可用作抗病原劑的經(jīng)修飾植物防衛(wèi)素申請(qǐng)數(shù)據(jù)本申請(qǐng)與2011年2月7日提交的標(biāo)題為″抗病原劑″的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/440,309相關(guān)并且要求其優(yōu)先權(quán)，將所述臨時(shí)專利申請(qǐng)的整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。領(lǐng)域本公開內(nèi)容總體來(lái)說(shuō)涉及抗病原劑領(lǐng)域，包括具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素。還提供了表達(dá)或包含用于園藝和農(nóng)業(yè)以及用作動(dòng)物和人藥劑的被修飾防衛(wèi)素和抗病原體組合物的遺傳修飾植物及其后代或部分。背景在說(shuō)明書末尾按字母順序收集了發(fā)明人在本說(shuō)明書中提及的出版物的著錄項(xiàng)目?jī)?nèi)容。本說(shuō)明書中提及任何現(xiàn)有技術(shù)時(shí)，并不是而且也不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或任何方式暗示該現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成了任何國(guó)家中常識(shí)的部分。園藝和農(nóng)業(yè)工業(yè)面臨的主要困難之一是對(duì)病原體(例如真菌病原體)的感染和由其導(dǎo)致的損害的控制。植物病原體每年造成數(shù)百萬(wàn)噸的產(chǎn)量損失。雖然已成功應(yīng)用殺真菌劑和其它抗病原化學(xué)劑，但對(duì)持續(xù)使用化學(xué)劑控制植物害蟲也存在許多環(huán)境和調(diào)控顧慮。此外，日益增加的化學(xué)殺蟲劑的使用不斷為害蟲群體中抗性的出現(xiàn)提供選擇壓。很明顯需要開發(fā)在植物中誘導(dǎo)對(duì)病原體例如真菌、昆蟲、微生物、線蟲、蜘蛛、原生動(dòng)物和病毒的抗性的替代機(jī)制。植物先天免疫系統(tǒng)包括組成型或預(yù)成型以及誘導(dǎo)型組分。預(yù)成型免疫力包括各種物理屏障例如葉片上的蠟質(zhì)層和堅(jiān)硬細(xì)胞壁以及各種抗微生物蛋白質(zhì)的表達(dá)(Nurnberger等人(2004)ImmunolRev198：249-266)。誘導(dǎo)型反應(yīng)可包括響應(yīng)各種生物和非生物刺激而發(fā)生的細(xì)胞壁的強(qiáng)化(Showalter(1993)PlantCell5(1)：9-23)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物(Metlen等人(2009)PlantCellEnviron32(6)：641-653)和抗微生物蛋白質(zhì)(Berrocal-Lobo等人(2002)PlantPhysiol128(3)：951-961：LiandAsiegbu(2004)JPlantRes177(2)：155-162)的上調(diào)。此類反應(yīng)可在感染部位局部發(fā)生或在植物的遠(yuǎn)處未感染部分發(fā)生以產(chǎn)生系統(tǒng)性反應(yīng)。誘導(dǎo)型免疫還可通過(guò)基因?qū)蚍磻?yīng)發(fā)生，借此病原體相關(guān)分子模式(PAMPS)被特定模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別，從而導(dǎo)致阻止病原體進(jìn)一步傳播的超敏反應(yīng)(參見Jones和Dangl(2006)Nature444(7117)：323-329)。小的富含二硫鍵的蛋白質(zhì)在植物免疫力的組成型和誘導(dǎo)型方面起著重大作用。它們可基于它們的半胱氨酸排列而歸類至多個(gè)家族中，包括硫素、蛻皮素、索馬甜樣蛋白(thaumatin-likeprotein)、橡膠蛋白型(havein-type)和knottin型蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白和環(huán)肽類以及防衛(wèi)素。植物防衛(wèi)素是具有4至5個(gè)二硫鍵的小的(45-54個(gè)氨基酸)堿性蛋白質(zhì)(Janssen等人(2003)Biochemistry42(27)：8214-8222)。它們共有共同的二硫鍵鍵合模式和共同的結(jié)構(gòu)折疊，其中三鏈反向平行β-折疊片通過(guò)3個(gè)二硫鍵連系于α-螺旋，形成半胱氨酸穩(wěn)定化的αβ基元(CSαβ[參見圖1])。第4個(gè)二硫鍵還連接N-和C-末端，從而導(dǎo)致極其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。已將許多功能歸功于防衛(wèi)素，包括抗菌活性、蛋白質(zhì)合成抑制以及α-淀粉酶和蛋白酶抑制(Colilla等人(1990)FEBSLett270(1-2)：191-194；Bloch和Richardson(1991)FEBSLett279(1)：101-104)。已在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)了植物防衛(wèi)素，這導(dǎo)致增強(qiáng)的對(duì)靶病原體的抗性。例如，表達(dá)苜蓿防衛(wèi)素(MsDef1，先前稱為alfAFP)的馬鈴薯相較于非轉(zhuǎn)化對(duì)照顯示顯著的抗真菌病原體大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的抗性(Gao等人(2000)NatBiotechnol18(12)：1307-1310)。大麗花屬防衛(wèi)素(DmAMPl)在稻中的表達(dá)足以提供抗兩種主要稻病原體稻瘟菌(Magnaportheoryzae)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的保護(hù)作用(Jha等人(2009)TransgenicRes18(1)：59-69)。盡管它們存在保守結(jié)構(gòu)，但植物防衛(wèi)素的序列同一性非常低，僅有這8個(gè)半胱氨酸殘基是完全保守的。這些半胱氨酸殘基通常稱為“不變的半胱氨酸殘基”，因?yàn)樗鼈兊拇嬖诤臀恢迷诜佬l(wèi)素間是保守的?；谛蛄邢嗨菩裕参锓佬l(wèi)素可分類成不同的組(參見圖2)。在每一個(gè)組內(nèi)，序列同源性相對(duì)較高，然而組間氨基酸相似性較低。來(lái)自不同組的抗真菌防衛(wèi)素似乎通過(guò)不同的機(jī)制起作用。植物防衛(wèi)素可分成兩大類。I類防衛(wèi)素由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)信號(hào)序列后跟成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域組成。II類防衛(wèi)素以更大的前體產(chǎn)生，具有約33個(gè)氨基酸的C末端前結(jié)構(gòu)域(pro-domain)或前肽(pro-peptide)(CTPP)。迄今為止鑒定的大多數(shù)II類防衛(wèi)素是在茄科植物種類中發(fā)現(xiàn)的。II類茄科防衛(wèi)素的比對(duì)提供于圖3中。圖3中提及的NsD1和NsD2代表了按照本公開內(nèi)容鑒定的新型防衛(wèi)素。它們被包括在圖3中并不意味著它們構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的一部分。II類茄科防衛(wèi)素展示抗真菌活性并且在花組織中表達(dá)。它們包括NaD1，其以高濃度在觀賞性煙草花煙草(Nicotianaalata)的花中表達(dá)(Lay等人(2003)PlantPhysiol131(3)：1283-1293)。NaD1是對(duì)其抗真菌活性的機(jī)制已進(jìn)行過(guò)研究的唯一II類茄科防衛(wèi)素。該肽的活性包括對(duì)細(xì)胞壁的結(jié)合、質(zhì)膜的透化以及肽進(jìn)入菌絲的細(xì)胞質(zhì)(vanderWeerden等人(2008)JBio1Chem283(21)：14445-14452)。與許多其它防衛(wèi)素不同，NaD1似乎特異于絲狀真菌，而對(duì)酵母、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。NaD1在棉花中的表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)真菌病原體棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)和大棉花麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的抗性。在田間條件下，表達(dá)NaD1的植物的存活可能性是未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物的2倍，并且每公傾棉絨產(chǎn)量加倍。盡管如此，在表達(dá)NaD1的植物中仍然存在顯著水平的疾病。防衛(wèi)素的結(jié)構(gòu)由7個(gè)定義為半胱氨酸殘基之間的區(qū)域的′環(huán)′組成。環(huán)1包括第一個(gè)β-鏈(1A)以及將該β-鏈與位于前兩個(gè)不變半胱氨酸殘基之間的α-螺旋(1B)相連接的柔性區(qū)域的大部分。圖5顯示包括這些保守半胱氨酸殘基的NaD1的環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)2、3和4的開始部分(4A)組成此α-螺旋，而剩下的環(huán)(4B-7)組成β-鏈2和3以及連接它們的柔性區(qū)域(β-發(fā)夾區(qū)域)。植物防衛(wèi)素的該發(fā)夾區(qū)域形成在不同種類的許多抗微生物肽中發(fā)現(xiàn)的γ-核心基元(YountandYeaman(2005)ProteinPeptLett12(1)：49-67)。該β-發(fā)夾區(qū)域似乎是植物防衛(wèi)素的生物活性所必需的。蘿卜防衛(wèi)素RsAFP2的該區(qū)域內(nèi)的突變(參見圖2)通常對(duì)其抗真菌活性具有負(fù)面影響。事實(shí)上，鑒定為抗真菌活性所必需的12個(gè)殘基中的8個(gè)位于該區(qū)域(DeSamblanx等人(1997)JBiolChem272(2)：1171-1179)。此外，對(duì)應(yīng)于此分子的該區(qū)域的化學(xué)合成肽本身也具有抗真菌活性(Schaaper等人(2001)J.Pept.Res.57(5)：409-418)。在一項(xiàng)單獨(dú)的研究中，已顯示位于VrD2(來(lái)自綠豆的防衛(wèi)素)的環(huán)5內(nèi)的6個(gè)殘基是其α-淀粉酶抑制活性所必需的(Lin等人(2007)Proteins68(2)：530-540)。另有一項(xiàng)研究調(diào)查了包含來(lái)自具有抗真菌活性的防衛(wèi)素(MsDefl)和不具有抗真菌活性的防衛(wèi)素(MtDef2)的區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)的活性。包含MsDefl的β2-β3發(fā)夾區(qū)域的嵌合防衛(wèi)素具有與完全MsDefl蛋白幾乎相同的活性，而包含來(lái)自MtDef2的該區(qū)域的嵌合防衛(wèi)素不具有活性(Spelbrink等人(2004)PlantPhysiol135(4)：2055-2067)。已報(bào)導(dǎo)，連接第一β-鏈與鄰近的、位于第二不變半胱氨酸殘基N末端的α-螺旋的柔性環(huán)(環(huán)1B)當(dāng)與來(lái)自環(huán)5的殘基結(jié)合為斑塊(patch)時(shí)，在一些防衛(wèi)素的抗真菌活性中起著很小的作用。RsAFP2的誘變研究鑒定了位于該區(qū)域內(nèi)的對(duì)于活性非常重要的兩個(gè)氨基酸(DeSamblanx等人，1997，同上)。然而，當(dāng)用來(lái)自非抗真菌防衛(wèi)素的對(duì)應(yīng)區(qū)域替換抗真菌防衛(wèi)素MsDef1的該區(qū)域時(shí)，抗真菌活性僅存在適度的改變(Spelbrink等人，2004，同上)。II類茄科防衛(wèi)素具有可變程度的抗真菌活性。一些I類防衛(wèi)素顯示極低的抗真菌活性。修飾防衛(wèi)素以提高和拓寬其抗病原體活性的努力迄今在很大程度上是不成功的。對(duì)一些防衛(wèi)素的抗性的發(fā)生也是潛在的問(wèn)題。需要對(duì)開發(fā)能夠操控防衛(wèi)素的抗病原體活性的水平和抗性譜的方案。一系列具有抗病原體活性的新型防衛(wèi)素的產(chǎn)生也有利于抗擊抗性的發(fā)生。概述除非上下文另外要求，否則在整個(gè)本說(shuō)明書中，單詞“包含”或其變化形式例如“包括”或“含有”將被理解為意指包括所述組件或整體或方法步驟，或者組件或整體或方法步驟的組，但不排除任何其它組件或整體或方法步驟，或者組件或整體或方法步驟的組。如本說(shuō)明書中所用，除非上下文中明確地另有所指，否則單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”和“所指物(the)”包括復(fù)數(shù)所指物。因此，例如，提及″一種(a)防衛(wèi)素″包括單種防衛(wèi)素以及兩種或更多種防衛(wèi)素；提及″一個(gè)(an)氨基酸的置換、添加和/或缺失″包括單個(gè)氨基酸的置換、添加和/或缺失，以及兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的置換、添加和/或缺失；提及″所指方面(theaspect)″包括單個(gè)方面以及兩個(gè)或更多個(gè)方面，如本說(shuō)明書中教導(dǎo)的；等等。核苷酸和氨基酸序列由序列標(biāo)識(shí)號(hào)(SEQIDNO)來(lái)表示。SEQIDNO在數(shù)字上對(duì)應(yīng)于序列標(biāo)識(shí)符〈400〉1(SEQIDNO：1)、〈400〉2(SEQIDNO：2)等。序列標(biāo)識(shí)符的概述提供于表1中。在權(quán)利要求書后提供了序列表。本公開內(nèi)容教導(dǎo)了構(gòu)成具有抗病原體活性的防衛(wèi)素新家族的人工修飾II類茄科防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述被修飾的II類茄科防衛(wèi)素的抗病原體活性在活性的水平和/或范圍、穩(wěn)定性和/或膜透化能力的一個(gè)或多個(gè)方面相較于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素得到增強(qiáng)。修飾的防衛(wèi)素在本文中被教導(dǎo)在園藝和農(nóng)業(yè)中用于控制病原體感染和生長(zhǎng)以及在用于動(dòng)物和人藥劑的制造。它們可單獨(dú)使用或與化學(xué)殺病原體劑、抗病原體蛋白和/或蛋白酶抑制劑或其前體形式組合使用。有新的防衛(wèi)素家族可供利用還幫助抗擊病原體對(duì)特定防衛(wèi)素的抗性。II類茄科防衛(wèi)素用作主鏈，在所述主鏈中位于防衛(wèi)素N末端部分上的第一β-鏈(β-鏈1)與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域(也描述為第一柔性環(huán))被氨基酸置換、添加和/或缺失和/或來(lái)自另一種防衛(wèi)素的環(huán)區(qū)域修飾，或?qū)⑵湫揎椥问揭浦仓罥I類茄科防衛(wèi)素上以取代該環(huán)區(qū)域的全部或部分。主鏈防衛(wèi)素還可任選地在該環(huán)區(qū)域的外面包含另外的突變。當(dāng)存在時(shí)，可對(duì)環(huán)1B區(qū)域外的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域產(chǎn)生1至約50個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失形式的另外的突變。提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含：(i)來(lái)源于或?qū)?yīng)于II類茄科防衛(wèi)素、在其N末端區(qū)域內(nèi)具有環(huán)結(jié)構(gòu)域的氨基酸主鏈；(ii)主鏈上的環(huán)結(jié)構(gòu)域，其經(jīng)歷如下一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)氨基酸置換、添加和/或缺失；和/或(b)被來(lái)自另一種防衛(wèi)素的環(huán)或其修飾形式置換第一環(huán)結(jié)構(gòu)域的全部或部分；其中所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素顯示抗病原體活性。本公開內(nèi)容教導(dǎo)單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失，包括將II類茄科防衛(wèi)素的第一環(huán)結(jié)構(gòu)域、特別地環(huán)1B轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)于I類防衛(wèi)素的環(huán)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列?；蛘?，將另一種II類防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域用于替換II類防衛(wèi)素上的環(huán)1B。被修飾的II類茄科防衛(wèi)素還可在該區(qū)域外面包含一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸置換、添加和/或缺失。如果存在，1至約50個(gè)額外的突變可位于環(huán)區(qū)域的外面。在一個(gè)實(shí)施方案中，相較于修飾前的II類防衛(wèi)素，其抗病原體活性得以增強(qiáng)?！逶鰪?qiáng)的″意指相較于非修飾的II類防衛(wèi)素而言活性的水平和/或譜、穩(wěn)定性和/或膜透化能力中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的改善。用作主鏈的II類茄科防衛(wèi)素包括在NaD1成熟結(jié)構(gòu)域的C末端處約20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基(包括C端最末端的不變半胱氨酸(C)殘基)的序列(SEQIDNO：52)上具有至少70％的氨基酸序列相似性的防衛(wèi)素。II類茄科防衛(wèi)素的實(shí)例包括NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth和Cc-gth。其它主鏈防衛(wèi)素包括來(lái)自辣椒屬的C20和來(lái)自煙草屬的SL549。NsD1和NsD2來(lái)自香甜煙草(Nicotianasuaveolens)，其氨基酸序列分別示于SEQIDNO：49和51。提及II類茄科防衛(wèi)素的N末端區(qū)域處的″環(huán)結(jié)構(gòu)域″時(shí)，其包括由前兩個(gè)(不變)半胱氨酸(C)殘基側(cè)翼連接所界定的整個(gè)環(huán)區(qū)域。這是防衛(wèi)素在其N末端區(qū)域的第一個(gè)柔性環(huán)。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，″環(huán)結(jié)構(gòu)域″可以是指于第一β-鏈的末端開始、于第二個(gè)不變半胱基酸殘基的N末端側(cè)結(jié)束的環(huán)區(qū)域。該區(qū)域在圖5中稱為″L1B″[環(huán)1B]。在NaD1(II類茄科防衛(wèi)素的一個(gè)實(shí)例)中，該區(qū)域或結(jié)構(gòu)域包含以單字母代碼表示的氨基酸序列NTFPGI(參見圖5)。其它II類茄科防衛(wèi)素的第一環(huán)區(qū)域示于圖3。圖4代表不同種類的防衛(wèi)素的氨基酸序列比對(duì)，顯示了8個(gè)保守半胱氨酸殘基。因此，II類茄科防衛(wèi)素主鏈的環(huán)1B區(qū)域可被突變或可以將來(lái)自另一種防衛(wèi)素(例如來(lái)自I類防衛(wèi)素或另一種II類防衛(wèi)素)的環(huán)1B區(qū)域原位移植以產(chǎn)生具有X1X2X3X4X5X6的環(huán)1B氨基酸序列，其中：X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；使用單字母氨基酸命名法，其中突變的II類茄科防衛(wèi)素中的氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于在修飾之前形成主鏈的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變II類茄科防衛(wèi)素主鏈的環(huán)1B區(qū)域，或?qū)?lái)自另一種防衛(wèi)素(例如來(lái)自I類防衛(wèi)素)的環(huán)1B區(qū)域在其原位移植以產(chǎn)生X1X2X3X4X5X6的氨基酸序列，其中：X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；使用單字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于在修飾之前形成主鏈的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變II類茄科防衛(wèi)素主鏈的環(huán)1B區(qū)域，或?qū)?lái)自另一種防衛(wèi)素(例如來(lái)自I類防衛(wèi)素)的環(huán)1B區(qū)域在其原位移植以產(chǎn)生X1X2X3X4X5X6的氨基酸序列，其中：X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和/或X6是P、V、I、N；使用單字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人工產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的防衛(wèi)素包含SEQIDNO：57中所示的氨基酸序列。在該序列中，環(huán)1B區(qū)域被定義為X1X2X3X4X5X6，其中：X1是選自下述的氨基酸：L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G；X2是選自下述的氨基酸：S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G；X3是選自下述的氨基酸：A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H；X4是選自下述的氨基酸：K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S；X5是選自下述的氨基酸：M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F；和X6是選自下述的氨基酸：V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N。在一個(gè)實(shí)施方案中，人工產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的防衛(wèi)素包含SEQIDNO：84所示的氨基酸序列。在該序列中，環(huán)1B區(qū)域被定義為X1X2X3X4X5X6，其中：X1是選自下述的氨基酸：N、H、Q、D、K、E；X2是選自下述的氨基酸：R、H、T、K、G；X3是選自下述的氨基酸：F、H、YW；X4是選自下述的氨基酸：P、K、S、R；X5是選自下述的氨基酸：G、F；和X6是選自下述的氨基酸：P、V、I、N。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中教導(dǎo)的是具有抗病原體活性的II類茄科防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素包含SEQIDNO：39中所示的氨基酸序列或與SEQIDNO：39具有至少70％的相似性的氨基酸序列，其修飾是對(duì)II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B氨基酸序列的氨基酸置換、添加或缺失。SEQIDNO：39是NaD1主鏈中的NaD2環(huán)1B序列(HRFKGP)的氨基酸序列，產(chǎn)生HXP4。本公開內(nèi)容不擴(kuò)展至NaD1，但擴(kuò)展至其中其環(huán)1B序列已被改變的經(jīng)修飾NaD1。本公開內(nèi)容也不擴(kuò)展至FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth或Cc-gth，但擴(kuò)展至其中其環(huán)1B序列已被改變的FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth或Cc-gth的修飾形式。如上文中所指出的，這些方面適用于任何II類茄科防衛(wèi)素，包括具有與NaD1成熟結(jié)構(gòu)域的C末端區(qū)域的約20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基序列具有70％或更高的氨基酸序列相似性的防衛(wèi)素。該20個(gè)連續(xù)氨基酸的序列定義為SEQIDNO：52。在一個(gè)實(shí)施方案中，將主鏈氨基酸序列上的環(huán)1B區(qū)域修飾成HRFKGP(SEQIDNO：29)、QHHSFP(SEQIDNO：30)、DTYRGV(SEQIDNO：31)，或修飾成SEQIDNO：67至79之任一、PTWEGI(SEQIDNO：32)、DKYRGP(SEQIDNO：33)、KTFKGI(SEQIDNO：34)、KTWSGN(SEQIDNO：35)、EGWGK(SEQIDNO：36)、GTWSGV(SEQIDNO：37)或AGFKGP(SEQIDNO：38)[使用單字母氨基酸命名法]。方便地，這可通過(guò)將來(lái)自NaD2(HRFKGP)、γ-zeathionin2(QHHSFP)、PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)或DmAMP1(KTWSGN)的環(huán)1B區(qū)域或由SEQIDNO：67至79定義的環(huán)1B移植至II類茄科防衛(wèi)素主鏈上其環(huán)1B氨基酸序列的位置處，或修飾現(xiàn)有的環(huán)1B區(qū)域以產(chǎn)生選自HRFKGP、QHHSFP、DTYRGV、DKYRGP、KTFKGI和KTWSGN的環(huán)1B氨基酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。II類茄科防衛(wèi)素可僅包含該經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，或者還組合包含對(duì)該環(huán)區(qū)域外面的防衛(wèi)素主鏈的氨基酸置換、添加和/或缺失。如上文中所指出的，還可使用SEQIDNO：67至79中定義的環(huán)1B，或可將一種II類茄科環(huán)1B置換至另一種II類茄科防衛(wèi)素主鏈上。因此提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、具有位于所述防衛(wèi)素N末端部分上具有第一β-鏈與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中所述環(huán)區(qū)域通過(guò)氨基酸置換、缺失和/或添加而被修飾，以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的在第二不變半胱氨酸殘基的N末端具有環(huán)1B區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中1B區(qū)域已被氨基酸的置換、添加和/或缺失修飾，從而產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。另一個(gè)實(shí)施方案提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在第二個(gè)不變半胱氨酸殘基的N末端具有環(huán)1B區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中所述環(huán)1B區(qū)域已被氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾，從而產(chǎn)生相較于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素而言具有增強(qiáng)的抗病原體活性的防衛(wèi)素，其中所述II類茄科防衛(wèi)素包含在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：52所示的氨基酸序列具有至少約70％相似性的成熟結(jié)構(gòu)域的C末端部分?！