本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原HbpA2及其制備方法。

背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)屬于巴斯德菌(Pasteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)，為革蘭陰性細小桿菌，具有多種形態(tài)，定植于健康豬上呼吸道，屬于正常菌群，在免疫抑制等特定條件下會引起豬格氏病(Glasser’sdis-ease，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為主要特征。近些年來由于豬場規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展，尤其是工廠集約化養(yǎng)殖，豬格氏病已經(jīng)呈世界性流行和暴發(fā)，表現(xiàn)出突然死亡率、發(fā)病率和病死率較高，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，并造成巨大經(jīng)濟損失。我國近年來才開始逐漸重視對副豬嗜血桿菌病的研究。副豬嗜血桿菌的血清型眾多，目前已鑒別十五種血清型，還有15％-41％的未鑒定血清型，其中1，5，10，12，13和14為強毒株，而我國流行的血清型為4型和5。不同血清型的副豬嗜血桿菌毒力差異很大，我們對其毒力因子及致病機理知之甚少，至今尚無有效的通用商品苗和敏感的診斷方法，該病尚未得到有效控制，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國至今沒有像豬瘟兔化弱毒疫苗、偽狂犬基因缺失疫苗那樣的成熟疫苗來針對副豬嗜血桿菌病，目前大多都是傳統(tǒng)型滅活苗和弱毒苗，缺乏良好的保護力，導(dǎo)致臨床病例多見。而滅活疫苗只能對同種血清型的菌株具有保護作用，缺乏交叉保護力。副豬嗜血桿菌血清型的多樣性以及占很大比例的不能分型菌株影響了對具有高效交叉保護力疫苗的研制。亞單位疫苗同時具有活疫苗免疫效力高、交叉保護力強以及滅活苗的安全性好等優(yōu)點，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。大部分不能分型菌株副豬嗜血桿菌及其血清型的多樣性影響了人們對于具有高效交叉保護力疫苗的研制。血紅素結(jié)合蛋白(heme-bindingprotein，HbpA)是一種球蛋白，廣泛存在于致病菌中。有研究發(fā)現(xiàn)HbpA蛋白分子中有一個或多個與血紅素結(jié)合區(qū)域，具有結(jié)合、運輸和傳遞血紅素，參與機體代謝等生理功能，HbpA蛋白是一種重要的毒力因子，與細菌的致病性密不可分。在巴斯德菌科嗜血桿菌屬的流感嗜血桿菌上的研究表明，HbpA蛋白是流感嗜血桿菌的一種重要的毒力因子，HbpA蛋白與血紅素的利用有關(guān)。目前關(guān)于副豬嗜血桿菌HbpA蛋白的功能的研究報道較少，在已進行基因組測序的副豬嗜血桿菌SH0165中發(fā)現(xiàn)有兩個HbpA基因，兩個基因的大小均為1595bp。公開號為CN103288934A的專利申請公開了一種采用基因工程的方式重組表達HbpA基因(GeneID:7276898)的方法，但是，其制備的重組HbpA蛋白能小鼠感染副豬嗜血桿菌的保護力不佳，其免疫保護效果僅50％。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的重組HbpA蛋白及其制備方法。本發(fā)明提供了一種如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明重組載體，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重組載體是重組pET-39b質(zhì)粒。本發(fā)明重組菌，它包含前述的重組載體。其中，所述的重組菌為重組大腸桿菌。本發(fā)明重組HbpA2蛋白，它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列編碼。它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本發(fā)明制備重組HbpA2蛋白的方法，包含如下步驟：ⅰ、取權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌組菌，接種到添加有終濃度為50μg/ml的卡拉霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃、280r/min搖床培養(yǎng)，至OD600值達到0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.2～1.5mmol/L，25～42℃誘導(dǎo)表達1～7h；12h；ⅱ、離心，得菌體，裂解，取上清，分離純化，即得。步驟ⅰ中，IPTG的終濃度為1.5mmol/L，誘導(dǎo)表達的溫度為30℃；誘導(dǎo)表達的時間為5h。