提高維生素b6含量在提高水稻對(duì)于細(xì)菌性條斑病抗性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高水稻對(duì)于細(xì)菌性條斑病抗 性的相關(guān)基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病 毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果：（1)病原體成功的在寄主植物內(nèi) 繁殖，引起相關(guān)病癥；（2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基 因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過程。參與植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 類：（1)抗病基因，又稱R(resistanCe)基因和（2)抗病相關(guān)基因。
[0004] 根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直 接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑（Tang等，1996， Science 274:2060-2063 ;Baker 等，1997, Science 276:726-733 ;Jia 等，2000, EMBO J. 19:4004-4014;Dangl 和 Jones，2001，Nature 411:826-833 ;Nimchuk 等，2001，Curr. Opin. Plant Biol. 4:288-294)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于 下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的資源有限，如目前知道 的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗 病基因也只有大約40個(gè)；（2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有 限；（3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
[0005] 抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與 合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參與信號(hào)傳導(dǎo)或參與防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病 原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差 異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因（Maleck等，2000，Nature Genet. 26 :403-410 ;Schenk 等，2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science in China 45:449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基 因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基 因資源：（1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因 是具有持久抗性的基因資源；（2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參與的抗病反應(yīng)沒有病原特異性， 因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；（3)這類基因的資源豐富。
[0006] 植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長期以來研究者們對(duì)這兩大類抗病 反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性（Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New York)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性（Ou 等，1975， Phytopathology 65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性（Parlevliet，1979，Annu. Rev. Phytopathol. 1:203-222)。質(zhì)量抗性（或垂直抗性或完全抗性）是抗病基因介導(dǎo)的抗病反 應(yīng)。數(shù)量抗性（或水平抗性或部分抗性）是由數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus， QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無病原特異性，而且抗性持久（Roumen，1994, Rice Blast Disease，Zeigler 等編著，CAB International，Cambridge，UK，ρρ· 245-265)。目前，人們 對(duì)植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然水稻中已經(jīng)鑒定出了大量抗病〇11，如 抗白葉枯病 QTL(Li 等，1999, Mol. Gen. Genet. 261 :58-63)、抗稻瘟病 QTLCffang 等，1994， Genetics 136:1421-1434 ;Chen 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2544-2549)、抗 紋枯病 QTL (Li 等，1995, Theor. Appl. Genet. 91:382-388)和抗病毒病 QTL (Albar 等，1998， Theor. Appl. Genet. 97:1145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用于水稻品種抗病性 的改良。
[0007] 近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)，提示這些 抗病相關(guān)基因可能就是相對(duì)應(yīng)的QTL。抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng) 這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻（Xiong等，2002,中國科學(xué)45:518-526 ; Ramal ingam 等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact. 16:14_24;Wen 等，2003，Mol. Gen.Genomics 269:331-339 ;Chu 等，2004，Mol.Gen. Genomics 271:111-120)、小 麥（Faris 等，1999, Theor. Appl.Genet. 98:219-225)、豆類（Geffroy 等，2000, Mol. Plant-Microbe Interact. 13:287-296)和馬鈴薯（Trognitz 等，2002，Μ〇1· Plant-Microbe Interact. 15:587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因 提供了依據(jù)。
