqprimer-index41100mmdntpmix0.5dnapolymerase1pcr反應條件為：98℃預變性2min；98℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循環(huán)12次；最終72℃延伸10min。由此，獲得pcr產(chǎn)物。備注：pcr引物序列如下：truesequniversalprimer:5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’；(seqidno.3)trueseqprimer-index4:5’-caagcagaagacggcatacgagattggtcagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’。(seqidno.5)15、使用agencourtampurexp磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.8:1，用30μl去核酸酶水洗脫，具體操作如下：16、文庫質(zhì)檢定量。將上一步得到的文庫2.0(invitrogen)進行定量，使用q-pcr進行質(zhì)檢。17、上機測序及數(shù)據(jù)分析。將樣本使用illuminamiseqpe-300程序進行雙末端測序，以便獲得測序結(jié)果，具體操作流程詳見miseq操作說明書。18、數(shù)據(jù)分析。miseq產(chǎn)出的測序結(jié)果是fastq形式的dna序列，對于illuminamiseq產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控以獲得高質(zhì)量dna序列數(shù)據(jù)，將reads在人類基因組上進行定位，根據(jù)reads定位信息獲取原始變異信息，對原始變異信息進行質(zhì)控以獲得高質(zhì)量的變異位點，利用多個數(shù)據(jù)庫對產(chǎn)生的高質(zhì)量變異位點進行注釋，將注釋過的變異位點信息更新到apdd(amplicongeneparkinsondiseasedatabase)中，并使用apdd對變異位點進行進一步注釋，配合臨床表現(xiàn)對可疑位點進行篩選，對于未找到可疑位點的樣本進行cnv(拷貝數(shù)據(jù)變異)篩選，整理報告，具體結(jié)果如下：在本文中所使用的術(shù)語“dna”為脫氧核糖核酸(英文：deoxyribonucleicacid，縮寫為dna)是一種由脫氧核糖核苷酸組成的雙鏈分子。可組成遺傳指令，引導生物發(fā)育與生命機能運行，其堿基排列順序構(gòu)成了遺傳信息，所以在遺傳病的診斷中具有重要的作用。在本文中所使用的術(shù)語：“q-pcr”為實時熒光定量核酸擴增(英文：real-timequantitativepcr)。一種利用熒光檢測達到實時檢測pcr狀況的pcr技術(shù)。在本文中所使用的術(shù)語：“read”為每個測得的dna序列。在本文中所使用的術(shù)語“高通量測序技術(shù)”指的是第二代高通量測序技術(shù)及之后發(fā)展的更高通量的測序方法。第二代高通量測序平臺包括但不限于illumina-solexa(miseq、hiseq-2000、hiseq-2500、hiseqxten等)、abi-solid和roche-454測序平臺等。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是還可以采用其他方法的測序方法和裝置進行本檢測。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以將根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸標簽用于illumina-solexa、abi-solid和roche-454測序平臺等的至少一種進行測序。高通量測序技術(shù)，例如miseq測序技術(shù)具有以下優(yōu)勢：(1)高靈敏度：高通量測序，例如miseq的測序通量大，目前一個實驗流程下來可以產(chǎn)生最多15g堿基數(shù)據(jù)，高的數(shù)據(jù)通量可以再測序序列數(shù)確定的情況下，使得每條序列獲得高的測序深度，所以可以檢測到含量更低的突變，同時因其測序深度高，其測序結(jié)果也更為可靠。(2)高通量，低成本：利用根據(jù)本發(fā)明實施例的標簽序列，通過一次測序可以檢測上萬份樣本，從而大大降低了成本。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。<110>上海昂樸生物科技有限公司；復旦大學附屬華山醫(yī)院<120>一種高通量檢測帕金森病致病基因突變的方法<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr擴增引物<400>1acactctctttccctacacgacgctcttccgatct35<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr擴增引物<400>2gtactggagttcagacgtgtgctcttccgatct33<210>3<211>58<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr擴增引物<400>3aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>4<211>64<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr擴增引物，n為a或c或t或g<400>4caagcagaagacggcatacgagatnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atct64<210>5<211>64<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr擴增引物<400>5caagcagaagacggcatacgagattggtcagtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atct64當前第1頁12