本發(fā)明涉及正電子標記納米探針⁶⁸ga-nota-dgl-ac及其制備方法與用途，屬于醫(yī)學領域。

背景技術：

納米材料是指一維空間尺寸<100nm的一類材料，由于其特殊的體積及結構使其具有一些特殊性質，例如表面活性好、低毒性、催化能力高以及不易受體內(nèi)和細胞內(nèi)各種酶降解等。納米材料的種類非常豐富，用于分子影像學研究領域的納米材料可分為有機和無機兩大類，其中有機納米材料包括樹狀聚合物、脂質體、膠團、鐵蛋白等；無機納米材料包括量子點、氧化鐵、金納米顆粒、超順磁稀土離子等。樹狀大分子是1985年由美國密歇根化學研究所的tomalia等和南佛羅里達大學的newkome等幾乎同時獨立開發(fā)的一類新型高分子材料。從其誕生到現(xiàn)在，雖然只有短短的三十年，由于其新奇的結構、獨特的性能和潛在的應用前景而備受關注。

樹狀大分子多聚賴氨酸(dendrigraftpoly-l-lysine，dgl)是近年來新開發(fā)的一種樹枝狀高分子，除了具備樹枝狀高分子的共有特性，如雙親性、內(nèi)部空腔和荷正電性，還易于降解成生物可利用的氨基酸，具有良好的生物相容性，抗菌性，無免疫原，和低毒性。此外，由于結構不太擁擠，他們的樹突狀框架能夠攜帶大量的分子物。例如dgl最近作為納米磁共振成像造影劑(與釓配合物混合后)，作為穿越血腦屏障的基因遞釋載體，或通過脂質體和細胞膜轉運，這些例子表明這類新型大分子可用于大部分樹枝狀大分子的應用開發(fā)如基因治療、藥物遞釋和生物成像。

近年來，⁶⁸ga標記多肽的正電子發(fā)射體已經(jīng)開始展開應。⁶⁸ga不依賴加速器生產(chǎn)，由⁶⁸ge/⁶⁸ga發(fā)生器制備，制備方法簡便，能夠在15min內(nèi)達到95％以上的放射性標記產(chǎn)率，且⁶⁸ga的半衰期為67.6min，其核素性質優(yōu)良，血液清楚較快，病人受到的輻射相對較少，因此近年來成為正電子藥物研究的重點研究對象。對于樹狀大分子多聚賴氨酸中的放射性標記研究較少，因此本研究進行了⁶⁸ga對dgl標記方法的探討。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷而提供一種新型的正電子標記納米探針⁶⁸ga-nota-dgl-ac，所述探針具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可在活體血液中循環(huán)、放化產(chǎn)率高，所述正電子標記納米分子探針的制備方法簡單、快速。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：一種化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac。

另外，本發(fā)明公開一種化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac的制備方法，其采用⁶⁸ga對前體dgl-nota-ac進行放射性標記，即得化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac。

優(yōu)選的，所述化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac的制備方法包括以下步驟：(1)取適量稀鹽酸對鍺-鎵發(fā)生器進行淋洗，收集洗脫液，選取活度最大的洗脫液；(2)向步驟(1)所得的活度最大的洗脫液中加入醋酸鈉溶液，調整ph，然后加入到dgl-nota-ac醋酸鈉緩沖液中；(3)將步驟(2)所得混合溶液進行避光反應，反應結束即得⁶⁸ga-nota-dgl-ac。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中稀鹽酸的濃度為0.05mol/l，對鍺-鎵發(fā)生器進行淋洗的淋洗流率1ml/min。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中醋酸鈉溶液的濃度為1.0mol/l。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中調整ph到4.0-4.2。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中避光反應的條件為在70℃下避光反應10min。

優(yōu)選的，所述前體dgl-nota-ac的制備方法包括以下步驟：(1)將dglg3溶于dmso中，攪拌混勻至完全溶解；(2)將nota-nhs溶于dmso中，攪拌混勻至完全溶解；(3)將步驟(1)中溶解好的dglg3與步驟(2)中溶解好的nota-nhs進行混合，室溫下避光反應；(4)然后向步驟(3)所得混合溶液中加入過量的三乙胺，室溫下避光攪拌，然后加入過量的醋酸酐，在相同反應條件下繼續(xù)反應，反應結束即得前體dgl-nota-ac。

優(yōu)選的，所述前體dgl-nota-ac的制備方法還包括步驟(5)反應結束后在0.5mol/l、ph＝4.0的醋酸鈉緩沖液中透析步驟(4)所得的前體，即可得到較純的前體dgl-nota-ac。

另一方面，本發(fā)明公開一種化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac作為正電子標記納米探針在基因治療、藥物遞釋和生物成像中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述化合物⁶⁸ga-nota-dgl-ac具有很高的放化純度、良好的體外穩(wěn)定性和水溶性，有利于⁶⁸ga-nota-dgl-ac在小鼠活體中的血液循環(huán)。本發(fā)明所述⁶⁸ga-nota-dgl-ac的制備方法，通過合成樹狀大分子多聚賴氨酸衍生物dgl-nota-ac，并用正電子核素⁶⁸ga進行標記，探索了一條簡單、快速、放化產(chǎn)率高的正電子標記納米分子探針途徑，為基因治療、藥物遞釋和生物成像提供了新的研究方向。