灏被嶂脫Q、添加和/或缺失″意指一個(gè)或多個(gè)置換、添加和/或缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，人工修飾的II類茄科防衛(wèi)素具有抗病原體活性，其包含SEQIDNO：57中所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：57具有至少70％相似性的氨基酸序列，所述修飾是針對(duì)II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，人工修飾的II類茄科防衛(wèi)素具有抗病原體活性，其包含SRQIDNO：84所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：84具有至少70％相似性的氨基酸序列，所述修飾是針對(duì)II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，相較于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素，抗病原體活性在活性的水平和/或范圍、穩(wěn)定性和/或膜透化中的一個(gè)或多個(gè)方面得到增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗病原體活性是抗真菌活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗病原體活性是抗-殺昆蟲活性。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、位于該II類茄科防衛(wèi)素N末端部分的第一β-鏈與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，并且其中通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失對(duì)所述環(huán)區(qū)域進(jìn)行了修飾產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的環(huán)區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列；從而產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域是位于第二個(gè)不變半胱氨酸殘基的N末端側(cè)的環(huán)1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、具有位于該II類茄科防衛(wèi)素N末端部分處的第一β-鏈與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，并且其中通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失而修飾所述環(huán)區(qū)域，以產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的環(huán)區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，其中X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；以及X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、T或Y，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列；從而產(chǎn)生抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域是位于第二個(gè)不變半胱氨酸殘基N末端的環(huán)1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、具有位于該II類茄科防衛(wèi)素N末端部分處的第一β-鏈與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述防衛(wèi)素主鏈上的環(huán)區(qū)域被來(lái)自選自NaD2(HRFKGP)、Zea2(QHHSFP)、PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1(KTWSGN)的防衛(wèi)素的環(huán)區(qū)域或其修飾形式或選自SEQIDNO：67至79的環(huán)1B序列所替換，以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域被1或2或3或4或5或6個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述II類茄科防衛(wèi)素包含經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域和位于環(huán)區(qū)域外面的主鏈區(qū)域中的氨基酸置換、添加和/或缺失。當(dāng)存在時(shí)，可在環(huán)區(qū)域外面產(chǎn)生1至約50個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失。病原體可以是真菌(絲狀或非絲狀的)、微生物、昆蟲、蜘蛛、線蟲、原生動(dòng)物或病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病原體是真菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病原體是昆蟲。術(shù)語(yǔ)″增強(qiáng)的抗病原體活性″包括更廣譜的作用、更高水平的活性、更大的穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)的膜透化活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，病原體是真菌，包括植物真菌和動(dòng)物真菌?！鍎?dòng)物真菌″包括感染哺乳動(dòng)物(包括人)的真菌，例如擔(dān)子菌類和子囊菌。本文中還提供了包含人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素分子以及編碼所述防衛(wèi)素分子的核酸分子的組合物。所述組合物可用于植物中或植物上或者動(dòng)物中或動(dòng)物上，例如哺乳動(dòng)物，包括人。所述組合物可包含另外的試劑例如化學(xué)殺病原體劑、蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺病原體劑和/或絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體。還提供了用于產(chǎn)生具有病原體抗性的植物以及處理植物和動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物，例如人)以治療或預(yù)防病原體感染、生長(zhǎng)和/或維持的方案。本公開內(nèi)容還教導(dǎo)了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素用于制造抗病原體藥劑的用途，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、具有位于II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分處的第一β-鏈與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中所述環(huán)區(qū)域已通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失而被修飾。在一個(gè)方面，將化學(xué)或蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺病原體劑和/或蛋白酶抑制劑或其前體與該經(jīng)修飾的防衛(wèi)素組合使用。在一個(gè)方面，單個(gè)基因構(gòu)建體編碼包含改變的環(huán)1B區(qū)域的被修飾防衛(wèi)素和蛋白酶抑制劑或其前體形式例如NaPinlA(來(lái)自花煙草)、牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)、番茄半胱氨酸蛋白酶抑制劑、S1Cys9或大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑、HvCPI6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用多個(gè)構(gòu)建體，每一個(gè)構(gòu)建體單獨(dú)地編碼被修飾防衛(wèi)素和蛋白酶抑制劑或其前體形式中的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域是環(huán)1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了來(lái)自澳大利亞本地香甜煙草的分離的防衛(wèi)素以及其作為主鏈防衛(wèi)素分子的用途。香甜煙草防衛(wèi)素包括NsD1和NsD2。NsD1的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別示于SEQIDNO：48和49。NsD2的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別示于SEQIDNO：49和51。本文中還涉及單獨(dú)具有經(jīng)修飾的環(huán)1B或者還組合有對(duì)主鏈的1至約50個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失的香甜煙草防衛(wèi)素。還提供了例如有效地連接了異源啟動(dòng)子和/或載體核酸分子的編碼香甜煙草防衛(wèi)素的分離的核酸分子。因此，本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面是來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面涉及來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：51[NsD2]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。根據(jù)這些方面，香甜煙草防衛(wèi)素可以是分離的純化形式，或作為包含防衛(wèi)素和稀釋劑、載體、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或固體或液體添加劑的制劑或組合物的部分存在。在本文中提供了編碼NsD1(SEQIDNO：48)和NsD2(SEQIDNO：50)的分離的核酸分子，以及具有在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：48或SEQIDNO：50具有至少70％同一性或的核苷酸序列的核酸分子，或在中等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：48或SEQIDNO：50或其互補(bǔ)形式雜交的核酸分子，其例如同操作地連接至異源啟動(dòng)子和/或載體核酸分子。當(dāng)將經(jīng)修飾的防衛(wèi)素與另一種試劑例如蛋白酶抑制劑或半胱氨酸蛋白酶抑制劑組合使用時(shí)，可將編碼所有蛋白質(zhì)的單個(gè)基因構(gòu)建體或各自編碼蛋白質(zhì)的多個(gè)構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。或者，可將經(jīng)修飾而表達(dá)防衛(wèi)素的植物經(jīng)歷蛋白酶抑制劑或化學(xué)殺病原體劑的局部施用。在本說(shuō)明書中通篇使用的序列標(biāo)識(shí)符概述于表1中。表1序列標(biāo)識(shí)符的概述表2提供了用于說(shuō)明舉例說(shuō)明的被修飾防衛(wèi)素的命名概述。表2磁修飾防衛(wèi)素的命名所概述命名說(shuō)明HXP4NaD1主鏈中的NaD2環(huán)1BHXP34NaD1主鏈中的Zea2環(huán)1BHXP35NaD1主鏈中的PSD1環(huán)1B命名說(shuō)明HXP37NaD1主鏈中的VrD1環(huán)1BHXP91NaD1主鏈中的MsDeF1環(huán)1BHXP92NaD1主鏈中的SoD2環(huán)1BHXP58NaD1主鏈中的DmAMP1環(huán)1BHXP72PhD2主鏈中的NaD2環(huán)1BHXP95NsD1主鏈中的NaD2環(huán)1BHXP107TPP3主鏈中的NaD2環(huán)1B表3是本文中使用的氨基酸殘基的單字母和三字母代碼表。表3氨基酸殘基的單字母和三字母縮寫列表附圖概述圖1是顯示共同的二硫鍵合模式和共同的結(jié)構(gòu)折疊的防衛(wèi)素NaD1、RsAFP1、VrD2和甜味蛋白(Brazzein)的圖示，其中三鏈的反向平行β-折疊片通過(guò)3個(gè)二硫鍵系連至α-螺旋，從而形成半胱氨酸穩(wěn)定的αβ基元(CSαβ)。第四個(gè)二硫鍵還連接N與C末端，從而導(dǎo)致穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。圖2是顯示基于序列相似性而將防衛(wèi)素分入16個(gè)組的圖示。圖3A和B表示II類茄科防衛(wèi)素NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、Na-gth、NpThiol和Cc-gth的序列比對(duì)。圖3A中的陰影描述了序列之間的高水平保守。圖4表示不同種類的防衛(wèi)素的序列比對(duì)，所述比對(duì)顯示，除保守的8個(gè)半胱氨酸殘基外，只有位置7和10上的氨基酸是高度保守的。編號(hào)基于NaD1。圖5是顯示連接β-鏈1與α-螺旋的環(huán)1B位置的NaD1環(huán)結(jié)構(gòu)的圖示。圖6A表示描述重組NaD1(rNaD1)的表達(dá)和純化的免疫印跡。在48小時(shí)收集的巴斯德畢赤酵母表達(dá)培養(yǎng)基(30μL)，以及來(lái)自SP瓊脂糖純化的不同階段的樣品，包括未結(jié)合級(jí)分(30μL)、洗滌級(jí)分(30μL)和前5個(gè)1.5mL洗脫級(jí)分(每份30μL)均通過(guò)SDS-PAGE分離，并利用α-NaD1抗體通過(guò)免疫印跡檢查。將來(lái)自花的NaD1(200ng)用作陽(yáng)性對(duì)照?？稍?8小時(shí)的表達(dá)培養(yǎng)基以及SP瓊脂糖洗脫級(jí)分中檢測(cè)到rNaD1。圖6B表示舉例說(shuō)明使用SP瓊脂糖從巴斯德畢赤酵母純化的rNaD1的純度的反相HPLC描跡。將包含rNaD1的SP瓊脂糖洗脫級(jí)分加載至分析C8RP-HPLC柱上，使用40分鐘的線性梯度(0-100％緩沖液B)進(jìn)行洗脫。通過(guò)在215nm的吸光度來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。檢測(cè)到單個(gè)主要蛋白質(zhì)，表明該蛋白質(zhì)純度很高。圖6C表示rNaD1與從花純化的天然NaD1的結(jié)構(gòu)。比較rNaD1(空心方塊)與天然NaD1(閉合菱形)的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜，顯示沒(méi)有顯著差異，表明rNaD1是正確折疊的。圖6D表示rNaD1相對(duì)于從花純化的天然NaD1的抗真菌活性。將在rNaD1(空心方塊)或天然NaD1(閉合菱形)存在的情況下棉花枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)相對(duì)于進(jìn)行相同時(shí)期的無(wú)蛋白質(zhì)對(duì)照的生長(zhǎng)作圖。曲線圖代表來(lái)自以一式四份進(jìn)行的3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖7是用于環(huán)交換的I類防衛(wèi)素相較于NaD1和NsD1的抗禾谷鐮孢的抗真菌活性的圖示。圖8是環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗禾谷鐮孢(Fgr)的相對(duì)抗真菌活性的圖示。圖9是環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗環(huán)珠鐮孢(F.verticilloides)(Fve)的相對(duì)抗真菌活性的圖示。圖10是環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗禾生刺盤孢(C.graminicola)(Cgr)的相對(duì)抗真菌活性的圖示。圖11是pHEX138構(gòu)建體的圖示。DNA被插入在二元載體pBIN19的左右邊界之間(Bevan(1984)NucleicAcidsResearch12：8711-8721)。通過(guò)修飾NaD1基因產(chǎn)生所述DNA?？s寫按順時(shí)針順序排列為：oriV：無(wú)性復(fù)制起始點(diǎn)ColE1orl：來(lái)源于大腸桿菌素E1的復(fù)制起始點(diǎn)；TDNARB：根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)TDNA的右邊界；Nos啟動(dòng)子：胭脂堿合酶Nos基因的啟動(dòng)子；NPTII：編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II的基因序列；Nos終止子：Nos基因的終止子序列；被破壞的lacZ：編碼B-半乳糖苷酶的部分序列的DNA區(qū)段；CaMV35S啟動(dòng)子：花椰菜花葉病毒(CaMY)35S蛋白的啟動(dòng)子；HXP4：編碼NaD1中的NaD2環(huán)1B[NaD2L1B]+CTPP的DNA；CaMV35S終止子：編碼CaMV35S蛋白的基因的終止子序列；M13ori：M13病毒復(fù)制起點(diǎn)；TDNALB：TDNA左邊界；所有箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。圖12是環(huán)變體HXP4相較于NaD1的抗黑曲霉的相對(duì)抗真菌活性的圖示。圖13A至C是HXP4相較于NaD1的抗隱球酵母屬的種的相對(duì)抗真菌活性的圖示。圖14A至C是相較于NaD1，HXP4對(duì)亞洲大豆銹菌(大豆銹菌(Phakopsorapachyrhizi))的萌發(fā)(24小時(shí)，A)、附著胞(24小時(shí)，B)和附著胞后結(jié)構(gòu)(48小時(shí)，C)的作用的圖示。圖15是用于玉米的包含編碼HvCPI6(大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑)的核苷酸序列的構(gòu)建體的核苷酸序列圖示。還提供了HvCPI6的氨基酸序列。圖16是用于玉米的包含編碼HvCPI6(大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑)和被修飾的防衛(wèi)素HXP4的核苷酸序列的構(gòu)建體的核苷酸序列圖示。還提供了HvCPI6和HXP4的氨基酸序列。發(fā)明詳述提供具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素分子。術(shù)語(yǔ)″被修飾防衛(wèi)素″、″變體防衛(wèi)素″、″突變的防衛(wèi)素″和″嵌合防衛(wèi)素″全部可用于描述本文中描述的被修飾II類茄科防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，在防衛(wèi)素的N末端部分的第一β-鏈(β-鏈1)與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域處修飾II類茄科防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，該環(huán)區(qū)域包括第二個(gè)不變半胱氨酸殘基或其等同物的N末端的6個(gè)氨基酸。該區(qū)域定義為″環(huán)1B″(參見圖5)。II類茄科防衛(wèi)素與其它防衛(wèi)素的區(qū)別在于成熟結(jié)構(gòu)域的相對(duì)保守的C末端部分。″II類茄科防衛(wèi)素″包括與NaD1成熟結(jié)構(gòu)域的C末端部分具有至少70％氨基酸序列相似性的任何防衛(wèi)素，其中NaD1的C末端部分包含包括NaD1成熟結(jié)構(gòu)域的C端最末端的不變半胱氨酸并在此終止的約20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基(例如，SEQIDNO：52)。″至少70％″意指至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。表4提供了NaD1的C末端氨基酸序列與一些II類茄科防衛(wèi)素成熟結(jié)構(gòu)域之間的百分比同一性。II類茄科防衛(wèi)素中的環(huán)1B氨基酸序列被修飾成序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V；使用單字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，II類茄科防衛(wèi)素中的環(huán)1B序列被修飾成序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，將II類茄科防衛(wèi)素中的環(huán)1B序列修飾成序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和X6是P、V、I或N；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列?！錢1X2X3X4X5X6″意指對(duì)應(yīng)于環(huán)1B區(qū)域的6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人工產(chǎn)生的或被修飾的防衛(wèi)素包含SEQIDNO：57所示的氨基酸序列。在該序列中，環(huán)1B區(qū)域被定義為X1X2X3X4X5X6，其中：X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人工產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的防衛(wèi)素包含SEQIDNO：84所示的氨基酸序列。在該序列中，環(huán)1B區(qū)域被定義為X1X2X3X4X5X6，其中：X1是選自N、H、Q、d、K、E的氨基酸；X2是選自R、H、T、K、G的氨基酸；X3是選自F、H、YW的氨基酸；X4是選自P、K、S、R的氨基酸；X5是選自G、F的氨基酸；和X6是選自P、V、I、N的氨基酸。在NaD1(II類茄科防衛(wèi)素)的情況下，環(huán)1B氨基酸序列是NTFPGI(SEQIDNO：12)。因此，修飾NTFPGI以便N被選自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式之一的X1替代；T被選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y或V或其天然存在的修飾形式之一的X2替代；F被選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式之一的X3替代；P被選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式之一的X4替代：G被選自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式之一的X5替代；和/或I被選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V之一的X6替代；前提是所述環(huán)1B氨基酸序列不對(duì)應(yīng)于來(lái)自NaD1的環(huán)1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)1B區(qū)域被定義為X1X2X3X4X5X6，其中X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；以及X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。所述環(huán)1B序列可具有單個(gè)氨基酸改變或者可改變2或3或4或5或全部6個(gè)氨基酸。這均包括在表述″單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失″。可單獨(dú)改變環(huán)1B區(qū)域的任何數(shù)目氨基酸或結(jié)合其它突變來(lái)修飾II類茄科防衛(wèi)素。其它修飾包括氨基酸置換、添加和/或缺失。環(huán)1B區(qū)域外的突變可以為1至約50個(gè)氨基酸?！甯淖儭灏▽⒁环N防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域移植至II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域。其來(lái)源可以是I類防衛(wèi)素環(huán)1B或來(lái)自另一種II類防衛(wèi)素的環(huán)1B。這些方面基于這樣的前提，即被修飾防衛(wèi)素抗至少一種植物或動(dòng)物病原體的抗病原體活性得到維持。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于修飾前的II類防衛(wèi)素而言，抗病原體活性在活性的水平或范圍、穩(wěn)定性和/或透化作用方面得到增強(qiáng)。本文中提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中包含經(jīng)修飾的II類茄科防衛(wèi)素主鏈，其中N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域通過(guò)單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生了具有抗病原體活性的變體防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域是由第二個(gè)不變半胱氨酸殘基的N末端的6個(gè)氨基酸殘基界定的環(huán)1B。參考圖3至5。本文中涉及其在任何防衛(wèi)素中的等同區(qū)域?？蓪?duì)環(huán)1B區(qū)域進(jìn)行1至約6個(gè)氨基酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗病原體活性是抗真菌或抗昆蟲活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，相較于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素，被修飾的II類茄科防衛(wèi)素的抗病原體活性在活性的水平和/或范圍、穩(wěn)定性和/或膜透化能力等的一個(gè)或多個(gè)方面得到增強(qiáng)。本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、具有在第二個(gè)不變半胱氨酸殘基的N末端的環(huán)1B區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失而修飾了所述環(huán)1B區(qū)域，產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素?！鍐蝹€(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失″包括在表述″氨基酸置換、添加和/或缺失″中。所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素代表了防衛(wèi)素的新家族。本文中教導(dǎo)所述被修飾的防衛(wèi)素可以在園藝學(xué)和/或農(nóng)業(yè)中用于控制病原體感染和生長(zhǎng)以及用作用于動(dòng)物或人的藥劑。所述被修飾防衛(wèi)素可單獨(dú)使用，或與化學(xué)殺病原體劑、蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗病原體劑和/或絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體形式組合地使用。有一小組防衛(wèi)素可供選用能夠有助于對(duì)抗針對(duì)防衛(wèi)素的病原體抗性發(fā)展。當(dāng)與蛋白酶抑制劑或抗病原體劑組合使用時(shí)，它們可以分開地局部施用，或?qū)⒁环N在遺傳修飾的植物中表達(dá)并且另一種進(jìn)行局部施用，或?qū)⒔?jīng)修飾的防衛(wèi)素和蛋白酶抑制劑和/或抗病原體劑全部在單個(gè)或多個(gè)基因構(gòu)建體上表達(dá)?！