本發(fā)明涉及物種分子鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種用于圓盤菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

圓盤菌科（orbiliaceae）是一種世界性廣泛分布的小型盤菌，營腐生生活。在漫長的進(jìn)化歷史中，其菌絲體為適應(yīng)生存環(huán)境，其菌絲體可變態(tài)為各種結(jié)構(gòu)精巧的捕食器官捕食線蟲，而且還能變態(tài)而重寄生其他植物病原真菌。另外，還能產(chǎn)生一些毒力因子，例如胞外酶包括絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和膠原蛋白酶等直接或間接地參與侵染線蟲體壁的過程。這類真菌是線蟲種群自然控制的重要因子，也是植物病害生物防治的重要研究材料，在生物防治和適應(yīng)性進(jìn)化上具有極大研究潛力。目前該科真菌包含了幾個(gè)重要的捕食線蟲絲孢菌無性型屬，如arthrobotrys、dactylellina、drechslerella等。但因該科真菌包含無性型屬種多，物種形態(tài)特征多樣，某些物種間沒有明顯的顯微結(jié)構(gòu)差異，且目前對(duì)該類真菌的分子系統(tǒng)發(fā)育研究不足，分子證據(jù)和物種界定標(biāo)準(zhǔn)的缺乏，對(duì)其分類、科學(xué)命名和多樣性研究造成了極大障礙。因此，急需標(biāo)準(zhǔn)基因來建立其快速的分子鑒定，通過形態(tài)研究和分子數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法來解決其鑒別和分類問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服形態(tài)學(xué)鑒定圓盤菌存在的不足，本發(fā)明提供了一種圓盤菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)基因序列及鑒定方法，可以快速準(zhǔn)確地將該圓盤菌易混淆物種鑒定出來，從而為線蟲的防治提供快速和有效的鑒定工具。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于圓盤菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用，包括mtlsu標(biāo)準(zhǔn)基因片段的建立和樣品的鑒別步驟；其中：

（1）根據(jù)dna條形碼技術(shù)原理，采用pcr擴(kuò)增方法，確保條帶的純度及可靠性。測(cè)序結(jié)果通過手工校對(duì)、序列拼接，并確保所得序列為標(biāo)準(zhǔn)序列。從采集的圓盤菌樣品提取基因組dna，利用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增出樣品的mtlsu基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后分析比對(duì)，seqidno.1樣本引物序列擴(kuò)增樣品的mtlsu基因序列片段作為標(biāo)準(zhǔn)基因。

（2）樣品的鑒別：通過將待鑒別的樣品序列與標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行比對(duì)，基于同源性和基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種，獲得序列間的相似性，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最近的對(duì)應(yīng)物種即為待鑒別的物種；具體如下：

a.基于同源性鑒定規(guī)則來鑒別物種

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果與所述基因序列seqidno.1核苷酸差異個(gè)數(shù)在10個(gè)以下，即可判斷所述的待測(cè)樣品為圓盤菌的某個(gè)物種。

b.基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種

將標(biāo)準(zhǔn)基因序列和待鑒定的樣品序列與圓盤菌的mtlsu基因序列合并應(yīng)用mega或paup軟件構(gòu)建nj系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗(yàn)未鑒定樣品的dna條形碼序列與標(biāo)準(zhǔn)基因序列聚類在一起的物種，若未知樣品與數(shù)據(jù)庫中的物種構(gòu)成單支系，則鑒定為該物種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、優(yōu)選mtlsu基因作為最適合鑒別圓盤菌的dna條形碼，相比于其他基因，mtlsu是線粒體基因，其序列具有通用、易比對(duì)的特點(diǎn)。

2、建立了圓盤菌的標(biāo)準(zhǔn)基因序列和樣品的鑒別方法，相比于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，大大提高了鑒定效率。該方法對(duì)于樣品的完整程度要求低，鑒別指標(biāo)能夠量化，這對(duì)于及時(shí)鑒定圓盤菌提供了有效的依據(jù)。此外，運(yùn)用基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則進(jìn)行鑒定，其鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性也大大優(yōu)于常規(guī)的分子鑒定方法，彌補(bǔ)了該類圓盤菌分子鑒定的不足。

附圖說明：

附圖是待鑒定樣品序列及圓盤菌各屬的mtlsu標(biāo)準(zhǔn)基因序列基于kimura-2-parameter模型的遺傳距離構(gòu)建的nj樹。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：待測(cè)樣品與圓盤菌dna條形碼鑒別標(biāo)準(zhǔn)基因片段的同源性鑒定

1、圓盤菌標(biāo)本的采集與保存：采集的10份來自云南省的樣品。

2、提取圓盤菌基因組dna：采用改進(jìn)過的ctab法提取基因組dna，并用滅菌的去離子水將樣品的dna濃度稀釋到0.5μg/μl。

3、擴(kuò)增dna片段，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?pcr)反應(yīng)，即用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，外引物對(duì)序列為：

正向引物ml7:5'gaccctatgcagcttctactg3'；

反向引物ml8:5'ttatccctagcgtaacttttatc3'；

4.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性引物，其特征在于內(nèi)引物序列為：

正向引物ml-chaof:5'agaacaacggctaggtgg3'；

反向引物ml-chaor:5'gaacgagtccgcagaaga3'。

pcr反應(yīng)體系為25μl：ddh2o18μl、pcrbuffer2.5μl、mgcl22.5μl，dntps0.5μl，taqdna聚合酶0.5μl、dna模板1μl，不含染料；外引物擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，37℃退火55s，如此低溫退火2-3個(gè)循環(huán)，再將最終退火溫度定格于50℃，55s，72℃延伸1min，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。內(nèi)引物擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，退火溫度為55℃-50.5℃逐漸降低0.5℃，共計(jì)11個(gè)循環(huán)，最后將退火溫度定格在50℃，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

5、擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，用1.0%的瓊脂糖凝膠、1×tbe電泳液中電泳檢測(cè)，使用dnamarker檢測(cè)pcr片段大小。若出現(xiàn)明顯清晰的300-400bp大小的條帶，且無雜帶，送測(cè)序。

6、首先用軟件chromas中檢查測(cè)序后得到的序列峰圖質(zhì)量，確定峰圖質(zhì)量達(dá)到數(shù)據(jù)分析的要求之后，用dnastar軟件包中的seqman進(jìn)行正反向序列的拼接。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工校對(duì)、序列拼接，如果目的基因片段與所述基因序列seqidno.1核苷酸差異個(gè)數(shù)在10個(gè)以下，即可判斷所述的待測(cè)組織即為圓盤菌。

實(shí)施例2：運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種

1、采用實(shí)施例1中所述步驟得到待測(cè)樣品的序列，將標(biāo)準(zhǔn)基因序列和待鑒定的樣品序列與待測(cè)樣品的mtlsu序列合并應(yīng)用mega基于kimura-2-parameter模型重復(fù)1000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，未鑒定樣品的dna條形碼序列與標(biāo)準(zhǔn)基因序列聚類在一起，圓盤菌科的6各屬的序列呈現(xiàn)明顯的分歧，序列表中序列1與arthrobotrymusiformis聚在一起，說明待鑒定樣品可以鑒定為圓盤菌。

與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列和運(yùn)用的方法有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)圓盤菌快速和準(zhǔn)確的鑒定。

sequencelisting

<110>云南大學(xué)

<120>一種圓盤菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>314

<212>dna

<213>ymf1.03477eqidno.1

<400>1

aagagtagctgggtatatcctaattccgaaaaatttggggaaaaaattatattttttttc60

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