A)。這些siRNA與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子（mRNA)互補(bǔ)配對， 在細(xì)胞內(nèi)特殊酶的作用下使目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子降解，從而在mRNA水平上抑制目標(biāo)基因的 功能。而超表達(dá)技術(shù)則是將目的基因連入具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動(dòng)子的 表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化植物后在強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下，目的基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本底水平。研究 者可以通過轉(zhuǎn)基因植株表型的改變，驗(yàn)證目標(biāo)基因的功能。
[0082] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Lin和Zhang，2005)將DS1301: :0sroXl導(dǎo)入 水稻品種中花11中，獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株分別被命名為⑶13-22 ;將pCXUN: :0sroxi. 1、 pCXUN: :0sroxi. 2、pCXUN: :0sroxi. 3導(dǎo)入水稻品種中花11，獲得的轉(zhuǎn)化植株被命名為 CD13-23、CD13-24、CD13-25。
[0083] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要步驟和試劑如下：
[0084] (1)試劑和溶液縮寫
[0085] 6-BA (6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺噪呤）；CN(Carbenicillin，駿節(jié)青霉素）； KT(Kinetin，激動(dòng)素）；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA(Indole-3_acetic acid，Π 引噪乙酸）；2, 4_D(2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid，2, 4-二氯苯氧乙酸）； AS(Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）； HN(Hygromycin B，潮霉素）；DMS0(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞諷）；N6max(N6 大量成分 溶液）；N6mix (N6小量成分溶液）；MSmax (MS大量成分溶液）；MSmix (MS小量成分溶液）
[0086] (2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟
[0087] 愈傷誘導(dǎo)
[0088] (1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70 %的乙醇處理1分鐘，0. 15 %氯化汞 (HgCl2) 15 分鐘；
[0089] (2)滅菌水洗種子4-5次；
[0090] (3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
[0091] (4)置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1°C。
[0092] 愈傷繼代
[0093] 挑選亮黃色、緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫 度 25±1°C。
[0094] 預(yù)培養(yǎng)
[0095] 挑選緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25±1°C。
[0096] 農(nóng)桿菌培養(yǎng)
[0097] (1)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28°C ;
[0098] (2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。
[0099] 農(nóng)桿菌侵染
[0100] (1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；
[0101] (2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D600 0· 8-1. 0 ;
[0102] (3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
[0103] (4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20。。。
[0104] 愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
[0105] (1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
[0106] (2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素（CN)的滅菌水中30分鐘；
[0107] (3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
[0108] (4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。（第一次潮霉素篩選濃度為 400ppm，第二次以后為250ppm)
[0109] 分化
[0110] (1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；
[0111] (2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。
[0112] 生根
[0113] (1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；
[0114] (2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。
[0115] 移栽
[0116] 洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保 持水分濕潤。
[0117] 本發(fā)明共獲得⑶13-22獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株13株，⑶13-23獨(dú)立植株13株，⑶13-24植株 18株，⑶13-25獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株13株。用DS1301載體上二鏈克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物 dsl301S2F2/dsl301S2R2 (表1)對CD13-22轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR陽性檢測，獲得部分典型陽性 結(jié)果（圖3)。用pCXUN載體Hpt基因的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物HptF2/HptR2(表1)對CD13-23、 ⑶13-24、⑶13-25轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行陽性檢測，獲得部分陽性檢測結(jié)果（圖4, 5和6)。最終，獲 得CD 13-22、CD 13-23、CD 13-24、CD 13-25陽性植株分別為9株、13株、17株、9株。對部分轉(zhuǎn) 基因植株和野生型水稻在成株期階段注射接種水稻細(xì)菌性條斑病菌RS105,與野生型中花 11植株相比，OsPDXl超量表達(dá)陽性植株的抗性顯著增強(qiáng)（P〈0. 05)(圖9和10)，Osroxi抑 制表達(dá)陽性植株的抗性水平明顯降低（圖12)。