附圖說明

圖1為dgl-nota-ac合成示意圖；

圖2為dgl-nota-ac的紫外吸光度測定結果，黑色箭頭所指為320nm處；

圖3為dgl-nota-ac的馬爾文納米粒度電位儀檢測結果；

圖4為⁶⁸ga-nota-dgl-ac的紙層析法檢測結果，其中rf(⁶⁸ga-nota-dgl-ac)＝38/200＝0.19，rf(⁶⁸ga離子)＝101/200＝0.505；

圖5為⁶⁸ga-nota-dgl-ac體外穩(wěn)定性實驗結果；

圖6為⁶⁸ga-nota-dgl-ac在a459細胞及u87mg細胞內(nèi)攝取及洗脫實驗結果；

圖7為⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常小鼠的體內(nèi)生物學分布結果；

圖8為正常km小鼠經(jīng)尾靜脈注射⁶⁸ga-nota-dgl-ac后120minmicro-pet顯像；

圖9為⁶⁸ga-nota-dgl-ac在荷u87mg腫瘤鼠的體內(nèi)生物學分布結果；

圖10為⁶⁸ga-nota-dgl-ac荷瘤裸鼠micro-pet/ct顯像結果，a為經(jīng)尾靜脈注射⁶⁸ga-nota-dgl-ac后120min成像，b為瘤內(nèi)注射⁶⁸ga-nota-dgl-ac后120min成像，箭頭所指為腫瘤。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結合具體實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。

1.材料與方法

1.1前體dgl-nota-ac的合成

取10mgdglg3溶于6ml的無水dmso中，取8.6mg的nota-nhs溶于20ml的無水dmso中，將兩者混合，在室溫下避光攪拌24h。反應結束后加入過量的三乙胺室溫下避光攪拌0.5h，然后加入過量的醋酸酐，在相同反應條件下繼續(xù)反應24h。反應結束后在0.5mol/lph＝4.0的醋酸鈉緩沖液中透析(3天,共換液5次)，得到的濃度為1mg/ml，其中dgl-nota-ac合成示意圖如圖1所示。

1.2⁶⁸ga-nota-dgl-ac的制備

取0.05mol/lhcl2.5ml對鍺-鎵發(fā)生器進行淋洗，流率1ml/min，收集洗脫液，每支0.5ml共5支。分別進行活度檢測，選取活度最大的1支洗脫液，加入32.5μl1.0mol/l醋酸鈉溶液，將ph調整到4.0-4.2，然后加入200μldgl-nota-ac醋酸鈉緩沖液中70℃下避光反應10min，即得⁶⁸ga-nota-dgl-ac。

1.3⁶⁸ga-nota-dgl-ac的鑒定和純化

采用薄層紙層析法(thinlayerchromatography,tlc)對標記物進行鑒定,分離純化采用pd10純化柱。取1μl標記物點樣，展開劑為0.9％的生理鹽水。用0.01mol/l的pbs溶液25ml平衡pd10柱，加入500μl反應混合物，然后用2ml的0.9％生理鹽水進行淋洗。取5個ep管，分別編號為1-5，每個ep管接淋洗液0.5ml。淋洗完畢后，測量每個ep管放射性活度，取放射性活度最高的淋洗液進行radio-tlc測定放化純度，若放化純度＞99％，則進行體內(nèi)外生物學實驗。

1.4基本理化性質的測定

將制備的放射性納米分子探針溶于pbs緩沖液中，目測觀察其顏色、澄清度、透明度，取少量樣品用標準ph試紙分析其ph值。

1.5脂水分配系數(shù)測定

取分離純化后的⁶⁸ga-nota-dgl-ac10μl，分別加入三個ep管(含有0.5ml正辛醇及0.5ml0.01mol/l的pbs緩沖液)中，密封后在室溫下渦旋2min，3000r/min離心5分鐘。用加樣槍依次從3個ep管中取有機相及水相各10μl置于γ計數(shù)管中，進行γ計數(shù)，重復三次。用公式logp＝log(γ計數(shù)正辛醇/γ計數(shù)pbs)計算平均logp值。

1.6⁶⁸ga-nota-dgl-ac的體外穩(wěn)定性評價

取20μl(約2.03mbq)的⁶⁸ga-nota-dgl-ac溶液，置于0.5ml的pbs緩沖液(ph＝7.4,0.01mol/l)，在37℃下孵育30min、60min、90min及120min后取100μl測定其放射化學純度，以觀察其在pbs緩沖液中的穩(wěn)定性，重復三次。為測⁶⁸ga-nota-dgl-ac溶液在小牛血清中的穩(wěn)定性，亦在37℃下孵育30min、60min、90min及120min，之后用等體積的pbs稀釋胎牛血清，密封后在室溫下渦旋2min，1000r/min條件下離心5min，取上清液用radio-tlc進行分析。