瀛h(huán)1B″是指第二個(gè)不變半胱氨酸殘基的N末端的6個(gè)氨基酸殘基或其等同物，如圖5中描述的。一些防衛(wèi)素例如VrD1和NeThio1僅具有5個(gè)氨基酸殘基。然而，在該情況下，環(huán)1B區(qū)域包含5個(gè)殘基。其還被描述為β-鏈1與α-螺旋之間的第一個(gè)環(huán)區(qū)域。環(huán)1A(參見圖5)是β-鏈。如上文中所指出的，″氨基酸置換、添加和/或缺失″包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失，其包括用來(lái)自另一種防衛(wèi)素的環(huán)1B替換環(huán)1B。這樣的替換在本文中稱為結(jié)構(gòu)域交換、環(huán)交換、移植或其它類似的表達(dá)。″另一種防衛(wèi)素″包括任何防衛(wèi)素，無(wú)論I類還是II類防衛(wèi)素(也參見圖2)。II類防衛(wèi)素主鏈任選地還通過(guò)除去C末端尾(即CTPP)或通過(guò)用另一種尾交換現(xiàn)有CTPP來(lái)進(jìn)行修飾，和/或主鏈可在上文中提及的環(huán)區(qū)域外面的主鏈上位置處具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失?！錓I類茄科防衛(wèi)素″包括在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：52具有至少70％相似性的任何防衛(wèi)素。SEQIDNO：52代表包括NaD1成熟結(jié)構(gòu)域中的C端最末端半胱氨酸殘基并且終止于此的20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。與SEQIDNO：52具有至少70％相似性的此類II類茄科防衛(wèi)素的實(shí)例列于表4中。因此，本文中教導(dǎo)了被修飾防衛(wèi)素，其包含已對(duì)其環(huán)1B區(qū)域進(jìn)行了氨基酸置換、添加和/或缺失(以產(chǎn)生具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素)的II類茄科防衛(wèi)素主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于修飾前的II類防衛(wèi)素，抗病原體活性得到增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了被修飾的防衛(wèi)素，其包含已對(duì)其環(huán)1B區(qū)域進(jìn)行了氨基酸置換、添加和/或缺失(以產(chǎn)生具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素)的II類茄科防衛(wèi)素主鏈，所述II類茄科防衛(wèi)素包含在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：52具有至少70％相似性的其成熟結(jié)構(gòu)域的C末端區(qū)域上的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中教導(dǎo)了具有抗病原體活性的分離的II類茄科防衛(wèi)素，其包含SEQIDNO：39所示的氨基酸序列或與SEQIDNO：39具有至少70％相似性的氨基酸序列，所述修飾是對(duì)II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B氨基酸序列的氨基酸置換、添加或缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗病原體活性是抗真菌活性。本文中還教導(dǎo)了具有抗病原體活性的人工修飾的II類茄科防衛(wèi)素，其包含SEQIDNO：57所示的氨基酸序列或在在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：57具有至少70％相似性的氨基酸序列，其中所述修飾是針對(duì)II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中教導(dǎo)了具有抗病原體活性的人工修飾的II類茄科防衛(wèi)素，其包含SEQIDNO：84所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：84具有至少70％相似性的氨基酸序列，其中所述修飾是針對(duì)II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域。″至少70％相似性″包括70、71、72、73、74，75，76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的相似性。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可稱為同一性。本公開內(nèi)容還提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在該II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的第一β-鏈(β-鏈1)與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1，NsD1，NsD2，PhD1，PhD2，TPP3，F(xiàn)ST，NeThio1，NeThio2，NpThio1，Na-gth，Cc-gth，C20和SL549，其中通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失對(duì)所述環(huán)1B區(qū)域已進(jìn)行修飾，產(chǎn)生了包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失而修飾所述環(huán)1B區(qū)域，以產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且其中X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；以及X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N或其天然存在的修飾形式的氨基酸；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。本公開內(nèi)容還提供了人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在所述II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的第一β-鏈(β-鏈1)與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述環(huán)1B區(qū)域已被氨基酸置換、添加和/或缺失進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G：X5是S、K、Y、F、G或H；以及X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和/或X6是P、V、I或N，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B序列的實(shí)例包括來(lái)自NaD1(翼狀豬籠草)、NsD1(香花煙草)、NsD2(香花煙草)、NeThio2(高煙草)和FST(普通煙草)的NTFPGI；來(lái)自PhD1(矮牽牛)的PTWDSV；來(lái)自PhD2(矮牽牛)的PTWEGI；來(lái)自TPP3(番茄)的QTFPGL；來(lái)自Na-gth(N.attenuata)的NTFEGF；來(lái)自Np-Thio1(圓錐煙草)的NTFPGL；來(lái)自NeThio1(高煙草)的IFTGL和來(lái)自Cc-gth(黃燈籠辣椒)的KHFKGL。另一種環(huán)1B序列是KYFKGL(SEQIDNO：60)。本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面還涉及人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth和Cc-gth，其中防衛(wèi)素主鏈上的環(huán)區(qū)域被來(lái)自選自NaD2(HRFKGP)、Zea2(QHHSFP)、PSD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1(KTWSGN)的防衛(wèi)素的環(huán)區(qū)域或其修飾形式，或選自SEQIDNO：67至79的環(huán)1B序列替換，以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，相較于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素，抗病原體活性得到增強(qiáng)。測(cè)定增強(qiáng)的活性的參數(shù)包括活性的水平和/或范圍、穩(wěn)定性的程度和/或透化活性的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)區(qū)域是如本文中定義的環(huán)1B。這是防衛(wèi)素中的第一個(gè)柔性環(huán)。如上文中所指出的，II類茄科防衛(wèi)素上的環(huán)1B區(qū)域包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中每一個(gè)X如上文中所定義的，其中至少一個(gè)或多個(gè)在一個(gè)方面包括所有6個(gè)(或相應(yīng)地5個(gè))氨基酸殘基通常、但非排他地被替換成對(duì)應(yīng)于來(lái)自另一種防衛(wèi)素例如I類防衛(wèi)素或另一種II類防衛(wèi)素的環(huán)1B或其衍生物的序列。還提供了具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素，所述被修飾防衛(wèi)素包含：(i)來(lái)源于II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素包含位于防衛(wèi)素N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間的環(huán)1B區(qū)域；(ii)通過(guò)氨基酸置換、添加、缺失或交換而修飾的防衛(wèi)素上的環(huán)1B區(qū)域，以產(chǎn)生與另一種防衛(wèi)素環(huán)1B類似或同源或以其它方式在功能上相似的環(huán)1B區(qū)域；(iii)其中所得的環(huán)1B包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式，使用單字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。還提供了具有抗病原體活性的被修飾防衛(wèi)素，所述被修飾防衛(wèi)素包含：(i)來(lái)源于II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素在防衛(wèi)素N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間具有環(huán)1B區(qū)域；(ii)防衛(wèi)素上的環(huán)1B區(qū)域通過(guò)氨基酸置換、添加、缺失或交換而被修飾，以產(chǎn)生與另一種防衛(wèi)素環(huán)1B類似或同源或以其它方式在功能上相似的環(huán)1B區(qū)域；(iii)其中所得的環(huán)1B包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。主鏈氨基酸序列還可包含針對(duì)環(huán)1B區(qū)域之外的區(qū)域的氨基酸置換、添加和/或缺失。如果存在，可對(duì)環(huán)1B區(qū)域外的主鏈氨基酸序列產(chǎn)生約1至約50個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失?！?至50″意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的突變存在于II型茄科防衛(wèi)素的C末端尾(CTPP)中。還提供了被修飾的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自香甜煙草(澳大利亞本地的)的主鏈防衛(wèi)素分子其環(huán)1B區(qū)域或其等同物通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失進(jìn)行了修飾，以引入包含X1X2X3X4X5X6的環(huán)1B序列，其中：X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式，使用單字母氨基酸命名法，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，并且其中所述被修飾的防衛(wèi)素具有抗病原體活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述香甜煙草防衛(wèi)素選自NsD1和NsD2。另一個(gè)本文中提供的實(shí)施方案包含被修飾的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自香甜煙草(澳大利亞本地的)的主鏈防衛(wèi)素分子其環(huán)1B區(qū)域或其等同物通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失而引入包含X1X2X3X4X5X6的環(huán)1B序列，其中：X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，其中所述被修飾的防衛(wèi)素具有抗病原體活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述香甜煙草防衛(wèi)素選自NsD1和NsD2。在一個(gè)實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5X6包含氨基酸殘基，所述殘基選自：X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。在這方面，本公開內(nèi)容還提供了來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：51[NsD2]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。本文中還涉及分別編碼NsD1和NsD2的核苷酸序列例如SEQIDNO：48或SEQIDNO：50，或在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：48或SEQIDNO：50具有至少70％同一性的核苷酸序列，或能夠在中等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：48或SEQIDNO：50或者SEQIDNO：48或SEQIDNO：50的互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列?！逯辽?0％的同一性″意指至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、988、99或100％。在一個(gè)方面，相較于修飾前的NsD1或NsD2，抗病原體活性在活性的范圍或水平、穩(wěn)定性水平和/或誘導(dǎo)透化的能力方面得到增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，II類防衛(wèi)素上的環(huán)區(qū)域被X1X2X3X4X5X6置換，其中：X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和/或X6是P、V、I或N，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。只要主鏈防衛(wèi)素是NaD1，則可修飾環(huán)1B，其中修飾包括：用選自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換N；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換T；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換F；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換P；用選自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換G；和/或用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換I，其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于來(lái)自NaD1的環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。只要主鏈防衛(wèi)素是NaD1，則可修飾環(huán)1B，其中修飾包括如下修飾的一個(gè)或多個(gè)：用選自G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、T和R的氨基酸殘基置換N；用選自K、R、G、H、L、N、F、I、S和Y的氨基酸殘基置換T；用選自W、Y、H、L、G和P的氨基酸殘基置換F；用選自K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G的氨基酸殘基置換P；用選自S、K、Y、F和H的氨基酸殘基置換G；和/或用選自P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H和Y的氨基酸殘基置換I。在一個(gè)實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5X6包含氨基酸殘基，所述殘基選自：X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；和X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。X1至X6的“一個(gè)或多個(gè)”意指修飾1或2或3或4或5或所有6個(gè)氨基酸殘基。如果存在的話，環(huán)1B區(qū)域外的突變包括1至約50個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失?！宀≡w″包括真菌、微生物(包括細(xì)菌)、昆蟲、蜘蛛、病毒和線蟲以及原生動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病原體是真菌或昆蟲?！逭婢灏ǜ腥局参锘騽?dòng)物以及另外地為植物或動(dòng)物的病原體的真菌。動(dòng)物的真菌病原體包括哺乳動(dòng)物(包括人)的真菌病原體。具體的真菌病原體包括禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)、玉蜀黍殼色單隔孢(Diplodiamaydis)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)和輪枝樣鐮孢(Fusariumverticilloides)。主要農(nóng)作物的具體病原體包括：玉米：玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)(禾谷鐮孢)、禾生刺盤孢、玉米狹殼柱孢(Stenocarpellamaydi)(玉蜀黍殼色單隔孢(Diplodiamaydis))、亞粘團(tuán)串珠鐮孢(Fusariummoniliformevar.subglutinans)、輪枝樣鐮孢、玉蜀黍平臍蠕孢菌O、T(BipolarismaydisO、T)(異旋孢腔菌(Cochliobolisheterostrophus))、玉米大斑菌I、II和III、玉米尾孢(Cercosporazeae-maydis)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、禾生腐霉(Pythiumgraminicola)、華麗腐霉(Pythiumsplendens)、終極腐霉(Pythiumultimum)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、曲霉屬的種(Aspergillusspp)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、炭色長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporiumcarbonum)I、II和III(炭色旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum))、Helminthosporiumpedicellatum、玉蜀黍節(jié)壺菌(Physodermamaydis)、玉米葉點(diǎn)霉(Phyllostictamaydis)、玉米球梗孢(Kabatiellamaydis)、高粱尾孢(Cercosporasorghi)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、玉米黑粉菌(Ustilagozeae)、玉米柄銹菌(Pucciniasorghi)、多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、稻黑孢(Nigrosporaoryzae)、草本枝孢(Cladosporiumherbarium)、新月彎孢(Curvularialunata)、不等彎孢(Curvulariainaequalis)、蒼白彎孢(Curvulariapallescens)、綠色木霉(Trichodermaviride)、玉米麥角(Clavicepssorghi)、大孢色二孢(Diplodiamacrospora)、水稻霜霉病(Sclerophthoramacrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerosporasorghi)、菲律賓指霜霉(Peronosclerosporaphilippinensis)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerosporamaydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerosporasacchari)、絲軸黑粉菌(Sphacelothecareiliana)、玉米殼銹菌(Physopellazeae)、玉蜀黍頭孢(Cephalosporummaydis)、頂頭孢(Cephalosporumacremonium)；大豆：枝狀鐮孢…、茄腐鐮孢…、核盤菌、尖鐮孢、Fusariumtucumaniae、豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi)、大豆疫霉(Phytophthoramegaspermaf.sp.glycinea)、大豆疫霉(Phytophthorasojae)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、菜豆間座殼大豆種(Diaporthephaseolorumvar.sojae)(大豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissojae))、菜豆間座殼種花椰菜(Diaporthephaseolorumvar.caulivora)、齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、菊池尾孢(Cercosporakikuchii)、大豆尾孢(Cercosporasojina)、大豆霜霉病菌(Peronosporamanshurica)、束狀刺盤孢(Colletotrichumdematium)(平頭刺盤孢(Colletotrichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)、大豆殼針孢(Septoriaglycines)、大豆生葉點(diǎn)霉(Phyllostictasojicola)、鏈格孢(Alternariaalternata)、彌漫叉絲殼(Microsphaeradiffusa)、半裸鐮孢(Fusariumsemitectum)、大豆瓶霉(Phialophoragregata)、大豆小絲殼(Glomerellaglycines)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、終極腐霉(Pythiumultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)；蕓苔：白銹菌(Albugocandida)、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)、油菜小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、核盤菌、蕓苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassicicola)、終極腐霉(Pythiumultimum)、寄生霜霉(Peronosporaparasitica)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、鏈格孢(Alternariaalternata)；棉花：棉花尖鐮孢(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、大麗花輪枝孢(Verticilliumdahliae)、根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)、大孢鏈格孢(Alternariamacrospora)、棉尾孢(Cercosporagossypina)、短小莖點(diǎn)霉(Phomaexigua)(棉殼二胞菌(Ascochytagossypii))、腐霉屬的種、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、Pucciniascheddardii、Pucciniacacabata、Phymatotrichopsisomnivore；蕓苔：油菜小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、核盤菌、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)、黑斑病菌(Alternariabrasicicola)、蕓苔根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、鐮孢屬(Fusarium)的種、腐霉屬的種、疫霉屬(Phytophthora)的種、鏈格孢屬(Alternaria)的種、寄生霜霉(Peronosporaparasitica)、Mycosphaerellacapsellae(蕓苔假小尾孢(Pseudocercosporellacapsellae))、白銹菌(Albugocandida)、大雄疫霉(Phytophtohoramegaspermavar.megasperma)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、十字花科白粉菌(Erysiphecruciferarum)；小麥：麥根腐平臍蠕孢(Cochliobolussativus)、Drechslerawirreganensis、禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、Phaeosphaeriaavenariaf.sp.triticea、小麥小暗球殼(Phaeosphaerianodorum)、布氏禾白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、冰草條黑粉菌(urocystisagropyri)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、禾黑芽枝霉菌(Cladosporiumherbarum)、禾谷鐮孢、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、尖鐮孢(Fusariumculmorum)、小麥冠腐病菌(Fusariumpseudograminearum)、小麥散黑粉病菌(Ustilagotritici)、Ascochytatritici、谷頭孢菌(Cephalosporiumgramineum)、禾生刺盤孢、白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.tritici)、大麥抗禾柄銹菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)、小麥葉銹菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)、小麥