[one] 為了進(jìn)一步確認(rèn)Osroxi超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對水稻細(xì)菌性條斑病菌的抗性，在τ 1代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了 RS105接種，與野生型對照中花11相比，Osroxi超量表達(dá)陽性植株 的抗性顯著增強(qiáng)（Ρ〈〇· 05)(表2)。
[0119] 表2 Osroxi超量表達(dá)Tl代轉(zhuǎn)基因植株接種RS105a表型
CN 105177018 A 說明書 10/11 頁
[0122] 3所有水稻材料在成株期接種
[0123] b每個(gè)單株接種3片葉子
[0124] ε P值結(jié)果是與中花11比較得到
[0125] 為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強(qiáng)與減弱是否與Osroxi基因的表達(dá)量相 關(guān)，本發(fā)明采用實(shí)施例1中的實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了 Osroxi基因在不同的遺傳轉(zhuǎn)化 株系中的表達(dá)量（圖7、8和11)。
[0126] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中Osroxi基因的表達(dá)量變化與植株的表型變化密切 相關(guān)。本發(fā)明提供具有代表性的可靠結(jié)果進(jìn)行說明?？共⌒詼p弱的典型陽性轉(zhuǎn)化植株 ⑶13-22中Osroxi基因的表達(dá)量與對照材料中花11相比顯著減少（圖11)，同時(shí)Osroxi. 1、 Osroxi. 2缺失突變體植株也比對應(yīng)的野生型對照更加易感細(xì)菌性條斑病菌（圖13)，而 Osroxi基因的表達(dá)量在⑶13-23、⑶13-25株系中相應(yīng)的增高（圖7和8)。該結(jié)果說明了 Osroxi基因的編碼產(chǎn)物在水稻抗細(xì)菌性條斑病反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控因子的作用。超量表達(dá)水 稻中Osroxi基因，可增強(qiáng)水稻對細(xì)菌性條斑病的抗性，從而可以改良水稻對細(xì)菌性條斑病 的抗性。
[0127] 實(shí)施例3維生素 Β6提高水稻對細(xì)菌性條斑病的抗性
[0128] 上述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中維生素 Β6的水平變化與植株對細(xì)菌性條 斑病抗性的變化密切相關(guān)。本發(fā)明提供具有代表性的可靠結(jié)果進(jìn)行說明?？共⌒詼p弱的典 型陽性轉(zhuǎn)化植株⑶13-22中維生素 Β6水平與對照材料中花11相比顯著減少（圖15)。而 OsroXl基因的表達(dá)量在⑶13-23、⑶13-25株系中相應(yīng)的增高（圖14)。該結(jié)果說明了維生 素 Β6正調(diào)控水稻對細(xì)菌性條斑病的抗性。
[0129] 為進(jìn)一步驗(yàn)證維生素 Β6在水稻抗細(xì)菌性條斑病菌中的作用，本發(fā)明采用維生素 Β6溶液（ImM維生素 Β6,0. 02% TWEEN 20)噴施處理水稻中花11，噴施處理1小時(shí)后接種細(xì) 菌性條斑病菌。與對照處理（0.02% TWEEN 20)相比，維生素 Β6處理顯著降低細(xì)菌性條斑 病病斑長度（圖16)，該結(jié)果說明維生素 Β6處理顯著提高水稻對細(xì)菌性條斑病的抗性。除 此之外現(xiàn)有各種提高維生素 Β6含量的處理，均可以提高水稻對細(xì)菌性條斑病的抗性。
[0130] 實(shí)施例4維生素 Β6合成基因 OsroXl提高水稻株高和千粒重
[0131] 超量表達(dá)Osroxi的轉(zhuǎn)化植株中維生素 Β6的水平變化與植株株高的變化密切相 關(guān)。本發(fā)明提供具有代表性的可靠結(jié)果進(jìn)行說明。維生素 Β6水平提高的轉(zhuǎn)化植株CD13-23 和⑶13-25的株高對照材料中花11相比顯著增加（圖17)。同時(shí)，維生素 Β6水平提高的轉(zhuǎn) 化植株⑶13-23水稻千粒重對照材料中花11相比顯著增加（圖18)。該結(jié)果說明了維生素 Β6正調(diào)控水稻的株高和千粒重。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 提高水稻中維生素B6含量在提高水稻對于細(xì)菌性條斑病抗性中的應(yīng)用。2. 維生素B6合成基因OsPDXl，其特征在于：包括3個(gè)相關(guān)基因OsroXLUOsPDXl. 2和 OsPDXL3,其中： OsPDXl. 1，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示，其編碼核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示， 其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 7所示； OsPDXl. 2,其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示， 其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 8所示； OsPDXl. 3,其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示，其編碼核苷酸序列如SEQIDNo. 6所示， 其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 9所示。3. 維生素B6合成基因OsroXl提高水稻對于細(xì)菌性條斑病抗性中的應(yīng)用。4. 維生素B6合成基因OsroXl在提高水稻株高和千粒重中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，基于提高維生素B6含量可以提高水稻對于細(xì)菌性條斑病抗性這一基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將維生素B6合成基因OsPDX1的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花11，OsPDX1家族基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻中維生素B6水平顯著提高，對細(xì)菌性條斑病的抗性明顯增強(qiáng)，而OsPDX1家族基因抑制表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化水稻中維生素B6顯著降低，對細(xì)菌性條斑病的抗性明顯減弱，進(jìn)而進(jìn)一步驗(yàn)證了維生素B6及其合成基因OsPDX1在水稻抗細(xì)菌性條斑病中發(fā)揮重要作用及其應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00
【公開號】CN105177018
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】丁新華, 儲(chǔ)昭輝, 劉海峰, 吳濤
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年7月8日