[0008] 水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因 此，了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減 少或避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)水稻抗病機(jī)理研究的前提。 同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通 過超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的 抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。因此如何利用水稻抗病基 因的克隆獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，基于提高維生素 B6含量可以提高水 稻對(duì)于細(xì)菌性條斑病抗性這一基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將維生素 B6合成 基因 Osroxi的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花11，Osroxi家族基因表達(dá)量顯著提高的遺 傳轉(zhuǎn)化水稻中維生素 B6水平顯著提高，對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性明顯增強(qiáng)，而Osroxi家族基 因抑制表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化水稻中維生素 B6顯著降低，對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性明顯減弱，進(jìn)而 進(jìn)一步驗(yàn)證了維生素 B6及其合成基因 Osroxi在水稻抗細(xì)菌性條斑病中發(fā)揮重要作用及其 應(yīng)用價(jià)值。
[0010] 發(fā)明人經(jīng)過進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，提高維生素 B6含量可以提高水稻對(duì)于細(xì)菌性條 斑病抗性，而提高維生素 B6含量的各種方式均可取得上述的效果，其中可以利用超量表達(dá) 相關(guān)基因的方式來提高維生素 B6水平，同樣的，也可以采用維生素 B6噴施處理、或在肥料 中直接添加維生素 B6含量來獲得相同的效果，其中：
[0011] 發(fā)明人提供了一個(gè)從水稻中分離獲得的水稻抗細(xì)菌性條斑病相關(guān)基因家族 OsPDXl，該基因家族包括3個(gè)成員，OsPDXL I、OsPD)(L 2和OsPDXL 3,其中：
[0012] OsPDXl. 1，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0013] OsPDXl. 2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID No. 5 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
[0014] OsPDXl. 3,其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示。
[0015] 上述三個(gè)相關(guān)基因編碼的蛋白是一個(gè)維生素 B6蛋白，負(fù)責(zé)水稻中維生素 B6的從 頭合成。
[0016] 發(fā)明人進(jìn)而利用超表達(dá)和RNA干擾技術(shù)使目標(biāo)基因在植物體內(nèi)過量表達(dá)和沉默， 來鑒定該基因在抗病反應(yīng)過程中所起作用，最終發(fā)現(xiàn)抑制表達(dá)任一 Osroxi家族基因的轉(zhuǎn) 基因植株維生素 B6水平顯著降低，對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病的抗性水平明顯降低，而超量表達(dá) 任一 Osroxi家族基因的轉(zhuǎn)基因植株維生素 B6水平顯著提高，抗病能力顯著提高，可獲得高 抗病植株。
[0017] 在上述技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人采用對(duì)應(yīng)的特異性引物，利用PCR技術(shù)可以從基因 組中擴(kuò)增得到上述Osroxi. 1、OsPDXl. 2、Osroxi. 3基因片段，之后與合適的超表達(dá)載體連 接轉(zhuǎn)入植物中去即可實(shí)現(xiàn)上述基因的超量表達(dá)，進(jìn)而提高維生素 B6的含量，產(chǎn)生抗細(xì)菌性 條斑病病的轉(zhuǎn)基因植物，而采用這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達(dá)到 的。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國際上首次首次驗(yàn)證了維生素 B6及其合成基因家 族Osroxi在水稻細(xì)菌性條斑病抗性中的功能，進(jìn)而利用超量表達(dá)的方式使轉(zhuǎn)基因植株維 生素 B6水平顯著提高，抗病能力顯著提高，獲得高抗病植株，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0019] 圖1.0 sPDn. UOsPDXL 2、0sPDn· 3基因完整片段在中花11基因組DNA中的PCR 分離擴(kuò)增示意圖；
[0020] 圖中，獲得用于構(gòu)建超量表達(dá)載體的目的基因條帶，其中Osroxi. 1基因條帶大小 為957bp，OsPDn. 2基因條帶大小為942bp，OsPDn. 3基因條帶大小為1092bp ;
[0021] 圖2. Osroxi基因抑制片段在中花11基因組DNA中的PCR分離擴(kuò)增示意圖；
[0022] 圖中，利用引物OsroXIRNAiF/OsPDXIRNAiR擴(kuò)增獲得目的基因抑制表達(dá)條帶大小 414bp ；
[0023] 圖3.含抑制表達(dá)載體DS1301: :0sroXl的中花11遺傳轉(zhuǎn)化植株（CD13-22)的PCR 檢測示意圖；
[0024] 圖中，利用引物ds 1301 S2F2/ds 1301S2R2對(duì)CD 13-22轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測