條銹菌(Pucciniastriiformis)、小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)、水稻霜霉病(Sclerophthoramacrospora)、冰草條黑粉菌(Urocystisagropyri)、小麥黃斑枯葉菌(Pyrenophoratritici-repentis)、小麥不孕病菌(Pyrenophorasemeniperda)、小麥葉枯病菌(Phaeosphaerianodorum)、小麥穎枯病菌(Septorianodorum)、小麥葉斑病病原菌(Septoriatritici)、燕麥亮針抱菌(Septoriaavenae)、小麥基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、腐霉(Pythiumspp)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、Pythiumarrhenomannes、Pythiumgramicola、終極腐霉(Pythiumultimum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、麥角菌(Clavicepspurpurea)、Tapesiayallundae、小麥光腥黑穗菌(Tilletiatritici)、Tilletialaevis、小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(Tilletiacaries)、小麥印度腥黑穗病菌(Tilletiaindica)、小麥散黑粉病菌(Ustilagotritici)、Wojnowiciagraminis、麥根腐平臍蠕孢(Cochliobolussativus)；高粱：玉米大斑菌(Exserohilumturcicum)、炭疽病菌(Colletotrichumsublineolum)、高粱尾孢(Cercosporasorghi)、Gloeo高粱尾孢(Cercosporasorghi)、高粱粗斑殼二孢(Ascochytasorghina)、紫柄銹菌(Pucciniapurpurea)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、粱黑蔥花霉(Perconiacircinata)、串珠鐮孢霉菌(Fusariummoniliforme)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、高粱平臍蠕孢菌(Bipolarissorghicola)、長(zhǎng)蠕孢菌(Helminthosporiumsorghicola)、新月彎孢霉(Curvularialunata)、高粱莖點(diǎn)霉(Phomainsidiosa)、高梁類斑點(diǎn)病菌(Ramulisporasorghi)、高粱紫輪病菌(Ramulisporasorghicola)、Phyllacharasaccari、玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)(玉米絲黑穗病菌(Sphacelothecareiliana))、高粱散黑粉菌(Sphacelothecacruenta)、高粱堅(jiān)孢堆黑粉菌(Sporisoriumsorghi)、蘇丹草紫斑病(Clavicepssorghi)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、枝頂孢霉(Acremoniumstrictum)、小麥霜霉病菌(Sclerophthonamacrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerosporasorghi)、菲律賓指霜霉(Peronosclerosporaphilippinensis)、禾生指梗霉(sclerosporagraminicola)、禾谷鐮孢、尖鐮孢、雄腐霉(Pythiumarrhenomanes)、禾生腐霉(Pythiumgraminicola)；向日葵：向日葵單軸霉(Plasmoparahalstedii)、核盤菌、殼針孢菌(Septoriahelianthi)、向日葵莖潰瘍病菌(Phomopsishelianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternariahelianthi)、百日草鏈格孢菌(Alternariazinniae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、莖點(diǎn)霉黑莖病菌(Phomamacdonaldii)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、菊科白粉菌(Erysiphecichoracearum)、米根霉(Rhizopusoryzae)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、Pucciniahelianthe、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、頂頭孢霉菌(Cephalosporumacremonium)、隱地疫霉(Phytophthoracryptogea)、婆羅門參白銹菌(Albugotragopogonis)；苜蓿：終極腐霉(Pythiumultimum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、華麗腐霉(Pythiumsplendens)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、大豆疫病菌(Phytophthoramegasperma)、三葉草霜霉菌(Peronosporatrifoliorum)、Phomamedicaginisvar.medicaginis、苜蓿尾孢菌(Cercosporamedicaginis)、苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)、苜蓿黃斑病菌(Leptotrochilamedicaginis)、尖鐮孢、黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)、根腐絲囊霉(Aphanomyceseuteiches)、Stemphyliumherbarum、StemphyliumAlfalfa、三葉草炭疽病菌(Colletotrichumtrifolii)、苜蓿小光殼(Leptosphaerulinabriosiana)、條紋單胞銹菌(Uromycesstriatus)、三葉草核盤菌(Sclerotiniatrifoliorum)、草木樨殼多孢菌(Stagonosporameliloti)、蔥葉枯匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)和Leptotrichilamedicaginis。在一個(gè)實(shí)施方案中，玉米中的真菌病原體包括禾谷鐮孢、禾生刺盤孢、玉蜀黍殼色單隔孢、輪枝樣鐮孢、Cochliobolisheterostrophus、玉米大斑病菌，玉米尾孢菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，大豆中的真菌病原體包括Fusariumvirguliforme、腐皮鐮孢、核盤菌、尖鐮孢、Fusariumtucumaniae、豆薯層銹菌。動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物，特別地人)真菌病原體包括鏈格孢屬的種(Alternaeriaspp)、曲霉屬的種(Aspergillusspp)、假絲酵母屬某些種)Candidaspp)、鐮孢屬的種(Fusariumspp)、發(fā)癬菌屬的種(Trychophytonspp)、隱球酵母屬的種(Cryptococcusspp)、小孢霉屬的種(Microsporumspp)、青霉屬的種(Penicilliumspp)、絲孢酵母的種(Trichosporonspp)、絲孢菌屬的種(Scedosporiumspp)、擬青霉屬的種(Paeciliomycesspp)，支頂孢屬某些種(Acremoniumspp)和暗色霉。具體動(dòng)物、包括哺乳動(dòng)物、特別地人病原體包括煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、Aspergillusparaciticus、白色假絲酵母(Candidaalbicans)、都柏林假絲酵母(Candidadubliniensis)、無(wú)名假絲酵母(Candidafamata)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondii)、希木龍假絲酵母(Candidahaemulonii)、乳酒假絲酵母(Candidakefyr)、克魯斯假絲酵母(Candidakrusei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、挪威假絲酵母(Candidanorvegensis)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、維斯假絲酵母(Candidaviswanathii)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、茄腐鐮孢(Fusariumsolani)、串株鐮孢(Fusariummonoliforme)、紅色毛癬菌(Trycophytonrubrum)、須癬毛癬菌(Trycophytonmentagrophytes)、Trycophytoninterdigitales、斷發(fā)毛癬菌(Trycophytontonsurans)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、隱球酵母(Cryptococcusgattii)、Cryptococcusgrubii、犬小孢霉(Microsporumcanis)、石膏樣小孢霉(MicrosporumgyPseum)、馬爾尼菲青霉(Penicilliummarneffei)、白吉爾毛孢子菌(Tricosporonbeigelii)、阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)、墨汁絲孢酵母(Trichosporoninkin)、星狀絲孢酵母(Trichosporonasteroides)、皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)、Trichosporondomesticum、粘性絲孢酵母(Trichosporonmucoides)、卵形絲孢酵母(Trichosporonovoides)、茁芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans)、Trichosporonloubieri、日本絲孢酵母(Trichosporonjaponicum)、尖端賽多孢子菌(Scedosporiumapiospermum)、多育賽多孢(Scedosporiumprolificans)、宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、枝頂孢霉(Acremoniumstricutm)、斑替枝孢霉(Cladophialophorabantiana)、皮炎外瓶霉(Wangielladermatitidis)、Ramichloridiumobovoideum、Chaetomiumatrobrunneum、Dactlariagallopavum、平臍蠕孢屬(Bipolarisspp)、嘴突臍孢(Exserohilumrostratum)以及傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)、精美尖端節(jié)腫霉(Apophysomyceselegans)、印度毛霉菌(Mucorindicus)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、灰色小克銀漢霉(Cunninghamellabertholletiae)、Cokeromycesrecurvatus、Saksenaeavasiformis、總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)、蛙糞霉(Basidiobolusranarum)、冠狀耳霉(Conidioboluscoronatus)/異孢耳霉(Conidiobolusincongruus)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、Coccidioidesposadasii、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、波氏足腫菌(Pseudallescheriaboydii)和申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)?！逭婢暹€包括卵菌綱(oomycetes)例如腐霉屬的種和疫霉屬的種。術(shù)語(yǔ)″真菌″還包括銹菌屬。細(xì)菌性病原體包括黃單胞菌屬(Xanthomonas)的種和假單胞菌屬(Pseudomonas)的種。其它微生物包括植原體屬(Phytoplasma)的種和螺原體屬(Spiroplasma)的種。其它病原體包括病毒、線蟲和原生動(dòng)物。昆蟲病原體包括巨座玉米螟、玉米螟蛾、縊管蚜的種、夜蛾屬的種、小菜蛾和盲蝽屬的種。本文中還提供了編碼所述被修飾的II類茄科防衛(wèi)素的分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼SEQIDNO：57所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼SEQIDNO：84所示的氨基酸序列的核苷酸序列。因此，提供了編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含：(i)來(lái)源于或?qū)?yīng)于II類茄科防衛(wèi)素的氨基酸主鏈；(ii)經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)如下修飾的主鏈上的環(huán)1B或其等同物：(a)氨基酸置換、添加和/或缺失；和/或(b)被來(lái)自另一種防衛(wèi)素的環(huán)1B或其修飾形式全部或部分地替換；和任選地(c)在主鏈上環(huán)1B區(qū)域外的另外的氨基酸置換、添加和/或缺失；其中所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素展示具有抗病原體活性的環(huán)1B。本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面是編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，具有在II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間的環(huán)區(qū)域，其中所述環(huán)區(qū)域通過(guò)氨基酸置換、添加和/或缺失而被修飾，以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)方面，所述環(huán)區(qū)域是環(huán)1B。另一個(gè)方面涉及編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，其具有在II類茄科防衛(wèi)素N末端部分上的p-鏈1與o-螺旋之間的環(huán)1B區(qū)域，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中所述環(huán)1B區(qū)域已被氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾，從而產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且其中X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而人工地產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5X6包含如下氨基酸序列，其中X1是選自L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G的氨基酸殘基；X2是選自S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G的氨基酸；X3是選自A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H的氨基酸；X4是選自K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S的氨基酸；X5是選自M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F的氨基酸；以及X6是選自V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N的氨基酸。另一個(gè)方面涉及編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，其具有在II類茄科防衛(wèi)素N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間的環(huán)1B區(qū)域，所述防衛(wèi)素具有與SEQIDNO：52具有至少70％相似性的成熟結(jié)構(gòu)域的C末端氨基酸序列，其中環(huán)1B區(qū)域已被氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾，從而產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且其中X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。另一方面涉及編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述防衛(wèi)素具有來(lái)源于香甜煙草防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，其環(huán)1B區(qū)域或其等同物已被單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾，從而產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而人工地產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。香甜煙草的防衛(wèi)素的實(shí)例包括NsD1和NsD2。另一個(gè)方面還提供了編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的分離的核酸分子，所述防衛(wèi)素具有來(lái)源于香甜煙草防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，其環(huán)1B區(qū)域或其等同物已被單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾，從而產(chǎn)生包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的區(qū)域，其中X1至X6的每一個(gè)是氨基酸殘基，并且X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列，從而人工地產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。香甜煙草的防衛(wèi)素的實(shí)例包括NsD1和NsD2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子編碼人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在茄科防衛(wèi)素N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間具有環(huán)1B區(qū)域的主鏈氨基酸序列，所述防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20和SL549，其中II類茄科防衛(wèi)素主鏈上的環(huán)1B區(qū)域被來(lái)自選自NaD2(HRFKGP)、Zea2(QHHSFP)、PsD1(DTYRGV)、MsDef1(DKYRGP)、SoD2(KTFKGI)和DmAMP1(KTWSGN)的防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域或者選自SEQIDNO：67至79的環(huán)1B序列替換，以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)″相似性″包括在核苷酸或氨基酸水平上比較的序列之間的確切同一性。當(dāng)在核苷酸水平上存在不相同時(shí)，“相似性”包括序列之間導(dǎo)致不同的、然而在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸的差異性。當(dāng)在氨基酸水平上存在不相同時(shí)，“相似性，，包括在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)的氨基酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在同一性而相似性水平上進(jìn)行核苷酸和序列比較。用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括″參照序列″、″比較窗口″、″序列相似性″、″序列同一性″、″序列相似性百分比″、″序列同一性百分比″、″大體上相似的″和″大體上同一的″?！鍏⒄招蛄小逶陂L(zhǎng)度上為至少12個(gè)單體單位，包括核苷酸和氨基酸殘基，但常常是15至18個(gè)，通常至少25個(gè)或以上，例如30個(gè)。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可能各自包含(1)在這兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即僅整個(gè)多核苷酸序列的一部分)，和(2)在兩個(gè)多核苷酸之間有差異的序列，因此兩個(gè)(或更多個(gè))多核苷酸之間的序列比較通常通過(guò)在“比較窗口，，中比較這兩個(gè)多核苷酸的序列以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域來(lái)進(jìn)行?！灞容^窗口″是指與參照序列相比較的通常具有12個(gè)連續(xù)殘基的假想?yún)^(qū)段。比較窗口相較于參照序列(其不包含添加或缺失)可包含約20％或更少的添加或缺失(即缺口)，以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)?？赏ㄟ^(guò)算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(WisconsinGeneticssoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDriveMadison，WI，USA)或通過(guò)目測(cè)以及利用任何所選擇的各種方法產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在比較窗口中導(dǎo)致最高百分比同源性)進(jìn)行用于對(duì)齊比較窗口的序列最佳比對(duì)。還可參考如例如由Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25：3389)公開的程序的BLAST家族。序列分析的詳細(xì)論述可見于Ausubel等人(1998)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley＆SonsInc.1994-1998的單元19.3中。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)″序列相似性″和″序列同一性″是指序列在比較窗口中基于逐個(gè)核苷酸或逐個(gè)氨基酸的比較而相同或在功能上或結(jié)構(gòu)上相似的程度。因此，″序列同一性的百分比″例如可通過(guò)如下步驟進(jìn)行計(jì)算：在比較窗口中比較兩個(gè)最佳對(duì)齊的序列，測(cè)定在其上在兩個(gè)序列中都存在相同核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如A1a、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)(即，窗口大小)，然后將結(jié)果乘以100而得到序列同一性百分比。為了本公開內(nèi)容的目的，″序列同一性″應(yīng)理解為表示使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值(如隨軟件所附的參考手冊(cè)中使用的)通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)程序(對(duì)于windows，2.5版；可從HitachiSoftwareengineeringCo.，Ltd.，SouthSanFrancisco，California，USA獲得)計(jì)算的“匹配百分比”。關(guān)于序列相似性，應(yīng)用類似的注釋?！逯辽?0％″意指70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％。本公開內(nèi)容擴(kuò)展至在低嚴(yán)格條件下與編碼所述被修飾的防衛(wèi)素的核酸分子雜交的核酸分子。嚴(yán)格度條件可以通過(guò)例如預(yù)雜交和雜交溶液中的鹽或甲酰胺濃度，或雜交溫度來(lái)確定，并且在本領(lǐng)域是公知的。例如，嚴(yán)格度可通過(guò)降低鹽的濃度，增加甲酰胺的濃度，或升高雜交溫度，改變雜交時(shí)間來(lái)提高，如下文中詳細(xì)描述的。在一些可選擇的方面，本公開內(nèi)容的核酸通過(guò)它們?cè)诟鞣N嚴(yán)格度條件(例如高、中和低)下雜交的能力來(lái)定義。本文中提及的″低嚴(yán)格度″包括且包含至少約0至至少約15％v/v的甲酰胺和至少約1M至至少約2M的鹽用于雜交，以及至少約1M至至少約2M的鹽用于清洗條件。通常地，低嚴(yán)格度是在約25-30℃至約42℃。溫度可被改變，更高的溫度用于替代甲酰胺和/或提供另外的嚴(yán)格度條件。需要時(shí)可應(yīng)用另外的嚴(yán)格度條件，例如“中等嚴(yán)格度”，其包括且包含至少約16％v/v至至少約30％v/v的甲酰胺以及至少約0.5M至至少約0.9M的鹽用于雜交，和至少約0.5M至至少約0.9M的鹽用于清洗條件，或″高度嚴(yán)格度″，其包括且包含至少約31％v/v至至少約50％v/v的甲酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用于雜交以及至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用清洗條件。一般而言，進(jìn)行清洗，Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty(1962)JMolBiol5：109-118)。然而，隨著錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目每增加1％，則雙鏈體核酸分子的Tm就下降1℃(Bonner和Laskey(1974)EurJBiochem46：83-88)。甲酰胺在此類雜交條件下是任選的。因此，嚴(yán)格度的特別優(yōu)選水平定義如下：低嚴(yán)格度為6xSSC緩沖液，0.1％w/vSDS，于25-42℃；中等嚴(yán)格度為2xSSC緩沖液，0.1％w/vSDS，于20℃至65℃范圍內(nèi)的溫度；高嚴(yán)格度為0.1xSSC緩沖液，0.1％w/vSDS，于至少65℃的溫度。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)″序列相似性″和″序列同一性″是指序列在比較窗口中基于核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的比較而相同或在功能上或結(jié)構(gòu)上相似的程度。因此，″序列同一性百分比″例如可通過(guò)如下步驟進(jìn)行計(jì)算：在比較窗口中比較兩個(gè)最佳對(duì)齊的序列，測(cè)定在其上在兩個(gè)序列中都存在相同核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)(即，窗口大小)，然后將結(jié)果乘以100來(lái)產(chǎn)生序列同一性百分比。為了本公開內(nèi)容的目的，″序列同一性″應(yīng)理解為表示使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值(如隨軟件所附的參考手冊(cè)中使用的)通過(guò)DNASIs計(jì)算機(jī)程序(對(duì)于windows，2.5版；可從HitachiSoftwareengineeringCo.