步驟ⅱ中，所述分離純化的方法如下：(1)將上清液用1mmol/LNaOH調(diào)pH至8.0，使用0.45μm的濾膜過濾樣品；(2)用上樣緩沖液平衡鎳離子螯合親和層析填料層析柱，上樣，按順序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗頭，收集用含有100mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫得到的溶液，即可；其中，上樣緩沖液包含如下濃度的成分：50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,5mmol/L咪唑；洗脫緩沖液包含如下濃度的成分：50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl。本發(fā)明采用基因工程的方式成功的構(gòu)建了基因工程菌，并表達得到了重組蛋白HbpA2。該重組蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保護原性，免疫后產(chǎn)生的HbpA2特異性抗體水平高，保護率高達70％，可以顯著保護小鼠抵抗副豬嗜血桿菌血清5型強毒菌株的攻擊，可以制備成為亞單位疫苗，預(yù)防副豬嗜血桿菌病，臨床應(yīng)用前景良好。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1HbpA2基因的PCR擴增結(jié)果圖。M:DNAmaker；1、2、3：PCR擴增產(chǎn)物；圖2誘導(dǎo)時間優(yōu)化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：誘導(dǎo)時間為：0、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h；圖3IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：IPTG:終濃度為：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L；圖4誘導(dǎo)溫度優(yōu)化。M：蛋白maker；1、3、5、7：pET-39b-HbpA2(BL21)誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo)溫度為25℃；4：誘導(dǎo)溫度為30℃；6：誘導(dǎo)溫度為37℃；7：誘導(dǎo)溫度為42℃；圖5HbpA2蛋白在pET-39b-HbpA2(BL21)中表達的形式檢測。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2：pET-39b-HbpA2(BL21)超聲波破碎后；3：上清；4：沉淀；圖6重組HbpA2表達的SDS-PAGE。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)誘導(dǎo)前；2：pET-39b(BL21)誘導(dǎo)后；3：pET-39b-HbpA2(BL21)誘導(dǎo)前；4：pET-39b-HbpA2(BL21)誘導(dǎo)后；5：HbpA2蛋白純化后(100mmol/L咪唑洗脫)；圖7重組蛋白Westernblotting；圖8小鼠存活率與時間的關(guān)系。具體實施方式實驗材料和試劑：副豬嗜血桿菌CVCC3361，來源于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌種編號：CVCC3361。大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。限制性內(nèi)切酶、Ex-TaqDNA聚合酶、DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNAMarker、pMD19-Tsimple載體等均購自寶生物(大連)工程有限公司。細菌基因組提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。預(yù)染蛋白Ladder為NEB公司產(chǎn)品。小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。LB培養(yǎng)基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化鈉(NaCl)10g/L，用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH，使其達到7.2-7.4，高壓蒸汽滅菌30min。上樣緩沖液配方：50mMNaH2PO4,300mMNaCl,5mMimidazole,pH8.0。洗脫液：50mMNaH2PO4,300mMNaCl,pH8.0。實施例1本發(fā)明副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原HbpA2的制備1、重組表達1.1HbpA2基因的克隆及表達載體的構(gòu)建1.1.1引物設(shè)計及合成根據(jù)副豬嗜血桿菌HbpA2基因序列(GeneID：7278927)，用生物軟件PremierPrimer5.0設(shè)計l對引物，擴增HbpA2基因。上游引物：5’-AGTACTCCGACAAATACATTGGTCAACTGT-3’；下游引物：5’-CTCGAGTTAAGGCTTCAGACTTACGCCATA-3’；1.1.2HbpA2基因的PCR擴增以副豬嗜血桿菌CVCC3361基因組DNA為模板，按常規(guī)方法進行PCR擴增，擴增體系25μL，4個重復(fù)。擴增體系：材料體積基因組模板1μL引物(上、下游)2μLEX-TaqMasterMix12.5μLddH2O9.5μL總體積25μL循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA膠回收試劑盒對電泳后的PCR片段進行膠回收純化(按照Omega膠回收試劑盒說明書進行操作)，將純化后的PCR片段進行測序。純化后的目的基因片段的核苷酸序列(SEQIDNO:1)：ccgacaaatacattggtcaactgtattgcgacagcaccgatgaaacttagtccggcaatt60acaaatgatgctaatgacttcaatgccagctcacaacaagtctataaccgcttagtcgaa120ttcaaagccggtaaaattgaagtagagccgggtctagccgaacgttgggaaatcagtgaa180gacggtttggtctatacattttatctacgccaaaatgtgaaattccacagcaacaaaacc240tttagcccaacccgcccgttaaatgccgatgatgtggtgttctcattccaacgccaagcg300gacaaaaatcatccttatcataatgtttcggcaggaacctacttctactttaactggatg360aacttaccgagtatcttaaaatccgttgaaaaagtggatgactacaccgttaaaattacg420ctgaataaaccgaatacgccgtttattaccacggttgccatggactttttatctatttat480tcaaaagaatatgccgatcagcttcttgcccagggtaagcccgaaactcttgatcaacaa540ccgattggaacggggccttttattttccaaacttatcagaccgaccacgcggtacgttac600actgctaacgtagattattggaaaggcaaagcagacattgaacgtttaatttttagcatt660acccctgatgccggaacacgttatgccaagttaaaagccggcgagtgtgatgtgattgat720tttccgaatatctcggacattgctcagatgaaaaaagatcctcaaatcaatctacttgag780cgtgagggattaaacttagcttacattgggctaaataccaccaaasctgaactaaacaac840gtaaaagttcgccaagcccttcaccatgctaccgataaaaaagcgattgttgatgcggtt900tatcaaggcggcggaacggttgcaaccaatccgttccctgatgcagtattaggttataac960ccgcatttgccacaatatgaatttaacttggaaaaagcaaaagcattattggcagaagcc1020ggctatccaaacggttttgaaacggaaatttgggtgcaacctgtggttcgtccatccaat1080ccgaaccctcgccgcacggctgaaattattcaagcagactgggctaaaattggcgtgaaa1140gcaaaactagtcacacatgaatgggcggattttaataaacgcacccgtgaaggcgaattt1200gccgcaggtacttatggttggacaagtcgtaacggtgatcctgataattttctattccct1260ttatttagccaagcaaatatccccggcaccaattactctcgctggacagatgaaaaattt1320gaggcgctactcgcctcagcggtacaaactcaagacacacaaacacgtgcaaaactatat1380caacaggcagtcgaaattttccaacaaaacagcccgatcattccgtttgcccactccatt1440aactacgtaccgttaaataaacgggtacaaggctttgttcaaaatccgtttggctatacc1500gcattttatggcgtaagtctgaagccttaa1530也可以采取合成的方式直接合成目的基因片段。1.1.3表達載體的構(gòu)建將目的及基因片段(PCR回收產(chǎn)物)克隆到T載體上得到pMD19-T-HbpA2，T載體克隆連接體系：材料試劑體積PCR回收產(chǎn)物3μLpMD19-T載體1μLT4DNALigase0.5μL10×Buffer1μLATP1μLddH2O3.5μL總體積10μL16℃連接過夜，PCR快速鑒定連接產(chǎn)物，連接后的產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5a，其步驟如下：(1)用移液槍取-70℃凍存的感受態(tài)細胞DH5a50μL于冰上溶解，加入pMD19-T-HbpA2質(zhì)粒10μL混勻，-20℃冰浴30min,42℃水浴鍋中熱激90s，迅速在-20℃冰浴5min。(2)將經(jīng)上述處理的樣品加入600μL預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃，180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)1.5h。(3)取出100μL菌液涂布于含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫箱培養(yǎng)12～24h。篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑取疑似菌落進行PCR，鑒定出含有pMD19-T-HbpA2的重組子并擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行測序鑒定。測序正確的pMD19-T-HbpA2用XhoI和ScaI定向克隆到原核表達載體pET-39b中，構(gòu)建重組表達載體pET-39b-HbpA2，其步驟如下：(1)用XhoI和ScaI對pMD19-T-HbpA2質(zhì)粒和pET-39b質(zhì)粒進行雙酶切，37℃酶切3h。(2)酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒對電泳后的目的片段進行膠回收純化(按照Omega膠回收試劑盒說明書進行操作)，－20℃保存?zhèn)溆谩?3)將酶切后的目的片段進行連接轉(zhuǎn)化得到重組表達載體pET-39b-HbpA2(連接轉(zhuǎn)化的方法同T載體克隆)，并進行PCR鑒定、酶切鑒定、測序鑒定。1.1.4重組菌的構(gòu)建最后將構(gòu)建好的重組表達載體pET-39b-HbpA2轉(zhuǎn)化進表達宿主菌BL21(DE3)，即得重組菌。1.2重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達1.2.1重組蛋白初表達及鑒定將含重組質(zhì)粒pET-39b-HbpA2的大腸桿菌BL21(DE3)接種含50μg/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37℃、280r/min振搖培養(yǎng)3～4h，至OD值為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度1mmoL/mL，繼續(xù)振搖培養(yǎng)3～4h，離心去上清，于沉淀中加SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5min，進行SDS-PAGE。凝膠經(jīng)考馬斯亮蘭染色后脫色，利用凝膠成像系統(tǒng)照相分析。1.2.2重組蛋白表達條件的優(yōu)化1.2.2.1誘導(dǎo)時間的優(yōu)化將重組菌以1:100的比例接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基試管中，待培養(yǎng)至OD值為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度1mmoL/mL，分別在誘導(dǎo)表達0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h后取1ml菌液，對樣品進行處理，SDS-PAGE電泳。1.2.2.2IPTG濃度的優(yōu)化將重組菌以1:100分別接種于含50μg/mlKan(即卡拉霉素)n的LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.5～0.6時，分別加入IPTG至終濃度為：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)上述試驗得出的最佳誘導(dǎo)時間，各取菌液1mL，對樣品進行后處理，SDS-PAGE電泳。1.2.2.3誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化將重組菌以1:100分別接種于含50μg/mlKan的LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至OD值為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為上述試驗得出的最佳IPTG濃度，分別在25℃、30℃、37℃、42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)上述試驗得出的最佳誘導(dǎo)時間，各取菌液1mL，對樣品進行后處理，SDS-PAGE電泳。1.2.3重組蛋白的大量表達將重組菌以1:100分別接種于含50μg/mlKan的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值為0.5～0.6時，在菌液中加IPTG至終濃度為最佳誘導(dǎo)表達的濃度，而后在最佳溫度下培養(yǎng)至最佳時間。(1)接種上述重組菌的單克隆于LB培養(yǎng)基(100μg/mlAmp)，37℃250r/min搖床培養(yǎng)12h；(2)將該菌液按1：100的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的LA培養(yǎng)基，在37℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min，用分光光度計進行實時檢測，當菌液OD600值達到0.6～0.8(細菌對數(shù)生長期)時加入IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達5h。(3)誘導(dǎo)表達的菌液在13000g下離心10min，棄掉上清，用細菌裂解液充分重懸菌體，在室溫下裂解處理30min。(4)通過離心分別收集菌液上清和沉淀，裂解處理后的標本通過12％SDS-PAGE進行分析。