，Ltd.，SouthSanFrancisco，california，USA獲得)計(jì)算的“匹配百分比”。關(guān)于序列相似性，應(yīng)用類似的注釋。本文中教導(dǎo)的核酸分子還能夠與其它遺傳分子雜交。本文中提及″雜交″是指核酸鏈籍由堿基配對(duì)而與互補(bǔ)鏈聯(lián)結(jié)的過(guò)程。雜交反應(yīng)可以是敏感性的和選擇性的，從而特定目標(biāo)序列即便在樣品中以低濃度存在時(shí)亦可鑒定出。嚴(yán)格條件可通過(guò)例如預(yù)雜交和雜交濃度中鹽或甲酰胺的濃度，或通過(guò)雜交溫度來(lái)確定，并且在本領(lǐng)域是公知的。例如，嚴(yán)格度可通過(guò)降低鹽的濃度，增加甲酰胺的濃度，或升高雜交溫度，改變雜交時(shí)間來(lái)提高，如下文中詳細(xì)描述的。在可選擇的方面，本發(fā)明的核酸通過(guò)它們?cè)诟鞣N嚴(yán)格度條件(例如高、中和低)下雜交的能力來(lái)定義。所述分離的核酸分子還可存在于載體(包括表達(dá)或轉(zhuǎn)移載體)中，所述載體適用于植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞和非人動(dòng)物細(xì)胞的。″載體″包括多基因表達(dá)載體(MGEV)，例如PCT/AU02/00123所描述的載體。根據(jù)后一方面，提供了包含具有2至8個(gè)結(jié)構(gòu)域區(qū)段的多核苷酸的多基因表達(dá)載體(MGEV)，其中其中每一個(gè)結(jié)構(gòu)域編碼功能性蛋白質(zhì)，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)接頭區(qū)段連接至線性序列中的下一個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域和區(qū)段全都存在于相同閱讀框架中，并且其中結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)是本文中描述的被修飾II類茄科防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)其它結(jié)構(gòu)域是蛋白酶抑制劑或其前體。在另一個(gè)實(shí)施方案，至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域是本文中涉及的被修飾II類茄科防衛(wèi)素，并且至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域是蛋白酶抑制劑或其前體形式。″蛋白酶抑制劑″包括絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑?？蓪⒕幋a所述被修飾的防衛(wèi)素的核酸序列與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列(啟動(dòng)子、終止子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽等)組合整合進(jìn)入DNA構(gòu)建體或載體。還可將核酸有效地連接至異源啟動(dòng)子。對(duì)于一些應(yīng)用，可將編碼被修飾的防衛(wèi)素的核酸序列插入表達(dá)另一種蛋白質(zhì)的編碼區(qū)內(nèi)以形成防衛(wèi)素融合蛋白，或可將其用于替代蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域以為該蛋白質(zhì)提供抗病原體活性。可將所述核酸序列置于可以為組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(通過(guò)例如環(huán)境條件、病原體的存在、化學(xué)藥品的存在所刺激)的同源或異源啟動(dòng)子的控制之下。轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)于所述被修飾的防衛(wèi)素可以是同源的或異源的，并且被選擇用來(lái)確保分泌至期望的細(xì)胞器或細(xì)胞外空間。轉(zhuǎn)運(yùn)肽可與特定的防衛(wèi)素天然關(guān)聯(lián)?？蓪⑦@樣的DNA構(gòu)建體克隆或轉(zhuǎn)化進(jìn)入允許所編碼的被修飾防衛(wèi)素或防衛(wèi)素的活性部分表達(dá)的生物系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)纳锵到y(tǒng)包括微生物(例如，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、內(nèi)生菌(endophyte)例如木質(zhì)棍狀桿菌犬齒亞種(Clavibacterxylisubsp.cynodontis(Cxc))；酵母；病毒；噬菌體；等)、培養(yǎng)細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和植物。在一些情況下，隨后提取和分離表達(dá)的防衛(wèi)素以待使用。本文中教導(dǎo)的被修飾防衛(wèi)素可用于抗擊植物和動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物，例如人)的病原體疾病。因此，所述被修飾的II類茄科防衛(wèi)素具有園藝和農(nóng)業(yè)應(yīng)用以及用作動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物例如人使用的藥劑。還提供了抗擊病原體的方法，通過(guò)該方法使所述病原體暴露于本文中描述的被修飾的防衛(wèi)素?？梢砸越M合物的形式使用該被修飾的防衛(wèi)素?？蓡为?dú)地使用被修飾防衛(wèi)素或與化學(xué)殺病原體劑、抗病原體蛋白和/或II型絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體形式組合地使用。雖然本文中描述的被修飾防衛(wèi)素對(duì)于保護(hù)植物免受病原體感染、生長(zhǎng)、維持或傳播是有用的，但被修飾防衛(wèi)素還可用作藥劑，包括局部藥劑，用于非植物，例如動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物例如人。因此，本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面是組合物，其包含本文中描述的被修飾防衛(wèi)素和一種或多種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上或園藝學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，和/或一種或多種其它抗病原體劑例如化學(xué)殺病原體劑、蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗病原體劑和/或蛋白酶抑制劑或其前體形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物以噴霧劑、霧化劑(mist)、微顆?；蚣{米顆粒、水溶液、粉劑、乳膏、軟膏劑、凝膠、加固繃帶、液體、制劑、涂劑(paint)或其它適當(dāng)?shù)姆峙浣橘|(zhì)(distributionmedium)的形式，包括組合物的口服形式存在。對(duì)于藥物應(yīng)用，可將被修飾防衛(wèi)素(包括源自其的任何產(chǎn)物)用作殺抗原體劑或病原體抑制劑(pathogenostat)以治療哺乳動(dòng)物感染(例如，以抗擊酵母例如假絲酵母)。根據(jù)本公開內(nèi)容的被修飾防衛(wèi)素(包括源自其的任何產(chǎn)物)也可用作防腐劑(例如，作為食品添加劑)或用作為土壤或生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備程序的部分。對(duì)于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，可將被修飾防衛(wèi)素用于在植物的生命過(guò)程中提高農(nóng)作物的抗病性或疾病耐受性或用于收獲后農(nóng)作物的保護(hù)。暴露于所述肽的病原體被抑制。該被修飾防衛(wèi)素可根除已在植物上建立的病原體或可保護(hù)植物免受未來(lái)的病原體攻擊。肽的根除劑作用是特別有利的。″植物″包括農(nóng)作物植物例如高粱、小麥、大麥、玉蜀黍、棉花、稻、蕓苔、玉米、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁(almond)、蘋果、蘆筍、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蠶豆、腰果、木薯、鷹嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、無(wú)花果、亞麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄欖、洋蔥、豌豆、堅(jiān)果、梨，非洲稷(pearlmillet)、馬鈴薯、油菜、黑麥草、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、芋頭、茶葉、煙草、西紅柿、黑小麥、塊菌(truffle)和山藥(yam)。植物病原體對(duì)被修飾防衛(wèi)素的暴露可以以各種方式實(shí)現(xiàn)，例如：(a)可使用標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)技術(shù)(例如噴霧法)，將被修飾防衛(wèi)素施用于植物部分或植物的根周圍的土壤或其它生長(zhǎng)介質(zhì)，或在播種其之前施用于植物的種子?？梢曰瘜W(xué)合成防衛(wèi)素或可從經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)所述蛋白質(zhì)的微生物或植物提取防衛(wèi)素。可將所述蛋白質(zhì)以組合物(其包含與固體或液體稀釋劑以及任選地各種佐劑例如表面活性劑混合的防衛(wèi)素)的形式施用于植物或植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基。固體組合物可以以可分散性粉劑、粒劑或顆粒形式存在。(b)可將包含經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)所述抗病原體的防衛(wèi)素的微生物的組合物施用于植物或植物在其中生長(zhǎng)的土壤。(c)可將經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)抗病原體的防衛(wèi)素的內(nèi)生菌引入植物組織(例如，通過(guò)種子處理方法)。內(nèi)生菌被定義為能夠與植物宿主建立非致病性內(nèi)共生關(guān)系的微生物。對(duì)植物進(jìn)行內(nèi)生菌增強(qiáng)的保護(hù)作用的方法已描述在CropGeneticsInternationalCorporation擁有的一系列專利申請(qǐng)(例如，國(guó)際申請(qǐng)公開號(hào)WO90/13224、歐洲專利公開號(hào)EP-125468-B1、國(guó)際申請(qǐng)公開號(hào)WO91/10363、國(guó)際申請(qǐng)公開號(hào)WO87/03303)中?？蓪?duì)內(nèi)生菌進(jìn)行遺傳修飾以產(chǎn)生農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品。國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO94/16076(ZENECALimited)描述了使用已被遺傳修飾而表達(dá)植物來(lái)源的抗真菌肽的內(nèi)生菌。(d)可將編碼抗病原體防衛(wèi)素的DNA引入植物基因組，使得所述肽在植物體內(nèi)表達(dá)(DNA可以是cDNA、基因組DNA或使用標(biāo)準(zhǔn)核酸合成儀制造的DNA)。對(duì)于包含本文中描述的被修飾防衛(wèi)素的組合物，通常包括載體、賦形劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或固體或液體添加劑。任選地，還包括另一種抗病原劑。組合物可采取多種形式，這取決于期望的施用方法。一般而言，但非排他地，將局部組合物用于植物和動(dòng)物。在制備組合物時(shí)，可使用常用介質(zhì)，例如水、甘油、油、醇、防腐劑和/或著色劑。組合物可采取液體制劑的形式，例如懸浮劑、酏劑和溶液。還可使用載體例如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、?；瘎?rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。組合物還可以以粉劑、膠囊劑和片劑形式存在。可將本文中的被修飾防衛(wèi)素直接施用至植物或其部分，或施用至根系或根系周圍的土壤或介質(zhì)，或施用至動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物例如人)的皮膚、毛發(fā)或毛皮。當(dāng)通過(guò)氣溶膠或噴霧劑施用時(shí)，按照農(nóng)業(yè)和藥物配制領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)制備所述組合物，可使用苯甲醇或其它適當(dāng)?shù)姆栏瘎⒃鰪?qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、氟碳化合物和/或本領(lǐng)域已知的其它增溶劑或分散劑，將組合物制備為鹽水中的溶液。取決于使用的具體防衛(wèi)素、施用模式、待治療的病原體和病原體感染的嚴(yán)重度，所述被修飾防衛(wèi)素的有效劑量可變化。因此，根據(jù)許多因素包括植物或受試者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)療狀況；待治療的病況的嚴(yán)重度；施用途徑以及使用的具體防衛(wèi)素來(lái)選擇利用被修飾防衛(wèi)素的給藥方案。普通技術(shù)的園藝家、內(nèi)科醫(yī)生、臨床醫(yī)生或獸醫(yī)可容易地確定和開具防止、對(duì)抗或阻止病原體感染進(jìn)展所需的防衛(wèi)素的有效量。本文中還涉及緩釋制劑。提供了具有適當(dāng)包衣的錠劑核芯。為此目的，可使用濃縮的糖溶液，所述溶液可任選地包含阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡喀烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液(1acquersolution)和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蛏靥砑又疗瑒┗蝈V劑包衣中以便鑒別或表征活性化合物劑量的不同組合。防衛(wèi)素制劑包括由明膠制備的推入配合膠囊(push-fitcapsule)以及由明膠和塑化劑例如甘油或山梨醇制備的軟密封膠囊中。推入配合膠囊可包含與填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉和/或潤(rùn)滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可被溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)囊后w，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可添加穩(wěn)定劑。被修飾的防衛(wèi)素組合物或編碼所述被修飾防衛(wèi)素組合物的表達(dá)載體還可包含另一種抗病原體物質(zhì)，例如另一種防衛(wèi)素或抗病原體蛋白質(zhì)或肽，或化學(xué)殺病原體劑或蛋白酶抑制劑或其前體形式。本文中教導(dǎo)的另一個(gè)方面包括用于治療或預(yù)防植物感染病原體的方案或方法，所述方案或方法包括單獨(dú)地或與另一種抗病原體劑一起地給植物或其部分或給植物周圍的土壤或生長(zhǎng)支持介質(zhì)施用抗病原體有效量的包含本文中描述的被修飾防衛(wèi)素的組合物。另一個(gè)方面提供了用于治療或預(yù)防感染或侵染了病原體的動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物，例如人受試者)的方案或方法，所述方案或方法包括給受試者施用抗病原體有效量的包含本文中描述的被修飾防衛(wèi)素的組合物。術(shù)語(yǔ)″施用″包括接觸和暴露。可將被修飾防衛(wèi)素單獨(dú)地或與促進(jìn)被修飾防衛(wèi)素進(jìn)入病原體的其它抗病原體劑或藥劑一起使用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可按照多種已知的方法(土壤桿菌Ti質(zhì)粒、電穿孔、顯微注射、基因槍(microprojectilegun)等)利用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞?？稍谶m當(dāng)?shù)那闆r下將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成其中新的核物質(zhì)被穩(wěn)定地整合進(jìn)入基因組的完整植物?？梢砸栽摲绞将@得轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物，雖然后者通常更容易再生。此類原代轉(zhuǎn)化體的一些后代遺傳了編碼該抗病原體防衛(wèi)素的重組DNA。本公開內(nèi)容還提供了對(duì)病原體具有提高的抗性、并且包含表達(dá)被修飾II類茄科防衛(wèi)素的重組DNA的植物。這樣的植物可在標(biāo)準(zhǔn)植物育種雜交中用作親代來(lái)開發(fā)具有病原體(包括真菌)抗性的雜種和品系。重組DNA是已通過(guò)轉(zhuǎn)化引入植物或其祖先的DNA(通常是異源的)。重組DNA編碼被表達(dá)來(lái)遞送至病原體攻擊的位置(例如葉)的被修飾II類茄科防衛(wèi)素。當(dāng)本發(fā)明的被修飾防衛(wèi)素在轉(zhuǎn)基因植物或其后代中表達(dá)時(shí)，病原體在植物中被病原體攻擊的位置上或遠(yuǎn)離所述位置的地方暴露于防衛(wèi)素。具體地，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)幕蛘{(diào)控序列，可使防衛(wèi)素在其最有效時(shí)以及在其最有效的位置體上體內(nèi)產(chǎn)生。例如，可在其中其通常不大量表達(dá)但其中疾病抗性很重要的植物的部分內(nèi)(例如在葉中)產(chǎn)生防衛(wèi)素?？僧a(chǎn)生的遺傳修飾植物的實(shí)例包括田間作物、谷類、水果和蔬菜，例如：玉米、大豆、高粱、小麥、大麥、玉蜀黍、棉花、蕓苔、稻、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁、蘋果、蘆筍、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蠶豆、蕓苔、腰果、木薯、鷹嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、無(wú)花果、亞麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄欖、洋蔥、豌豆、堅(jiān)果、梨，非洲稷、馬鈴薯、油菜、黑麥草、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、芋頭、茶葉、煙草、番茄、黑小麥、塊菌和山藥。病原體可以是在植物上、植物中或植物附近生長(zhǎng)的任何病原體。在本說(shuō)明書中，抗性包括當(dāng)與野生型植物相比較時(shí)增強(qiáng)的對(duì)病原體的耐受性?？剐钥梢允菑膶?duì)病原體作用的耐受性的略微增加(此時(shí)病原體被部分抑制)至完全的抗性從而植物不受病原體的存在影響(此時(shí)病原體被嚴(yán)重抑制或殺死)之間變化。針對(duì)特定病原體的抗性水平升高或針對(duì)更廣譜病原體的抗性均可構(gòu)成抗性的改善。在植物轉(zhuǎn)化或隨后雜交后選擇顯示抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物(或從其衍生的植物)。本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生顯示抗病原體活性的遺傳修飾植物或其后代的方法，所述方法包括產(chǎn)生包含表達(dá)編碼被修飾防衛(wèi)素的核酸的細(xì)胞的植物，如本文中所教導(dǎo)的，表達(dá)水平足以使被修飾防衛(wèi)素展示抗植物病原體的保護(hù)作用?？蓪⒈景l(fā)明的被修飾防衛(wèi)素單獨(dú)地或與一種或多種來(lái)自任何組防衛(wèi)素的其它防衛(wèi)素組合地使用。因此，本文中提供了用于產(chǎn)生顯示抗病原體性質(zhì)的植物的方法，所述方法包括產(chǎn)生遺傳修飾的植物或其后代，其中包含表達(dá)與另一種防衛(wèi)素組合的本文中教導(dǎo)的被修飾II類茄科防衛(wèi)素的細(xì)胞。這樣的植物對(duì)于促進(jìn)病原體產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)減小?！鍏f(xié)同作用″包括通過(guò)使用兩種或更多種防衛(wèi)素來(lái)對(duì)抗對(duì)單種防衛(wèi)素的抗性?？墒褂美珉幕虻鞍踪|(zhì)合成儀，使用一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)逐步添加，基于其氨基酸序列產(chǎn)生本發(fā)明的被修飾防衛(wèi)素?；蛘撸赏ㄟ^(guò)重組方法制備被修飾防衛(wèi)素?？蓪⒈恍揎椃佬l(wèi)素單獨(dú)地或與其它抗病原體劑(無(wú)論是由細(xì)胞提供的還是局部或全身性施用的)組合地使用。如上文中所指出的，本發(fā)明的被修飾防衛(wèi)素顯示提高的或增強(qiáng)的抗病原體活性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病原體是真菌病原體。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了人工產(chǎn)生的II類茄科防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素包含II類茄科防衛(wèi)素主鏈，其在主鏈的環(huán)1B區(qū)域被通過(guò)單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失修飾，產(chǎn)生具有抗真菌活性的防衛(wèi)素，其中所述主鏈可任選地在主鏈的其它地方例如在C末端CTPP中包含單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失。本公開內(nèi)容還涉及人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素用于制造抗病原體藥劑的用途，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的主鏈氨基酸序列，在II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的第一β-鏈與α-螺旋之間具有環(huán)1B區(qū)域或其等同環(huán)，其中所述環(huán)1B區(qū)域已被單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失所修飾。此外，另一個(gè)方面是包含與SEQIDNO：52具有至少約70％相似性的C末端區(qū)域的II類茄科防衛(wèi)素用于制造人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的用途，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含被修飾的環(huán)1B區(qū)域，并且所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素顯示抗病原體活性。本文中還提供了用于在植物上或植物中或者在植物或其根周圍的土壤中減少或控制病原體侵染的方法，所述方法包括給所述植物或植物的根或土壤局部施用本公開內(nèi)容的被修飾防衛(wèi)素?；蛘?，所述方法包括產(chǎn)生表達(dá)所述被修飾防衛(wèi)素的遺傳修飾植物以及包含該被修飾防衛(wèi)素的被修飾植物的后代。另一個(gè)方面提供了用于在動(dòng)物上或動(dòng)物中減少或控制病原體侵染的方法，所述方法包括給動(dòng)物上的潛在受感染表面區(qū)域局部施用本發(fā)明的被修飾II類茄科防衛(wèi)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，包括人。因此，本文中涉及動(dòng)物(特別地哺乳動(dòng)物，例如人)的抗病原體藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥劑以粉劑、噴霧劑、霧化劑、納米顆粒、凝膠、糊劑、加固繃帶、涂劑(paint)、氣溶膠(aerosol)、drench或其它液體形式存在?？共≡w制劑還可以是緩釋組合物。制劑可用于治療被感染的受試者或用作預(yù)防劑。如本文中所述，″包含″與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，具有開放性含義，并且不排除另外的、未引述的要素或方法步驟。如本文中所述，″由……組成″排除所述要素中未指明的任何要素、步驟或成分。如本文中所述，″基本上由……組成″不排除不實(shí)質(zhì)性影響所述對(duì)象的基本和新型特征的材料或步驟。術(shù)語(yǔ)“包含”在本文中的任何引述，特別地在組合物的組分的描述中或裝置的組件的描述中，理解為包括基本上由和由引述的組分或組件組成的那些組合物和方法?？稍诒疚闹形疵鞔_公開的任何組件、限制不存在的情況下實(shí)施在本文中適當(dāng)?shù)嘏e例說(shuō)明性描述的本公開內(nèi)容。當(dāng)本文中公開一組替代物時(shí)，應(yīng)理解這些組和所有亞組的所有單個(gè)成員，包括組成員的任何異構(gòu)體和對(duì)映體以及可使用替代物形成的化合物的種類是分別地公開的。當(dāng)請(qǐng)求保護(hù)化合物時(shí)，應(yīng)理解無(wú)意將本領(lǐng)域已知的化合物，包括本文中公開的參考資料中公開的化合物包括在內(nèi)。當(dāng)在本文中使用Markush組或其它分組時(shí)，意欲將組內(nèi)的所有個(gè)體成員和組的所有可能的組合和亞組合單個(gè)地包括在本公開內(nèi)容中。當(dāng)在本文中引述范圍時(shí)，意欲包括所述范圍內(nèi)的所有亞范圍以及所述范圍內(nèi)的所有整數(shù)值，就如同每一個(gè)亞范圍和整數(shù)值被引述一樣。本說(shuō)明書包括各個(gè)方面。這些方面包括下列：1.一種人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的在所述II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間具有環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中所述通過(guò)氨基酸的置換、添加和/或缺失修飾所述環(huán)區(qū)域以產(chǎn)生具有抗病原體活性的防衛(wèi)素。2.方面1的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述環(huán)區(qū)域是環(huán)1B。3.方面2的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中II類茄科防衛(wèi)素上的所述環(huán)1B經(jīng)修飾而產(chǎn)生序列X1X2X3X4X5X6，其中X是氨基酸殘基，并且其中：X1是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X2是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X3是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X4是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；X5是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；和/或X6是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。4.方面3的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中II類茄科防衛(wèi)素上的所述環(huán)1B經(jīng)修飾而產(chǎn)生序列X1X2X3X4X5X6，其中X是氨基酸殘基，并且其中：X1是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S，或R；X2是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；X3是W、Y、H、L、G、F或P；X4是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；X5是S、K、Y、F、G或H；和/或X6是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。5.方面4的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述環(huán)1B包含序列X1X2X3X4X5X6，其中：X1是N、H、Q、D、K或E；X2是R、H、T、K或G；X3是F、H、Y或W；X4是P、K、S或R；X5是G或F；和/或X6是P、V、I或N。6.方面3的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中X1是選自的氨基酸L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、G；X2是選自的氨基酸S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、G；X3是選自的氨基酸A、F、W、N、I、S、Y、P、L、H；X4是選自的氨基酸K、G、E、R、A、P、F、Q、V、S；X5是選自的氨基酸M、G、K、D、S、Y、P、E、N、F；和X6是選自的氨基酸V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N。7.方面3或4或5或6的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中II類茄科防衛(wèi)素上的所述環(huán)1B被修飾成氨基酸序列HRFKGP(NaD2)、QHHSFP(Zea2)、DTYRGV(PsD1)、DKYRGP(MsDef1)、KTFKGI(SoD2)、KTWSGN和(DmAMP1)或由SEQIDNO：67至SEQIDNO：79定義的環(huán)1B。8.方面1至7中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述II類茄科防衛(wèi)素包含在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：52具有至少70％相似性的成熟結(jié)構(gòu)域的C末端區(qū)域。9.方面8的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述II類茄科防衛(wèi)素選自NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20或SL549。10.方面9的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述II類茄科防衛(wèi)素是NaD1。11.方面9的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述II類茄科防衛(wèi)素是選自NsD1和NsD2的來(lái)自香甜煙草(Nicotianasuaveolens)的防衛(wèi)素。12.方面2的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中來(lái)自圖2中所列的非-II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B替代II類茄科防衛(wèi)素上的環(huán)1B。13.方面7的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述環(huán)1B是來(lái)自NaD1的NTFPGI的被修飾形式，其中所述修飾包括如下修飾的一個(gè)或多個(gè)：用選自A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換N；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換T；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換F；用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換P；用選自A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換G；和/或用選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的修飾形式的氨基酸殘基置換I；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。14.方面13的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述環(huán)1B是來(lái)自NaD1的NTFPGI的被修飾形式，其中所述修飾包括如下修飾的一個(gè)或多個(gè)：用選自G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S和R的氨基酸殘基置換N；用選自K、R、G、H、L、N、F、I、S和Y的氨基酸殘基置換T；用選自W、Y、H、L、G和P的氨基酸殘基置換F；用選自K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G的氨基酸殘基置換P；用選自S、K、Y、F和H的氨基酸殘基置換G；和/或用選自P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H和Y的氨基酸殘基置換I；其中氨基酸序列X1X2X3X4X5X6不對(duì)應(yīng)于修飾前的II類茄科防衛(wèi)素環(huán)1B區(qū)域的氨基酸序列。15.方面1至14中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述主鏈II類茄科防衛(wèi)素還包括主鏈上位于所述環(huán)區(qū)域外的氨基酸置換、添加和/或缺失。16.方面15的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述其它氨基酸置換、添加和/或缺失是C末端尾中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。17.方面1至16中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中相較于主鏈II類茄科防衛(wèi)素，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素具有選自更廣譜的抗病原體活性、增強(qiáng)的抗病原體活性、更大的穩(wěn)定性和/或更強(qiáng)的透化能力之中的增強(qiáng)的抗病原體活性。18.方面17的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述抗病原體活性是抗真菌活性的水平。19.方面17的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述抗病原體活性是抗昆蟲活性的水平。20.方面18的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌是植物真菌病原體。21.方面20的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌是哺乳動(dòng)物真菌病原體。22.方面21的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌是人真菌病原體。23.方面20的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)、玉蜀黍殼色單隔孢(Diplodiamaydis)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)和輪枝樣鐮孢(Fusariumverticilloides)。24.方面20的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自玉米：玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)(禾谷鐮孢)、禾生刺盤孢、玉米狹殼柱孢(Stenocarpellamaydi)(玉蜀黍殼色單隔孢(Diplodiamaydis))、亞粘團(tuán)串珠鐮孢(Fusariummoniliformevar.subglutinans)、輪枝樣鐮孢、玉蜀黍平臍蠕孢菌O、T(BipolarismaydisO、T)(異旋孢腔菌(Cochliobolisheterostrophus))、玉米大斑菌I、II和III、玉米尾孢(Cercosporazeae-maydis)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、禾生腐霉(Pythiumgraminicola)、華麗腐霉(Pythiumsplendens)、終極腐霉(Pythiumultimum)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、曲霉屬的種(Aspergillusspp)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、炭色長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporiumcarbonum)I、II和III(炭色旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum))、Helminthosporiumpedicellatum、玉蜀黍節(jié)壺菌(Physodermamaydis)、玉米葉點(diǎn)霉(Phyllostictamaydis)、玉米球梗孢(Kabatiellamaydis)、高粱尾孢(Cercosporasorghi)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、玉米黑粉菌(Ustilagozeae)、玉米柄銹菌(Pucciniasorghi)、多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、稻黑孢(Nigrosporaoryzae)、草本枝孢(Cladosporiumherbarium)、新月彎孢(Curvularialunata)、不等彎孢(Curvulariainaequalis)、蒼白彎孢(Curvulariapallescens)、綠色木霉(Trichodermaviride)、玉米麥角(Clavicepssorghi)、大孢色二孢(Diplodiamacrospora)、水稻霜霉病(Sclerophthoramacrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerosporasorghi)、菲律賓指霜霉(Peronosclerosporaphilippinensis)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerosporamaydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerosporasacchari)、絲軸黑粉菌(Sphacelothecareiliana)、玉米殼銹菌(Physopellazeae)、玉蜀黍頭孢(Cephalosporummaydis)、頂頭孢(Cephalosporumacremonium)；大豆：枝狀鐮孢…、茄腐鐮孢…、核盤菌、尖鐮孢、Fusariumtucumaniae、豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi)、大豆疫霉(Phytophthoramegaspermaf.sp.glycinea)、大豆疫霉(Phytophthorasojae)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、菜豆間座殼大豆種(Diaporthephaseolorumvar.sojae)(大豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissojae))、菜豆間座殼種花椰菜(Diaporthephaseolorumvar.caulivora)、齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)、菊池尾孢(Cercosporakikuchii)、大豆尾孢(Cercosporasojina)、大豆霜霉病菌(Peronosporamanshurica)、束狀刺盤孢(Colletotrichumdematium)(平頭刺盤孢(Colletotrichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)、大豆殼針孢(Septoriaglycines)、大豆生葉點(diǎn)霉(Phyllostictasojicola)、鏈格孢(Alternariaalternata)、彌漫叉絲殼(Microsphaeradiffusa)、半裸鐮孢(Fusariumsemitectum)、大豆瓶霉(Phialophoragregata)、大豆小絲殼(Glomerellaglycines)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、終極腐霉(Pythiumultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)；蕓苔：白銹菌(Albugocandida)、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)、油菜小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、核盤菌、蕓苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassicicola)、終極腐霉(Pythiumultimum)、寄生霜霉(Peronosporaparasitica)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、鏈格孢(Alternariaalternata)；棉花：棉花尖鐮孢(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、大麗花輪枝孢(Verticilliumdahliae)、根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)、大孢鏈格孢(Alternariamacrospora)、棉尾孢(Cercosporagossypina)、短小莖點(diǎn)霉(Phomaexigua)(棉殼二胞菌(Ascochytagossypii))、腐霉屬的種、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、Pucciniascheddardii、Pucciniacacabata、Phymatotrichopsisomnivore；蕓苔：油菜小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、核盤菌、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)、黑斑病菌(Alternariabrasicicola)、蕓苔根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、鐮孢屬(Fusarium)的種、腐霉屬的種、疫霉屬(Phytophthora)的種、鏈格孢屬(Alternaria)的種、寄生霜霉(Peronosporaparasitica)、Mycosphaerellacapsellae(蕓苔假小尾孢(Pseudocercosporellacapsellae))、白銹菌(Albugocandida)、大雄疫霉(Phytophtohoramegaspermavar.megasperma)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、十字花科白粉菌(Erysiphecruciferarum)；小麥：麥根腐平臍蠕孢(Cochliobolussativus)、Drechslerawirreganensis、禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、Phaeosphaeriaavenariaf.sp.triticea、小麥小暗球殼(Phaeosphaerianodorum)、布氏禾白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、冰草條黑粉菌(Urocystisagropyri)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、禾黑芽枝霉菌(Cladosporiumherbarum)、禾谷鐮孢、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、尖鐮孢(Fusariumculmorum)、小麥冠腐病菌(Fusariumpseudograminearum)、小麥散黑粉病菌(Ustilagotritici)、Ascochytatritici、谷頭孢菌(Cephalosporiumgramineum)、禾生刺盤孢、白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.tritici)、大麥抗禾柄銹菌(Pucciniagraminisf.sp.tritici)、小麥葉銹菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)、小麥條銹菌(Pucciniastriiformis)、小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)、水稻霜霉病(Sclerophthoramacrospora)、冰草條黑粉菌(Urocystisagropyri)、小麥黃斑枯葉菌(Pyrenophoratritici-repentis)、小麥不孕病菌(Pyrenophorasemeniperda)、小麥葉枯病菌(Phaeosphaerianodorum)、小麥穎枯病菌(Septorianodorum)、小麥葉斑病病原菌(Septoriatritici)、燕麥亮針抱菌(Septoriaavenae)、小麥基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、腐霉(Pythiumspp)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、Pythiumarrhenomannes、Pythiumgramicola、終極腐霉(Pythiumultimum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、麥角菌(Clavicepspurpurea)、Tapesiayallundae、小麥光腥黑穗菌(Tilletiatritici)、Tilletialaevis、小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(Tilletiacaries)、小麥印度腥黑穗病菌(Tilletiaindica)、小麥散黑粉病菌(Ustilagotritici)、Wojnowiciagraminis、麥根腐平臍蠕孢(Cochliobolussativus)；高粱：玉米大斑菌(Exserohilumturcicum)、炭疽病菌(Colletotrichumsublineolum)、高粱尾孢(Cercosporasorghi)、Gloeo高粱尾孢(Cercosporasorghi)、高粱粗斑殼二孢(Ascochytasorghina)、紫柄銹菌(Pucciniapurpurea)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、粱黑蔥花霉(Perconiacircinata)、串珠鐮孢霉菌(Fusariummoniliforme)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、高粱平臍蠕孢菌(Bipolarissorghicola)、長(zhǎng)蠕孢菌(Helminthosporiumsorghicola)、新月彎孢霉(Curvularialunata)、高粱莖點(diǎn)霉(Phomainsidiosa)、高粱類斑點(diǎn)病菌(Ramulisporasorghi)、高粱紫輪病菌(Ramulisporasorghicola)、Phyllacharasaccari、玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)(玉米絲黑穗病菌(Sphacelothecareiliana))、高粱散黑粉菌(Sphacelothecacruenta)、高粱堅(jiān)孢堆黑粉菌(Sporisoriumsorghi)、蘇丹草紫斑病(Clavicepssorghi)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、枝頂孢霉(Acremoniumstrictum)、小麥霜霉病菌(Sclerophthonamacrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerosporasorghi)、菲律賓指霜霉(Peronosclerosporaphilippinensis)、禾生指梗霉(Sclerosporagraminicola)、禾谷鐮孢、尖鐮孢、雄腐霉(Pythiumarrhenomanes)、禾生腐霉(Pythiumgraminicola)；向日葵：向日葵單軸霉(Plasmoparahalstedii)、核盤菌、殼針孢菌(Septoriahelianthi)、向日葵莖潰瘍病菌(Phomopsishelianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternariahelianthi)、百日草鏈格孢菌(Alternariazinniae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、莖點(diǎn)霉黑莖病菌(Phomamacdonaldii)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、菊科白粉菌(Erysiphecichoracearum)、米根霉(Rhizopusoryzae)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、Pucciniahelianthe、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、頂頭孢霉菌(Cephalosporumacremonium)、隱地疫霉(Phytophthoracryptogea)、婆羅門參白銹菌(Albugotragopogonis)；苜蓿：終極腐霉(Pythiumultimum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、華麗腐霉(Pythiumsplendens)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、大豆疫病菌(Phytophthoramegasperma)、三葉草霜霉菌(Peronosporatrifoliorum)、Phomamedicaginisvar.medicaginis、苜蓿尾孢菌(Cercosporamedicaginis)、苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)、苜蓿黃斑病菌(Leptotrochilamedicaginis)、尖鐮孢、黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)、根腐絲囊霉(Aphanomyceseuteiches)、Stemphyliumherbarum、StemphyliumAlfalfa、三葉草炭疽病菌(Colletotrichumtrifolii)、苜蓿小光殼(Leptosphaerulinabriosiana)、條紋單胞銹菌(Uromycesstriatus)、三葉草核盤菌(Sclerotiniatrifoliorum)、草木樨殼多孢菌(Stagonosporameliloti)、蔥葉枯匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)和Leptotrichilamedicaginis。25.方面24的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自禾谷鐮孢、禾生刺盤孢、玉蜀黍殼色單隔孢、輪枝樣鐮孢、Cochlioholisheterostrophus、玉米大斑病菌、玉米尾孢菌、Fusariumvirguliforme、腐皮鐮孢、核盤菌、尖鐮孢、Fusariumtucumaniae、Phakopsorapachyrhizi。26.方面24的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自枝狀鐮孢、腐皮鐮孢、核盤菌、尖鐮孢、Fusariumtucumaniae。27.方面20的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌是銹菌。28.方面21的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自鏈格孢屬的種、曲霉屬的種、假絲酵母屬的種、鐮孢屬的種、發(fā)癬菌屬的種、隱球酵母屬的種、小孢霉屬的種、青霉屬的種、絲孢酵母種、絲孢菌屬的種、擬青霉屬的種、支頂孢屬的種和暗色霉。29.方面24的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述真菌選自煙草赤星病菌、煙曲霉、黑曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、Aspergillusparaciticus、白色假絲酵母、都柏林假絲酵母、無(wú)名假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、希木龍假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、挪威假絲酵母、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、維斯假絲酵母、尖鐮孢、茄腐鐮孢、串株鐮孢、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、Trycophytoninterdigitales、斷發(fā)毛癬菌、新型隱球酵母、隱球酵母、Cryptococcusgrubii、犬小孢霉、石膏樣小孢霉、馬爾尼菲青霉、白吉爾毛孢子菌、阿氏絲孢酵母、墨汁絲孢酵母、星狀絲孢酵母、皮狀絲孢酵母、Trichosporondomesticum、粘性絲孢酵母、卵形絲孢酵母、茁芽絲孢酵母、Trichosporonloubieri、日本絲孢酵母、尖端賽多孢子菌、多育賽多孢、宛氏擬青霉、淡紫擬青霉、枝頂孢霉、斑替枝孢霉、皮炎外瓶霉、Ramichloridiumobovoideum、Chaetomiumatrobrunneum、Dactlariagallopavum、平臍蠕孢屬的種、嘴突臍孢以及、精美尖端節(jié)腫霉、印度毛霉菌、微小根毛霉、米根霉、灰色小克銀漢霉、Cokeromycesrecurvatus、Saksenaeavasiformis、總狀共頭霉、蛙糞霉、冠狀耳霉/異孢耳霉、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、Coccidioidesposadasii、莢膜組織胞漿菌、巴西芽生菌、波氏足腫菌和申氏孢子絲菌。30.方面19的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，其中所述昆蟲選自巨座玉米螟、玉米螟蛾、縊管蚜的種、夜蛾屬的種、小菜蛾和盲蝽屬的種。31.一種組合物，所述組合物包含方面1至30中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素，任選地還包含化學(xué)或蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺病原體劑和/或絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體形式。32.一種分離的核酸分子，其編碼方面1至30中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素。33.一種包含方面32的分離的核酸分子的基因構(gòu)建體。34.一種遺傳修飾植物或所述植物的后代，其產(chǎn)生方面1至30中任一項(xiàng)的人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素。35.方面34的遺傳修飾植物或其后代或繁殖材料，其包含方面32的核酸分子或方面33的基因構(gòu)建體。36.