1.3分離純化(1)將誘導(dǎo)表達后的菌液12000g/min離心5min，收集菌體，加入含有1mg/mL溶菌酶的菌體裂解液80mL，懸浮沉淀。置于4℃反應(yīng)過夜。(2)于-20℃與室溫間反復(fù)凍融懸液3次。(3)溶化后懸液置于冰上使用超聲波細胞破碎儀40％強度破碎約10min。12000g/min離心10min，收集上清液，用1mmol/LNaOH調(diào)pH至8.0，使用0.45μm的濾膜過濾樣品，進行后續(xù)純化。(4)將Ni離子填料裝填入柱中過夜，待填料壓實后備用，即鎳離子螯合親和層析填料層析柱。(5)以流速為2ml/min的超純水洗脫酒精，至層析柱平衡。再用上樣緩沖液以lml/min的流速平衡層析柱，約30min。然后以0.5ml/min流速上樣，樣品上完后用上樣緩沖液平衡層析柱至平衡。按順序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液，以1ml/min的流速洗脫蛋白，當出現(xiàn)上升峰開始收集洗脫液至下降峰結(jié)束，待平衡后換下一濃度的咪唑洗脫緩沖繼續(xù)洗脫。收集用含有100mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫得到的溶液，即為含有本發(fā)明重組蛋白HbpA2的溶液，-80℃儲存?zhèn)溆茫琒DS-PAGE分析收集蛋白純度。2、測定2.1Westernblotting將純化后的HbpA2蛋白經(jīng)12％的凝膠進行SDS-PAGE電泳后，進行Westernblotting。其具體步驟如下：(1)將SDS-PAGE電泳后的凝膠塊經(jīng)適當剪切，同時剪切六張與凝膠大小一致的濾紙和一張NC膜；浸泡入轉(zhuǎn)移緩沖液中放置1h；(2)打開轉(zhuǎn)移盒，將經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙、凝膠和NC膜，按“濾紙--凝膠--NC膜--濾紙”在轉(zhuǎn)移盒負極上進行疊放，并用一干凈小試管輕輕滾過，以消除氣泡，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移池；(3)接通電源，25V轉(zhuǎn)移30min；(4)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，加入適量封閉緩沖液封閉1h左右；倒掉封閉液，TBST洗膜3次，10min/次；(5)將NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀釋的兔抗CVCC3361一抗，于37℃作用lh，棄一抗，用TBST洗膜3次，10min/次；(6)將NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀釋的羊抗兔IgG二抗，于37℃作用1h；TBST洗膜3次，10min/次；(7)加入適量顯色液，顯色20min～30min，待目的條帶清晰可見，用去離子水洗膜終止顯色，吸水紙吸干膜上水分，避光干燥。(8)凝膠圖象處理系統(tǒng)拍照分析。3、測定結(jié)果如圖1所示，以菌株CVCC3361基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，出現(xiàn)1條與預(yù)期片段(159bp)大小一致的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，擴增出的片段與Gen-Bank上公布的HbpA2基因序列的同源性為99.9％。構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET-39b-HbpA2經(jīng)XhoI和ScaI雙酶切可見2條帶，大小與預(yù)期的條帶大小一致。說明HbpA2基因已成功插入到pET39b載體上。如圖2～4所示，誘導(dǎo)表達時，IPTG最佳濃度為1.5mmol/L下，誘導(dǎo)溫度最佳為30℃，最誘導(dǎo)時間最佳為5h。如圖5～6所示，對本發(fā)明含有重組質(zhì)粒pET-39b-HbpA2的大腸桿菌誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE分析在70kd處出現(xiàn)1條明顯變粗的條帶，其大小與預(yù)期融合蛋白理論分子量大小一致，說明獲得了重組蛋白HbpA2，按照本發(fā)明方法分離純化后，獲得了純品蛋白。重組蛋白-HbpA2的氨基酸序列(SEQIDNO:2)為：PTNTLVNCIATAPMKLSPAITNDANDFNASSQQVYNRLVEFKAGKIEVEPGLAERWEISE60DGLVYTFYLRQNVKFHSNKTFSPTRPLNADDVVFSFQRQADKNHPYHNVSAGTYFYFNWM120NLPSILKSVEKVDDYTVKITLNKPNTPFITTVAMDFLSIYSKEYADQLLAQGKPETLDQQ180PIGTGPFIFQTYQTDHAVRYTANVDYWKGKADIERLIFSITPDAGTRYAKLKAGECDVID240FPNISDIAQMKKDPQINLLEREGLNLAYIGLNTTKELNNVKVRQALHHATDKKAIVDAVY300QGGGTVATNPFPDAVLGYNPHLPQYEFNLEKAKALLAEAGYPNGFETEIWVQPVVRPSNP360NPRRTAEIIQADWAKIGVKAKLVTHEWADFNKRTREGEFAAGTYGWTSRNGDPDNFLFPL420FSQANIPGTNYSRWTDEKFEALLASAVQTQDTQTRAKLYQQAVEIFQQNSPIIPFAHSIN480YVPLNKRVQGFVQNPFGYTAFYGVSLKP508如圖7所示，本發(fā)明重組蛋白HbpA2與免疫血清充分反應(yīng)后，在重組蛋白的位置有特異性顯色條帶，證實了該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。