方面34或35的遺傳修飾植物，其選自玉米、大豆、棉花、高粱、小麥、大麥、玉蜀黍、蕓苔、麻蕉(abaca)、苜蓿、杏仁、蘋果、蘆筍、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蠶豆、腰果、木薯、鷹嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、無(wú)花果、亞麻、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄欖、洋蔥、豌豆、堅(jiān)果、梨、非洲稷、馬鈴薯、油菜、黑麥草、草莓，甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、芋頭、茶葉、煙草、番茄、黑小麥、塊菌和山藥。37.一種用于產(chǎn)生展示增強(qiáng)的抗病原體活性的遺傳修飾植物或其后代的方法，所述方法包括產(chǎn)生包含表達(dá)編碼方面1至30中任一項(xiàng)的被修飾II類茄科防衛(wèi)素的核酸的細(xì)胞的植物，所述植物或其后代中的表達(dá)水平足以使所述被修飾防衛(wèi)素展示抗植物病原體的保護(hù)作用。38.一種控制植物上病原體侵染的方法，所述方法包括對(duì)所述植物、其根或所述植物周圍的土壤局部施用方面31的組合物。39.一種控制動(dòng)物受試者上病原體侵染的方法，所述方法包括對(duì)被所述病原體潛在侵染的動(dòng)物的表面局部施用方面31的組合物。40.方面37或38的方法，其還施用化學(xué)殺病原體劑、蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺病原體劑或者絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體形式。41.方面39的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。42.方面31的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。43.人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素用于制造抗病原體藥劑的用途，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含來(lái)自II類茄科防衛(wèi)素的、在所述II類茄科防衛(wèi)素的N末端部分上的β-鏈1與α-螺旋之間具有環(huán)區(qū)域的主鏈氨基酸序列，其中所述環(huán)區(qū)域通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或添加而被修飾。44.方面43的用途，其中所述環(huán)區(qū)域是環(huán)1B。45.方面43或44的用途，其中所述病原體是真菌。46.方面43或44或45的用途，其還包括使用化學(xué)殺病原體劑、蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺抗原體劑或者絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑或其前體形式。47.一種來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：49[NsD1]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。48.一種來(lái)自香甜煙草的分離的防衛(wèi)素，其具有SEQIDNO：51[NsD2]所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列。49.一種分離的核酸分子，其包含編碼方面47或48的防衛(wèi)素的核苷酸序列。50.方面49的分離的核酸分子，其包含選自SEQIDNO：48、SEQIDNO：50、能夠在中等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：48或50雜交的核苷酸序列以及在最佳比對(duì)后與SEQIDNO：46或48具有至少70％同一性的核苷酸序列之中的核苷酸序列。51.II類茄科防衛(wèi)素用于制造人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素的用途，所述II類茄科防衛(wèi)素包含與SEQIDNO：52具有至少約70％相似性的其成熟結(jié)構(gòu)域的C末端區(qū)域，所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素包含被修飾的環(huán)1B區(qū)域并且所述人工產(chǎn)生的防衛(wèi)素展示抗病原體活性。52.一種基因構(gòu)建體，其包含方面32的核酸和編碼蛋白酶抑制劑的核酸。實(shí)施例通過(guò)下列非限制性的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述各個(gè)方面。在下文中描述此類實(shí)施例中使用的方法。從茄科花純化防衛(wèi)素為了從它們的天然來(lái)源分離II類防衛(wèi)素，將不超過(guò)花發(fā)育的花瓣著色期的整個(gè)翼狀豬籠草(NaD1、NaD2)或香花煙草(NsD1、NsD2)花研磨成細(xì)粉，如先前所描述的(Lay等人2003，同上)，在稀硫酸中進(jìn)行提取。簡(jiǎn)而言之，將花(760g的濕重)在液氮中冷凍，用研杵將其在研缽中研磨成細(xì)粉，然后使用Ultra-Turrax勻漿器于50mM硫酸(3mL/g鮮重)中勻漿5分鐘。在4℃攪拌1小時(shí)后，通過(guò)Mifacloth(Calbiochem，SanDiego，CA)過(guò)濾和離心(25,000xg，15分鐘，4℃)除去細(xì)胞碎片。隨后通過(guò)添加10MNaOH將pH調(diào)整至7.0，在4℃攪拌提取物1小時(shí)，隨后離心(25,000xg，15分鐘，4℃)以除去沉淀的蛋白質(zhì)。將上清液(1.8L)用于利用10mM磷酸鈉緩沖液預(yù)平衡的SPSepharose(Trademark)FastFlow(GEHealthcareBio-Sciences)柱(2.5x2.5cm)。通過(guò)用20倍柱體積的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗滌而除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，隨后用含有500mMNaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫在3x10mL級(jí)分中。將來(lái)自SPSepharose柱的級(jí)分經(jīng)歷反向高效液相色譜(RP-HPLC)。來(lái)自巴斯德畢赤酵母的NaD1純化巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是公知的并且可從nvitrogen(Carlsbad，CA；參見提供商的公開pPIC9表達(dá)載體序列的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)(PichiaExpressionManual))商購(gòu)獲得。將單個(gè)pPIC9-NaD1巴斯德畢赤酵母GS115菌落用于接種在100mL培養(yǎng)瓶中的10mLBMG培養(yǎng)基(在Invitrogen畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)中描述的)中，在30℃的搖動(dòng)培養(yǎng)箱(140rpm)中溫育過(guò)夜。將培養(yǎng)物用于接種在2L帶擋板三角瓶中的500mLBMG，隨后將所述三角瓶置于30℃搖動(dòng)培養(yǎng)箱(140rpm)中。當(dāng)OD600達(dá)到2.0(～18h)時(shí)，通過(guò)離心(2,500xg，10分鐘)收獲細(xì)胞，將其重懸浮于5L帶擋板三角瓶中的1LBMM培養(yǎng)基(OD600＝1.0)中，在28℃搖動(dòng)培養(yǎng)箱中溫育3天。通過(guò)離心(4750rpm，20分鐘)將表達(dá)培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，利用等體積的20mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)進(jìn)行稀釋。利用NaOH將培養(yǎng)基調(diào)整至pH6.0，隨后將其施加到用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)預(yù)平衡的SPSepharose柱(1cmx1cm，AmershamBiosciences)。隨后用100mL的10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)清洗柱子，在10mL包含500mMNaCl的10mM磷酸鉀緩沖液中洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。使用在下文中描述的40分鐘線性梯度將洗脫的蛋白質(zhì)經(jīng)歷RP-HPLC。收集蛋白質(zhì)峰，通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)，利用抗-NaD1抗體進(jìn)行免疫印跡。冷凍干燥含有NaD1的級(jí)分，將其重懸浮于無(wú)菌milliQ超純水中。使用二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定(PierceChemicalCo.)(利用牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))測(cè)定畢赤酵母表達(dá)的NaD1的蛋白質(zhì)濃度。反向高效液相色譜使用附加有保護(hù)柱的制備性C8柱(22x250mm，Vydac)在偶聯(lián)至檢測(cè)器(166型，Beckman)的SystemGoldHPLC(Beckman)上進(jìn)行反向高效液相色譜(RP-HPLC)。將蛋白質(zhì)樣品加載在緩沖液A(0.1％[v/v]三氟乙酸)中，在40分鐘內(nèi)以10mL/分鐘的流速利用0-100％[v/v]緩沖液B(60％[v/v]乙腈，于0.089％[v/v]三氟乙酸中)的線性梯度進(jìn)行洗脫。通過(guò)監(jiān)測(cè)在215nm的吸光度來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。收集蛋白質(zhì)峰，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。將來(lái)自NaD1純化的每一個(gè)階段的樣品(30μL)添加至NuPAGE(注冊(cè)商標(biāo))LDS樣品上樣緩沖液(10μL，Invitrogen)并且加熱至70℃，進(jìn)行10分鐘。隨后將樣品加載至NuPAGE(注冊(cè)商標(biāo))預(yù)制4-12％[w/v]Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上，使用XCell-Surelock電泳裝置(Invitrogen)在200V下電泳分離蛋白質(zhì)。通過(guò)考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上以利用抗-NaD1抗體進(jìn)行免疫印跡。rNaD1的圓二色譜為了檢查從巴斯德畢赤酵母(rNaD1)純化的NaD1是否正確折疊，記錄其遠(yuǎn)紫外圓二色性(CD)譜，將其與天然NaD1的遠(yuǎn)紫外圓二色性譜相比較。兩個(gè)譜的相似性表明rNaD1的結(jié)構(gòu)相較于天然NaD1未顯著改變。NaD1的PCR誘變使用Phusion(注冊(cè)商標(biāo))定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Finnzymes)進(jìn)行NaD1的定點(diǎn)誘變。設(shè)計(jì)在5′末端磷酸化的寡核苷酸引物以摻入期望的突變。利用下列溫度模式在30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增整個(gè)模板質(zhì)粒(pPIC9-NaD1)：98℃，30s；55℃，20s；72℃，4分鐘，和在72℃進(jìn)行10分鐘的終延伸循環(huán)。隨后使用T4DNAQuick連接酶在室溫進(jìn)行5分鐘來(lái)環(huán)化所述線性PCR產(chǎn)物，按照制造商的說(shuō)明書將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入化學(xué)感受態(tài)TOP10細(xì)胞。使用AOX3′引物測(cè)定構(gòu)建體的序列以確保突變已被正確摻入。電感受態(tài)巴斯德畢赤酵母的制備如Chang等人(2005)MolBiolCell16(10)：4941-4953所述制備電感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞(Invitrogen)。簡(jiǎn)而言之，收獲在YPD(1％w/vBacto酵母提取物，2％w/vBacto蛋白胨提取物和2％w/v葡萄糖)中生長(zhǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，在振蕩的條件下在30℃利用含有10mMDTT，25mMHEPES，pH8的YPD處理所述細(xì)胞。在水中洗滌細(xì)胞2次，隨后在冰冷的1M山梨醇中洗滌1次，再將它們重懸浮于1M山梨醇，分成80μL的等分于-80℃貯存。利用pPIC9構(gòu)建體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115將利用每一個(gè)pPIC9構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的單個(gè)大腸桿菌TOP10菌落用于接種10mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB，在搖動(dòng)培養(yǎng)箱中在37℃溫育過(guò)夜。使用Qiaprep(注冊(cè)商標(biāo))miniprep試劑盒(Qiagen)分離質(zhì)粒DNA，使用限制性內(nèi)切酶SalI線性化所述質(zhì)粒，進(jìn)行過(guò)夜。在冰上解凍感受態(tài)巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞(80μL)，將1μg線性化DNA添加在冰冷卻的具有0.2cm空隙的GenePulser(注冊(cè)商標(biāo))電穿孔小杯中。在1.5kV，25μF，400Ω(GenePulser，Bio-RadLaboratories)下通過(guò)電穿孔引入DNA。將冰冷卻的1M山梨醇(1mL)添加至細(xì)胞中，隨后將它們涂板在MD板(1.34％w/v酵母氮源，無(wú)氮基酸以及具有磷酸銨[USBiological，YNB]，4x10-5％w/v生物素，2％w/v葡萄糖)上，在30℃溫育5天。隨后選擇陽(yáng)性菌落，再涂板至新鮮MD板上。rNaD1的表征圖6A至D顯示從花分離的rNaD1的免疫印跡、反相HPLC描跡、結(jié)構(gòu)和rNaD1的抗菌絲生長(zhǎng)的活性。氨基酸序列比較圖3A和3B提供了各種II類茄科防衛(wèi)素(包括NaD1)的氨基酸序列的圖示。圖4顯示I類和II防衛(wèi)素。這些比對(duì)中的環(huán)1B區(qū)域包含圖3中的氨基酸10至15和圖4中的氨基酸9至14。本公開內(nèi)容擴(kuò)展至具有與NaD1的氨基酸32至51(圖3)(SEQIDNO：52)具有至少70％相似性的C末端20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的防衛(wèi)素。實(shí)例提供于表4中。載體圖譜圖11顯示pHEX138的載體圖譜。用于植物內(nèi)研究的生物測(cè)定法：禾生刺盤孢(C.graminicola)接種物的制備：從玉米(PioneerHi-BredInternational，Inc.Johnston2Iowa，USA)分離禾生刺盤孢(US分離株Carroll-1A-99)。從在V8瓊脂上生長(zhǎng)約2-3周的生孢子培養(yǎng)物分離孢子。通過(guò)在無(wú)菌水中括擦板表面來(lái)收集禾生刺盤孢的孢子，通過(guò)面紙(facialtissue)過(guò)濾而將孢子與菌絲質(zhì)(hyphalmatter)分離。使用血球計(jì)數(shù)器測(cè)量濾出液中孢子的濃度。禾谷鐮孢接種物的制備：從玉米(PioneerHi-BredInternational.Inc.Johnston，Iowa.USA)分離禾谷鐮孢分離物(73B1A)。從在SNP瓊脂板上生長(zhǎng)約2-3周的生孢子培養(yǎng)物分離孢子。通過(guò)在無(wú)菌水中板擦板表面來(lái)收集禾谷鐮孢的孢子。使用血球計(jì)數(shù)器測(cè)量孢子的濃度。玉蜀黍植物的接種：在出瓶后將用于生物測(cè)定的植物在溫室中生長(zhǎng)約9-10周。禾生刺盤孢的接種在玉蜀黍葉鞘的相對(duì)側(cè)上產(chǎn)生2個(gè)長(zhǎng)2.0mm的傷口，隨后利用1x106個(gè)禾生刺盤孢孢子/mL涂覆傷口。隨后用GladPressn'Seal封閉傷口3天。接種后10天，利用數(shù)字照相術(shù)測(cè)量感染的面積。禾谷鐮孢接種在玉蜀黍葉鞘的相對(duì)側(cè)上產(chǎn)生2個(gè)長(zhǎng)2.0mm的傷口，隨后用浸漬在1x106個(gè)禾谷鐮孢孢子/mL中的直徑6mm的紙盤覆蓋傷口。隨后用GladPressn'Seal封閉傷口3天。接種后10天，利用數(shù)字照相術(shù)測(cè)量感染的面積。ELISA法蛋白質(zhì)提取：從生長(zhǎng)在溫室中的植物切取葉鞘。在液氮中冷凍組織(50mg)，將其在混合磨(mixermill)(RetschMM300)中以30s-1的頻率研磨2次，每次15秒。通過(guò)添加450μL2％的不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％Tween20，渦旋20s來(lái)制備蛋白質(zhì)提取物。將樣品離心10分鐘，收集上清液。用100μL/孔的PBS中的一抗(100ng/孔的抗-NaD1，利用標(biāo)準(zhǔn)方法制備針對(duì)來(lái)自花煙草的花的純化NaD1的多克隆抗體))溫育ELISA板(NuncMaxisorp#442404)。在濕盒中在4℃溫育板過(guò)夜。隨后利用PBS/0.05％v/vTween20洗滌它們4次，每次2分鐘。利用200μL/孔3％w/v的PBS中的BSA(SigmaA-7030：98％ELISA級(jí))封閉板，在25℃溫育2小時(shí)。隨后用PBS/0.05％v/vTween20洗滌板4次，每次2分鐘。隨后將玉米鞘的蛋白質(zhì)提取物(100μL/孔，稀釋在PBS/0.05％v/vTween20中)施加到板上，隨后將板在25℃溫育2小時(shí)。隨后用PBS/0.05％v/vTween20洗滌板4次，每次2分鐘，隨后施用100μL/孔的PBS中的二抗(75ng/孔生物素標(biāo)記的NaD1抗體)。使用EZ-linkSulfo-NHS-LC-生物素化試劑盒(Pierce)制備生物素標(biāo)記抗體；使用2mL的蛋白A純化的抗體和2mg生物素試劑。將板在25℃溫育1小時(shí)，隨后用PBS/0.05％v/vTween20洗滌板4次，每次2分鐘，施用100μL/孔的PBS中的NeutriAvidinHRP-綴合物(Pierce#31001；1∶1000稀釋度；0.1μL/孔)。將板在25℃溫育1小時(shí)，隨后用PBS/0.05％v/vTween20洗滌2次，每次2分鐘，隨后用H20洗滌2次，每次2分鐘。在即將使用時(shí)，通過(guò)將1個(gè)ImmunoPureOPD片劑(Pierce#34006)溶解在9mLH20中，隨后添加1mL穩(wěn)定的過(guò)氧化物緩沖液(10X，Pierce#34062)來(lái)制備底物。以100μL/孔施用底物，將板在25℃溫育，直至顯色。通過(guò)施加50μL2.5M硫酸終止反應(yīng)。在板讀數(shù)器(MolecularDevices)中測(cè)量在490nm的吸光度。免疫印跡分析從生長(zhǎng)在溫室中的植物切取葉鞘。在液氮中冷凍葉鞘組織(50mg)，將其在混合磨(RetschMM300)中以30s-1的頻率研磨2次，每次15秒。通過(guò)添加2％w/v不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％v/vTween20(75μL)和渦旋來(lái)提取樣品。隨后以14,000rpm將樣品離心10分鐘，收集上清液。向上清液(21μL)中添加NovexNuPAGE4XLDS樣品緩沖液(7.5μL)和β-巰基乙醇(1.5μL)，在70℃加熱10分鐘。通過(guò)在NovexXCe11I1mini-cell電泳儀中，在200V下于預(yù)制412％w/v聚丙烯酰胺梯度凝膠(Novex，NuPAGEbis-tris，MES緩沖液)上進(jìn)行SDS-PAGE(進(jìn)行35分鐘)來(lái)分離提取的葉鞘蛋白質(zhì)。將預(yù)染色的分子量標(biāo)記(NovexSeeBluePlus2)用作標(biāo)準(zhǔn)。使用NovexXCellmini-cell電泳儀，在具有10％v/v甲醇的NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液中，在30V下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Osmonics0.22微米NitroBind)，進(jìn)行60分鐘。轉(zhuǎn)移后，將膜在異丙醇中溫育1分鐘，隨后于TBS中洗滌5分鐘。將膜在室溫于3％w/vBSA封閉1小時(shí)，隨后在室溫用一抗(成熟NaD1或HvCPI6抗體，1mg/ml的原液以1∶1000于TBS/1％w/vBSA中稀釋)溫育過(guò)液。將膜在TBST中洗滌5次，每次10分鐘，隨后用綴合至辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗-兔IgG(Pierce，TBS中的1∶50,000稀釋物)在RT下溫育60分鐘。再進(jìn)行5次10分鐘的TBST洗滌，隨后按照制造商的說(shuō)明書，用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)溫育膜。將膜暴露于ECLHyperfilm(Amersham)。實(shí)施例1I類防衛(wèi)素的抗真菌活性從它們的天然來(lái)源(NaD2)純化或使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(γ-玉米硫堇2(γ-zesthionin2)，γ-大麥硫堇(γ-hordothionin))(如方法中所描述的)表達(dá)3種I類防衛(wèi)素?；救鏐roekaert等人(1990)FEMSMicrobiolLett69：55-60，1990中所述評(píng)估肽的抗禾谷鐮孢的抗真菌活性，將其與兩種II類茄科防衛(wèi)素(NaD1、NsD1)的所述抗真菌活性相比較。通過(guò)無(wú)菌細(xì)薄棉布過(guò)濾，從生長(zhǎng)在半濃度馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)基(PDB)中的生孢子培養(yǎng)物分離孢子。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定孢子濃度，將其在y2xPDB中調(diào)整至5x104個(gè)孢子/mL。將孢子懸浮物(80μL)和20μL過(guò)濾滅菌的(0.22甲注射器式濾器；Millipore)蛋白質(zhì)或水一起添加至無(wú)菌96孔平底微量滴定板的孔中，達(dá)到0-10μM的終蛋白質(zhì)濃度。短暫地?fù)u動(dòng)板，將其在25℃于黑暗中放置28小時(shí)(不搖動(dòng))。通過(guò)使用微量滴定板讀數(shù)器(SpectraMaxProM5e；MolecularDevices)在595nm測(cè)量光密度來(lái)評(píng)估菌絲體的生長(zhǎng)。以一式三份進(jìn)行每一個(gè)測(cè)試。結(jié)果(圖7)顯示測(cè)試的I類防衛(wèi)素顯示低抗真菌活性。實(shí)施例2II類茄科防衛(wèi)素上的NaD1環(huán)1B區(qū)域的修飾本實(shí)施例的第一方面是II類茄科防衛(wèi)素的選擇。篩選防衛(wèi)素以鑒定具有如下C末端部分的防衛(wèi)素，所述C末端部分包含SEQIDNO：52中所示的氨基酸序列或在最佳比對(duì)后與其具有至少70％相似性的氨基酸序列(表4)。圖3顯示比對(duì)的類型。SEQIDNO：50代表末端20個(gè)連續(xù)氨基酸，包括C端最末端的不變半胱氨酸殘基。NaD1、NsD1、PhD2、NeThio1和NeThio2是與SEQIDNO：52具有100％相似性的防衛(wèi)素的實(shí)例。NaD1被選擇作為II類茄科防衛(wèi)素的主鏈。該防衛(wèi)素包含具有氨基酸序列：NTFPGI(SEQIDNO：12)的環(huán)1B。氨基酸殘基NTFPGI的一個(gè)或多個(gè)被另一種氨基酸殘基置換。可改變?nèi)?個(gè)殘基，或可改變其中的1或2或3或4或5個(gè)殘基。這包括單個(gè)氨基酸置換或環(huán)1B交換。產(chǎn)生的改變的實(shí)例包括下列序列(括號(hào)內(nèi)標(biāo)示其來(lái)源一起)：HRFKGP(NaD2)[SEQIDNO：29]；QHHSFP(Zea2)[SEQIDNO：30]；DTYRGV(PsD1)[SEQIDNO：31]；PTWEGI(PsD2)[SEQIDNO：32]；DKYRGP(MsDeF1([SEQIDNO：33]；KTFKGI(SoD2)[SEQIDNO：34]；KTWSGN(DmAMP1)[SEQIDNO：35]；EGWXGK(VrD1)[SEQIDNO：36]；GTWSGV(RsAFP2)[SEQIDNO：37]；和AGFKGP(g1-H)[SEQIDNO：38]。其它實(shí)例包括選擇選自SEQIDNO：67至79的氨基酸序列。實(shí)施例3在NaD1的環(huán)變體存在下對(duì)禾谷鐮孢生米的抑制在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組NaD1和環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35，如方法中所述進(jìn)行純化?；旧先鏐roekaert等人(1990)FEMSMicrobiolLett69：55-60中所述評(píng)估這些肽抗禾谷鐮孢的抗真菌活性。通過(guò)無(wú)菌細(xì)薄棉布過(guò)濾，從生長(zhǎng)在半濃度馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)基(PDB)中的生孢子培養(yǎng)物分離孢子。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定孢子濃度，將其在y2xPDB中調(diào)整至5x104個(gè)孢子/mL。將孢子懸浮物(80μL)和20μL過(guò)濾滅菌的(0.22甲注射器式濾器；Millipore)蛋白質(zhì)或水一起添加至無(wú)菌96孔平底微量滴定板的孔中，達(dá)到0-10μM的終蛋白質(zhì)濃度。短暫地?fù)u動(dòng)板，將其在25℃于黑暗中放置28小時(shí)(不搖動(dòng))。通過(guò)使用微量滴定板讀數(shù)器(SpectraMaxProM5e；MolecularDevices)在595nm測(cè)量光密度來(lái)評(píng)估菌絲體的生長(zhǎng)。以一式三份進(jìn)行每一個(gè)測(cè)試。結(jié)果圖8舉例說(shuō)明了環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗禾谷鐮孢(Fgr)的相對(duì)抗真菌活性。在0.825ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1分別抑制禾谷鐮孢的生長(zhǎng)41.7、14.6或34.5％。在1.65ppm上，所有3種環(huán)變體相較于NaD1更多抑制禾谷鐮孢的生長(zhǎng)約70％。實(shí)施例4在NaD1的環(huán)變體存在下輪枝樣鐮孢生米的抑制將重組NaD1和環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，如方法中所述進(jìn)行純化。如實(shí)施例1中所述評(píng)估這些肽抗輪枝樣鐮孢的抗真菌活性。結(jié)果圖9舉例說(shuō)明環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗輪枝樣鐮孢(Fve)的相對(duì)抗真菌活性。在3.25ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1分別更多抑制輪枝樣鐮孢的生長(zhǎng)40.9、29.4和5.1％。在6.5ppm下，所有3種環(huán)變體相較于NaD1更多抑制輪枝樣鐮孢的生長(zhǎng)至少67％。實(shí)施例5在NaD1的環(huán)變體存在下禾生刺盤孢生長(zhǎng)的抑制將重組NaD1和環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，如方法中所述進(jìn)行純化。如實(shí)施例1中所述評(píng)估這些肽抗禾生刺盤孢的抗真菌活性。結(jié)果圖10舉例說(shuō)明環(huán)變體HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1的抗禾生刺盤孢(Cgr)的相對(duì)抗真菌活性。在13ppm下，HXP4、HXP34和HXP35相較于NaD1分別更多抑制禾生刺盤孢的生長(zhǎng)61.3、21.8或83.2％。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生通過(guò)根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因蕓苔(歐洲油菜，cvRI64)。用于轉(zhuǎn)化的DNA二元載體(pHEX138)描述于圖11。通過(guò)電穿孔將二元載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入根癌土壤桿菌，通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)質(zhì)粒的存在。將土壤桿菌的培養(yǎng)物用于感染蕓苔的下胚軸部分。在25mg/L的抗生素卡那霉素上選擇轉(zhuǎn)基因苗。使用ELISA檢測(cè)從葉提取的可溶性蛋白質(zhì)來(lái)選擇表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因植物。來(lái)自3個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(cAT93、CAT94和CAT96)的7株植物(6個(gè)事件)具有可檢測(cè)水平的HXP4(表5)。HXP4蛋白水平的范圍為0.3至2.1ppm(ngHXP4/mg葉組織的鮮重)。表5轉(zhuǎn)基因蕓苔株系HXP4水平(ppm)93.1.22.193.1.32.093.15.31.996.7.21.896.17.10.396.72.11.994.11.11.6利用油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculans)的溫室生物測(cè)定將病原體油菜莖基潰瘍病菌在室溫在10％(v/v)V8瓊脂板上生長(zhǎng)1-2周。通過(guò)用無(wú)菌水(5mL)覆蓋板，隨后括擦瓊脂的表面以取出孢子來(lái)分離器孢子。通過(guò)無(wú)菌薄紗織品過(guò)濾，將孢子與菌絲質(zhì)分離。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定濾液中的孢子濃度，用水將終濃度調(diào)整至1x106至1x107個(gè)器孢子/mL。將幼苗于小的種植盆中在溫室內(nèi)于22℃生長(zhǎng)。在種植后約10天，用26號(hào)針刺傷每一個(gè)幼苗的兩個(gè)子葉2次(2個(gè)瓣的每一個(gè)中一次)，用一滴孢子(5μL)接種受傷區(qū)域。用水接種對(duì)照。將植物在高濕度條件下維持3天以促進(jìn)孢子萌發(fā)。在接種后不超過(guò)20天評(píng)估疾病癥狀。使用數(shù)字圖像的計(jì)算機(jī)軟件分析(ImageJ)以mm2定量傷口大小。使用非參數(shù)法統(tǒng)計(jì)分析平均傷口大小。實(shí)施例7表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因玉米植物的產(chǎn)生使用標(biāo)準(zhǔn)方案，例如美國(guó)專利號(hào)5,981,840；美國(guó)專利號(hào)7,528,293；美國(guó)專利號(hào)7,589,176；美國(guó)專利號(hào)7,785,828；Frame等人(2002)PlantPhysiology129：13-22中描述的那些方法，通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或顆粒轟擊產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物。通過(guò)電穿孔將二元載體(包含GAT(作為選擇標(biāo)記)、遍在蛋白啟動(dòng)子(用于組成型表達(dá))和在組成型遍在蛋白啟動(dòng)子控制下的編碼HXP4或NaD1的密碼子最優(yōu)化序列以及編碼GAT(作為選擇標(biāo)記)的序列)轉(zhuǎn)移進(jìn)入根癌土壤桿菌菌株中。通過(guò)將未成熟玉米胚浸沒(méi)在土壤桿菌的懸浮液中，隨后在固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)一段時(shí)間來(lái)感染未成熟玉米胚。隨后任選地使胚“靜息”，在此期間將它們?cè)谥辽僖环N抑制土壤桿菌生長(zhǎng)的抗生素存在下進(jìn)行溫育。隨后通過(guò)在含抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的草甘膦的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)感染的胚來(lái)獲得轉(zhuǎn)化的愈傷組織。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法，轉(zhuǎn)化的愈傷組織隨后能夠再生成植物。通過(guò)例如ELISA篩選測(cè)定PCR陽(yáng)性植物中HXP4和NaD1的表達(dá)水平。使用方法中描述的生物測(cè)定評(píng)估以大于10ppm水平表達(dá)HXP4或NaD1的植物中增加的對(duì)禾生刺盤孢的抗性。結(jié)果當(dāng)與利用空載體轉(zhuǎn)化的植物相比較時(shí)，以大于10ppm水平表達(dá)HXP4的植物顯示損傷面積有26％的減小。以大于10ppm水平表達(dá)NaD1的植物相較于空載體對(duì)照未顯示損傷面積的減小(表8)。實(shí)施例8表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因大豆植物的產(chǎn)生通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過(guò)顆粒轟擊或其它標(biāo)準(zhǔn)方案例如美國(guó)專利號(hào)7,589,176；美國(guó)專利號(hào)7,528,293；美國(guó)專利號(hào)7,785,828中描述的那些方案產(chǎn)生表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因大豆植物。通過(guò)例如ELISA篩選對(duì)對(duì)于HXP4是PCR陽(yáng)性的再生大豆植物評(píng)估HXP4表達(dá)水平?？稍u(píng)估能育轉(zhuǎn)基因植物的基因拷貝數(shù)，在溫室生物測(cè)定中測(cè)試選擇的品系對(duì)于大豆真菌病原體的抗性。隨后在感染的土壤中在田間試驗(yàn)中和在其中用靶真菌、昆蟲或銹菌病原體人工感染大豆植物的試驗(yàn)中評(píng)估顯示對(duì)大豆真菌和銹菌及昆蟲病原體有增強(qiáng)抗性的品系。實(shí)施例9表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)生通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過(guò)顆粒轟擊或其它標(biāo)準(zhǔn)方案例如美國(guó)專利號(hào)7,785,828中描述的那些方案產(chǎn)生表達(dá)HXP4的轉(zhuǎn)基因小麥植物。通過(guò)例如ELISA篩選對(duì)對(duì)于HXP4是PCR陽(yáng)性的再生小麥植物評(píng)估HXP4表達(dá)水平?？稍u(píng)估能育轉(zhuǎn)基因植物的基因拷貝數(shù)，在溫室生物測(cè)定中測(cè)試選擇的品系對(duì)于小麥真菌病原體的抗性。隨后在感染的土壤中在田間試驗(yàn)中和在其中用靶真菌病原體人工感染小麥植物的試驗(yàn)中評(píng)估顯示對(duì)小麥真菌病原體有增強(qiáng)抗性的品系。實(shí)施例10抗人真菌病原體黑曲霉的被修飾NaD1的活性在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組NaD1和環(huán)變體HXP4，如方法中所述進(jìn)行純化。如上所述評(píng)估所述肽抗黑曲霉的抗真菌活性。結(jié)果圖12舉例說(shuō)明環(huán)變體HXP4相較于NaD1而言抗黑曲霉的相對(duì)抗真菌活性。在13ppm，HXP4相較于NaD1抑制黑曲霉的生長(zhǎng)高20.6％。這可表達(dá)為HXP4高于NaD1的112％。在26ppm和53ppm，HXP4相較于NaD1抑制生長(zhǎng)高至少10％。實(shí)施例11抗隱球酵母屬的種的被修飾NaD1的活性在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組NaD1和環(huán)變體HXP4，如方法中所述進(jìn)行純化。如上所述，評(píng)估肽抗新型隱球酵母的兩個(gè)菌株和C.gatti的一個(gè)菌株的抗真菌活性。結(jié)果圖13A舉例說(shuō)明環(huán)變體HXP4相較于NaD1而言抗新型隱球酵母(C1065)的相對(duì)抗真菌活性。在13ppm，HXP4完全抑制此酵母的生長(zhǎng)，然而NaD1僅抑制～16.7％。因此，HXP4的活性超過(guò)NaD1的596％。在6.5ppm，兩種蛋白質(zhì)都未顯示顯著的活性。圖13B舉例說(shuō)明NaD1和HXP4抗新型隱球酵母的另一菌株(C2067)的相對(duì)抗真菌活性。在6.5ppm，HXP4抑制生長(zhǎng)超過(guò)80％，然而NaD1僅抑制生長(zhǎng)少于4％。在抗C.gattii方面(圖13C)，HXP4在13ppm相較于NaD1而言抑制生長(zhǎng)高10％，在6.5ppm上相較于NaD1而言抑制生長(zhǎng)高38％。實(shí)施例12II類茄科防衛(wèi)素的環(huán)1B區(qū)域的修飾，TPP3作為主鏈將TPP3(SEQIDNO：5)選擇作為II類茄科防衛(wèi)素主鏈。該防衛(wèi)素包含具有氨基酸序列：QTFPGL(SEQIDNO：15)的環(huán)1B。將環(huán)1B序列改變成NaD2(HRFKGP)的序列[SEQIDNO：29]。在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)此嵌合蛋白質(zhì)(HXP107)，如方法中所述進(jìn)行純化。如實(shí)施例1中所述評(píng)估所述肽抗禾谷鐮孢的抗真菌活性以及其抗昆蟲活性。HXP107的氨基酸序列示于SEQIDNO：85。結(jié)果：HXP107蛋白保持了抗禾谷鐮孢(Fgr)的抗真菌活性，IC50為0.5μM。該活性有利地與親代蛋白質(zhì)TPP3的活性相當(dāng)，后者的IC50值為0.2μM。實(shí)施例13II類茄科防衛(wèi)素NsD1、C20和SL549的環(huán)1B區(qū)域的修飾將NsD1(SEQIDNO：49)、C20(從辣椒屬分離的)(SEQIDNO：58)和SL549(從煙草屬分離的)(SEQIDNO：59)選擇作為II類茄科防衛(wèi)素主鏈。此類防衛(wèi)素分別包含具有如下氨基酸序列的環(huán)1B：NTFPGI(SEQIDNO：12)、KYFKGL(SEQIDNO：60)和NTFPGI(SEQIDNO：12)。將環(huán)1B中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用另一個(gè)氨基酸殘基置換。可改變?nèi)?個(gè)殘基，或可改變其中1或2或3或4或5個(gè)殘基。這包括單個(gè)氨基酸置換或環(huán)1B交換。改變的實(shí)例包括下列序列(括號(hào)中列明了其來(lái)源)：HRFKGP(NaD2)[SEQIDNO：29]；QHHSFP(Zea2)[SEQIDNO：30]；DTYRGV(PsD1)[SEQIDNO：31]；PTWEGI(PsD2)[SEQIDNO：32]；DKYRGP(MsDeF1([SEQIDNO：33]；KTFKGI(SoD2)[SEQIDNO：34]；KTWSGN(DmAMP1)[SEQIDNO：35]；EGWXGK(VrD1)[SEQIDNO：36]；GTWSGV(RsAFP2)[SEQIDNO：37]；和AGFKGP(g1-H)[SEQIDNO：38]。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)1B被選自SEQIDNO：67至79的序列所置換。在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組環(huán)變體，如方法中所述進(jìn)行純化。如實(shí)施例1中所述評(píng)估所述肽抗真菌病原體例如禾谷鐮孢，尖鐮孢、禾生刺盤孢和輪枝樣鐮孢的抗真菌活性。實(shí)施例14HXP4與蛋白酶抑制劑抗禾谷鐮孢和禾生刺盤孢的協(xié)同作用從Genscript獲得編碼大麥I型抑制劑CI-1B(SEQIDNO：63)、花煙草I型抑制劑NaPin1A、番茄半胱氨酸蛋白酶抑制劑SlCys9(SEQIDNO：64)、稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑Os1a(SEQIDNO：65)和大麥半胱氨酸蛋白酶抑制劑HvCPI6(SEQIDNO：66)的成熟結(jié)構(gòu)域的DNA。使用SacII和SacI從載體pUC57切下插入物，使用Perfectprep試劑盒(Eppendorf)從瓊脂糖凝膠提取插入物，將其連接入pHUE，隨后將其用于轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌細(xì)胞。分離質(zhì)粒DNA，隨后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-GamiB細(xì)胞。將大腸桿菌Rosetta-GamiB的單個(gè)菌落用于接種包含氨芐青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四環(huán)素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.05mg/mL)的2YT培養(yǎng)基(10mL，16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/LNaC1)，在搖動(dòng)的條件下在37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。將該培養(yǎng)物用于接種包含氨芐青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四環(huán)素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.05mg/mL)的2YT培養(yǎng)基(500mL)，隨后將其生長(zhǎng)4小時(shí)至～1.0的光密度(600nm)。隨后添加IPTG(0.5mM的終濃度)，在16℃將培養(yǎng)物再生長(zhǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心(4,000g，4℃，進(jìn)行20分鐘)收獲細(xì)胞，將其重懸浮于天然裂解緩沖液(20mL/升細(xì)胞培養(yǎng)物，50mMNaH2PO4，300mMNaC1，10mM咪唑，pH8.0)，于-80℃下冷凍。隨后解凍細(xì)胞，在4℃用溶菌酶(5mg/25mL重懸浮細(xì)胞)處理20分鐘。隨后添加DNA酶I(125uL，2mg/mL，于20％v/v甘油，75mMNaCl中)和MgCl2(125uL，1M)，在搖擺平臺(tái)上將樣品在室溫溫育40分鐘。隨后在冰上超聲處理(80％w/v強(qiáng)度，Bransonsonifier450)樣品2次，每次30秒，隨后進(jìn)行離心(20,000g，4℃，進(jìn)行30分鐘)。隨后按照制造商的說(shuō)明書，在非變性條件下，使用Ni-NTA樹脂(1.5mL至～25mL非變性蛋白質(zhì)提取物，Qiagen)，利用固定化金屬親和層析(IMAC)從蛋白質(zhì)提取物純化六組氨酸標(biāo)記的遍在蛋白-融合蛋白(His6-Ub-NaCys1，2，3)。使用洗脫緩沖液(250mM咪唑，200mMNaCl，50mMNaH2P04，pH8.0)洗脫重組蛋白質(zhì)。通過(guò)將洗脫的蛋白質(zhì)用于利用50mMTris.Cl，100mMNaCl，pH8.0平衡的預(yù)裝SephadexG50凝膠過(guò)濾柱(PD-10，Amersham)來(lái)除去咪唑。使用去泛素化酶6H.Usp2-cc(Catanzariti等人(2004)，ProteinScience73：1331-1339)從重組蛋白質(zhì)切割除去六組氨酸標(biāo)記的遍在蛋白。去泛素化蛋白酶抑制劑作為未結(jié)合的蛋白，通過(guò)另一輪IMAC除去切割的標(biāo)記。隨后這可通過(guò)反向HPLC進(jìn)一步純化。將重組CI-1B、S1Cys9和Os1a在H2O中制備為原液(20μM)。來(lái)自牛胰腺的I-P型胰蛋白酶抑制劑(Anderson和Kingston(1983)，Proc.Natl.Acad.USA80：6838-6842)購(gòu)自Sigma(T0256)，并且被稀釋至20μM(于H2O中)的濃度?；旧先鏐roekaert等人，(同上)1990所描述的，測(cè)量HXP4和NaD1與絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑組合對(duì)禾谷鐮孢或禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminco1a)生長(zhǎng)的抑制作用。從合成的缺乏營(yíng)養(yǎng)的瓊脂(SNPB，禾谷鐮孢)或V8瓊脂(禾生刺盤孢)上生長(zhǎng)的生孢子培養(yǎng)物分離孢子，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。其中如實(shí)施例1中所述在96孔微量滴定架中進(jìn)行抗真菌測(cè)定。用10μL過(guò)濾滅菌(0.22μm注射器式濾器，Millipore)的NaD1(2.5μM)、HXP4(2.5μM)或水與10μL過(guò)濾滅菌的(0.22μm注射器式濾器，Mil1ipore)蛋白酶抑制劑或水以及80μL5x104個(gè)孢子/mL(于1/2×PDB中)一起加載至孔中。將板在25℃進(jìn)行溫育。使用微量滴定板讀數(shù)器(SpectraMaxProM2；MolecularDevices)通過(guò)測(cè)量在595nm的光密度(A595)來(lái)測(cè)定真菌生長(zhǎng)。以一式四份進(jìn)行每一個(gè)測(cè)試。結(jié)果當(dāng)以相同濃度測(cè)試時(shí)，HXP4與蛋白酶抑制劑具有比NaD1更強(qiáng)的抗禾谷鐮孢的協(xié)同作用。HXP4與蛋白酶抑制劑一起也協(xié)同抗禾生刺盤孢。協(xié)同作用計(jì)算示于表6和7，其中Ee是按照Limpe1的公式(Richer等人PesticSci19：309-315)來(lái)自累加反應(yīng)的預(yù)期作用(表達(dá)為百分比抑制)，Io是觀察到的百分比抑制。利用所有4種蛋白酶抑制劑均獲得了協(xié)同作用，即Io值高于Ee值。實(shí)施例15HXP4和HvCP16抗禾谷鐮孢的植物內(nèi)協(xié)同作用使用實(shí)施例7中所述的方法產(chǎn)生表達(dá)HXP4，HvCPI6或HXP4+HvCPI6的轉(zhuǎn)基因玉米植物，使用方法中描述的生物測(cè)定評(píng)估其增加的對(duì)禾谷鐮孢的抗性。圖15提供了用于在玉米中表達(dá)的HvCPI6構(gòu)建體，圖16提供了用于在玉米中表達(dá)的HXP4+HvCP16構(gòu)建體。結(jié)果僅表達(dá)HXP4或僅表達(dá)HvCPI6的植物相較于用空載體轉(zhuǎn)化的植物而言未顯示傷口面積的減小。表達(dá)HXP4+HvCPI6的植物相較于空載體對(duì)照而言顯示傷口面積減小45％(表9)。實(shí)施例16HXP4對(duì)亞洲大豆銹菌的作用從花煙草的花分離NaD1，在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)環(huán)變體HXP4，如方法中所述進(jìn)行純化。測(cè)試HXP4對(duì)亞洲大豆銹菌(豆薯層銹菌)的作用，將其與NaD1相比較。在100、10、1和0.1ppm(于水中)的肽存在或不存在的情況下，將豆薯層銹菌夏孢子在置于瓊脂滴上的賽璐玢上生長(zhǎng)。在第24小時(shí)和48小時(shí)，使用顯微鏡評(píng)估萌發(fā)、附著胞形成和附著胞后結(jié)構(gòu)的形成。每個(gè)處理檢查3張膜，每張膜評(píng)估50個(gè)分離的幼體。結(jié)果檢查對(duì)萌發(fā)(24小時(shí)；圖14A)、附著胞形成(24小時(shí)；圖14B)和附著胞后結(jié)構(gòu)形成(48小時(shí)；圖14C)的效果。在10ppm，HXP4抑制萌發(fā)的水平比NaD1更有效62％，然而附著胞形成和附著胞后結(jié)構(gòu)形成的抑制相較于NaD1而言更有效65％和59％。實(shí)施例17鑒定新型環(huán)1B序列的高通量篩選使用Phusion(注冊(cè)商標(biāo))定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Finnzymes)進(jìn)行NaD1的定點(diǎn)誘變。設(shè)計(jì)在5′末端磷酸化的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物以將6個(gè)隨機(jī)氨基酸突變摻入環(huán)1B。將pHUE系統(tǒng)用于環(huán)1B變體文庫(kù)的表達(dá)。根據(jù)實(shí)施例14中描述的方法略微改進(jìn)表達(dá)和純化，以使得能夠在48孔板中表達(dá)和在96孔濾板中純化。在35個(gè)循環(huán)(利用66℃的退火溫度，進(jìn)行30秒)的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增完整模板質(zhì)粒(pHUE-NaD1)。隨后使用T4DNA連接酶在16℃環(huán)化所述線性PCR產(chǎn)物，進(jìn)行過(guò)夜，隨后按照制造商的說(shuō)明書將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入電感受態(tài)Rosetta-GamiB(DE3)細(xì)胞。將恢復(fù)的細(xì)胞涂板在含有氨芐青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四環(huán)素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)的2YT瓊脂上，在37℃溫育過(guò)夜。將單個(gè)菌落接種在96孔板中的150μL含有氨芐青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四環(huán)素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)的2YT。將利用pHUE-NaD1轉(zhuǎn)化的Rosetta-GamiB(DE3)用作陽(yáng)性對(duì)照。在持續(xù)搖動(dòng)的條件下，將板在37℃、70％濕度下溫育過(guò)夜。將每孔50微升轉(zhuǎn)移至2.5mL的2YT抗生素中，如實(shí)施例13中所述進(jìn)行表達(dá)和純化。測(cè)試蛋白質(zhì)抗禾生刺盤孢的活性。將15微升的蛋白質(zhì)溶液添加至105μL的孢子溶液以產(chǎn)生2x104個(gè)孢子/mL(于y2x馬鈴薯右旋糖液體培養(yǎng)基(包含0.5mMCaC12，25mMKC1)中)的終濃度。將板在25℃溫育，40小時(shí)后，通過(guò)使用微量滴定板讀數(shù)器(SpectraMaxProM5e；MolecularDevices)測(cè)量在595nm的光密度來(lái)測(cè)定真菌生長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)定用于表達(dá)的細(xì)菌菌落的質(zhì)粒DNA的序列來(lái)鑒定抑制真菌生長(zhǎng)的水平等于或大于NaD1對(duì)照的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)在篩選中鑒定的單個(gè)菌落具有與NaD1的環(huán)1B序列相同的環(huán)1B序列。選擇幾個(gè)菌落用于大規(guī)模純化和測(cè)試。如實(shí)施例14中所述表達(dá)蛋白質(zhì)，如實(shí)施例1中所述測(cè)試其抗禾谷鐮孢和禾生刺盤孢的活性。環(huán)1B的序列標(biāo)識(shí)符列于表10中。表6HXP4相比NaD1而言與蛋白酶抑制劑組合抗Fgr的協(xié)同作用表7HXP4與蛋白酶抑制劑組合抗Cgr的協(xié)同作用表8表達(dá)HXP4或NaD1的轉(zhuǎn)基因玉米植物抗Cgr的保護(hù)作用表9表達(dá)HXP4與HvCPI6組合的轉(zhuǎn)基因玉米植物抗Fgr的保護(hù)作用表10來(lái)自抑制禾生刺盤孢的生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的環(huán)1B序列本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除文中明確指明的以外，本文中描述的公開內(nèi)容可以變化和改動(dòng)。應(yīng)理解，本公開內(nèi)容包括所有此類變化和改動(dòng)。本公開內(nèi)容還單個(gè)地或一起地包括本說(shuō)明書中提及或引述的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及此類步驟或特征的任意兩個(gè)或更多個(gè)的任何和所有組合。參考書目Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25：3389AndersonandKingston(1983)，Proc.Natl.Acad.USA80：6838-6842，1983Ausubel等人(1994-1998)(In：CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley＆SonsInc.Berrocal-Lobo等人(2002)PlantPhysiol128(3)：951-961Bevan(1984)NucleicAcidsResearch12：8711-8721BlochandRichardson(1991)FEBSLett279(1)：101-104BonnerandLaskey(1974)EurJBiochem46：83-88Broekaert等人(1990)FEMSMicrobiolLett69：55-60Catanzariti等人(2004)ProteinScience13：1331-1339Chang等人(2005)MolBiolCe1116(10)：4941-4953Colilla等人(1990)FEBSLett270(1-2)：191-194DeSamblanx等人(1997)JBiolChem272(2)：1171-1179Frame等人(2002)PlantPhysiol129：13-22Gao等人(2000)NatBiotechnol18(12)：1307-1310Janssen等人(2003)Blochemistry42(27)：8214-8222Jha等人，(2009)TransgenicRes18(1)：59-69JonesandDangl(2006)Nature444(7117)：323-329Lay等人(2003)PlantPhyslol131(3)：1283-1293LiandAsiegbu(2004)JPlantRes117(2)：155-162Lin等人(2007)Proteins68(2)：530-540MarmurandDoty(1962)JMolBiol5：109-118Metlen等人(2009)PlantCellEnviron32（6）：641-653Nurnberger等人(2004)ImmunolRev198：249-266Richer(1987)PesticSci19：309-315Schaaper等人(2001)J.Pept.Res.57(5)：409-418Showalter(1993)PlantCell5(1)：9-23Spelbrink等人(2004)PlantPhyslol135(4)：2055-2067vanderWeerden等人(2008)JBiolChem283(21)：14445-14452WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup，575ScienceDriveMadison，WI，USAYountandYeaman(2005)ProteinPeptLett72(1)：49-67