實驗結(jié)果說明，本發(fā)明通過基因工程的方式，重組表達得到了純品的重組蛋白HbpA2，其具有良好的反應(yīng)原性。以下用實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果：實驗例1本發(fā)明重組蛋白HbpA2的體內(nèi)保護效果一、實驗方法1.1副豬嗜血桿菌CVCC3361半數(shù)致死量(LD50)的測定1.1.1LD0和LD100的測定10只小鼠為一組，每只小鼠腹腔注射活菌液1×109CFU(預(yù)實驗中估計的LD0)，7天后統(tǒng)計小鼠死亡情況，若死亡兩只或兩只以上，則攻毒劑量減少0.1×109CFU，若全部存活，則攻毒劑量增加0.1×109CFU，直至一組小鼠中只有一只死亡為止，則與此相臨的低劑量即為LD0。同法求得LD100。1.1.2實驗組攻毒劑量的確定將小鼠隨機平均分為7組，每組小鼠均為10只，其中7組為對照組，1-6組為試驗組。按下列公式求出r值，其中G為組數(shù)，Dm/Dn為LD100與LD0之比。則試驗組的攻毒劑量分別為D1＝Dn＝LD0，D2＝D1×r，D3＝D2×r，D4＝D3×r，D5＝D4×r，D6＝D5×r。按照上述劑量攻毒后，觀察記錄小鼠的死亡情況。1.1.3LD50的計算通過Bliss-LD50軟件計算LD50，在程序中輸入各組攻毒劑量、動物數(shù)、死亡數(shù)，不用輸入對照組數(shù)據(jù)，單擊“計算”即可顯示CVCC3361對小鼠的LD50等參數(shù)。1.2小鼠的攻毒保護試驗40只小鼠隨機分成4組，每組10只。第l組背部皮下多點免疫50微克純化的HbpA2+佐劑(首次免疫為弗氏完全佐劑，第二次免疫為弗氏不完全佐劑)；第2組免疫副豬嗜血桿菌CVCC3361滅活苗+佐劑作為陽性對照組；第3組用生理鹽水作為陰性對照組；第4組用佐劑作為陰性對照組。首免后第14天加強免疫1次，免疫劑量和方式同首免。二免后的第14天所有小鼠用副豬嗜血桿菌CVCC3361通過腹腔攻毒。攻毒之前，采集小鼠血清，檢測HbpA2特異性抗體效價。攻毒后每天觀察并記錄小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，直到第5天。5d后對小鼠施行安樂死，并對所有死亡小鼠進行細菌的分離鑒定，以確認為副豬嗜血桿菌的感染。1.3特異性抗體的檢測用于檢測HbpA2特異性抗體的血清采自攻毒之前。小鼠斷尾采血，采到的血清于-20℃保存?zhèn)溆谩？贵w的檢測用間接ELISA法，具體方法如下：HbpA2純化后，用pH9.6的碳酸鹽稀釋，96孔ELISA板每孔加100μL于37℃孵育1h，4℃包被過夜。次日，用PBST洗滌3次后，用5％脫脂牛奶于37℃封閉1.5h。棄封閉液，用PBST洗3次。將待測血清從l：100至l：12500稀釋后每孔加100μL，37℃孵育1h。洗3次后，將羊抗小鼠IgG用PBST稀釋，每孔加100μL，37℃作用30min。洗3次，每孔加100μLTMB溶液于室溫避光反應(yīng)15min，加50μL2.0mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標儀于450nm處讀數(shù)。值大于0.2的孔被認為是有HbpA2特異性抗體存在。二、實驗結(jié)果1、鼠血清抗體檢測結(jié)果如表1所示：表1小鼠血清抗體檢測結(jié)果HbpA2免疫組的抗體滴度明顯高于陰性對照組和陽性對照組，說明表達的HbpA2具有良好的免疫原性。2、攻毒保護試驗為評價HbpA2免疫的保護效率，本研究以小鼠作為動物模型，經(jīng)過2次免疫后，以6x109CFU(5×LD50)強毒菌株CVCC3361攻毒，觀察并記錄小鼠的臨床癥狀和死亡情況，實驗結(jié)果如表2和圖8所示：表2攻毒保護試驗結(jié)果由如表2和圖8可以看出，陰性對照組小鼠均在攻毒后1天內(nèi)全部死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)多臟器病變，病變臟器能分離到攻毒用菌株；HbpA2免疫組攻毒后在2天內(nèi)死亡3只，其余小鼠觀察至5天仍然存活。陽性對照組小鼠攻毒后在2天內(nèi)死亡2只。結(jié)果說明，本發(fā)明HbpA2免疫能顯著保護小鼠抵抗副豬嗜血桿菌強毒菌株的攻擊，免疫保護性較好，保護率高達70％，保護效果接近全菌滅活疫苗。綜上，本發(fā)明采用基因工程的方式成功的構(gòu)建了基因工程菌，并表達得到了重組蛋白HbpA2。該重組蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保護原性，免疫后產(chǎn)生的HbpA2特異性抗體水平高，可以顯著保護小鼠抵抗副豬嗜血桿菌血清5型強毒菌株的攻擊，說明重組蛋白HbpA2是副豬嗜血桿菌的保護性抗原，可以制備成為疫苗，臨床應(yīng)用前景良好。