1.7⁶⁸ga-nota-dgl-ac在a549和u87mg細胞中的攝取和洗脫實驗

(1)細胞攝取實驗：在24孔板中每孔加入5×10⁴個人肺腺癌細胞株a549或人腦膠質瘤細胞株u87mg，培養(yǎng)過夜后使細胞貼壁，隔天除去培養(yǎng)基，每孔加入5μl含185kbq⁶⁸ga-nota-dgl-ac的pbs溶液，空白對照組加入5μlpbs溶液(不含⁶⁸ga-nota-dgl)，分別在37℃下孵育20min、40min、80mim及120min后，每孔用0.5ml冰凍的pbs洗3次，然后用0.25％胰蛋白酶/0.02％edta消化細胞，收集細胞懸液后用γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)。細胞攝取數(shù)據(jù)全部經(jīng)過衰減校正后用細胞結合率即百分加入劑量表示，實驗設三個平行，重復3次。

(2)細胞洗脫實驗：在24孔板中每孔加入5×10⁴個a549或u87mg，在37℃下與185kbq/孔的⁶⁸ga-nota-dgl-ac共同孵育1h使其充分內(nèi)在化。然后去培養(yǎng)基，用冰凍的pbs沖洗3次，再加入無血清培養(yǎng)液在37℃下孵育0min、20min、40min、80mim及120min。之后每孔用0.5ml冰凍的pbs沖洗3次，最后用0.25％胰蛋白酶/0.02％edta消化細胞，收集細胞懸液后用γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)。細胞洗脫數(shù)據(jù)全部經(jīng)過衰減校正后用細胞滯留率即百分加入劑量表示，實驗設三個平行，重復3次。

1.8⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常小鼠的體內(nèi)生物學分布

昆明小鼠禁食禁水12小時，分別對正常小鼠進行標記、分組(共12只，分為4組，每組3只)，對計數(shù)管進行標號及稱重。注射器抽取100μl示蹤劑，測放射性活度，將每支注射器進行編號，且編號與小鼠編號相一致。用2％異氟烷將小鼠麻醉，然后用酒精擦拭小鼠尾部，經(jīng)尾靜脈注射示蹤劑。分別于注射示蹤劑5min、30min、60min及120min后進行眼球取血，之后行斷頸處死及主要器官(心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、胰、腦、肌肉、骨骼、皮毛)解剖，pbs緩沖液清洗干凈晾干后分別置于相應編號的空計數(shù)管內(nèi)。對所有裝有臟器組織的計數(shù)管進行稱重，臟器組織重量＝總重量-空計數(shù)管重量。用γ計數(shù)儀對裝有臟器組織的計數(shù)管進行γ計數(shù)，經(jīng)衰減校正后計算每克組織的放射性計數(shù)，用每克組織百分注射劑量(id％/g)表示。

1.9⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常小鼠的micro-pet顯像

micro-pet采集及圖像分析是用西門子inevon小動物pet/ct進行的。正常小鼠在水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下經(jīng)鼠尾靜脈注射250μl(12.7mbq)⁶⁸ga-nota-dgl-ac，實驗動物置于俯臥位進行固定，在注射顯像劑后120min采集靜態(tài)圖像，掃描完成后進行數(shù)據(jù)重建。

1.10⁶⁸ga-nota-dgl-ac在荷u87mg腫瘤鼠的micro-pet顯像

荷u87mg荷瘤鼠在2％異氟烷麻醉下分別經(jīng)尾靜脈及瘤內(nèi)注射約3.7mbq(100μci)及1.11mbq(30μci)的⁶⁸ga-nota-dgl-ac，分別于注射顯像劑15min、60min、120min后采集靜態(tài)圖像。在衰減校正后的全身冠狀位圖像上勾畫腫瘤及主要臟器的感興趣區(qū)，測量放射性攝取值，用％id/g表示，pet顯像結束后將動物行斷頸處死，遵循動物福利原則。

1.11⁶⁸ga-nota-dgl-ac在荷u87mg腫瘤鼠的體內(nèi)生物學分布

在2％異氟烷麻醉狀態(tài)下將每只荷u87mg腫瘤鼠通過尾靜脈注射約3.7mbq(100μci)的⁶⁸ga-nota-dgl-ac。在注射顯像劑1小時后經(jīng)斷頸處死荷u87mg腫瘤鼠，解剖并分離腫瘤和主要臟器，并將其放入空計數(shù)管后進行稱重(總重量)，然后用γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)，腫瘤和正常臟器的放射性攝取用id％/g表示，具體實驗步驟如1.8。

2.結論

2.1dgl-nota-ac的表征

dgl納米載體、nota-nhs及反應后的dgl-nota凍干產(chǎn)物各取1mg，分別溶于2ml的超純水中進行紫外吸光度檢測。結果表明，納米載體dgl在200-500nm波長處無紫外吸收，而nota-nhs在320nm波長處具有紫外吸收峰，合成的產(chǎn)物在相應的位置320nm左右出現(xiàn)紫外吸收峰(圖2)，說明dgl-nota-ac成功合成，將合成產(chǎn)物dgl-nota-ac進行通過馬爾文納米粒度電位儀檢測其在水中的粒徑大小，結果顯示dgl-nota-ac的粒徑大小為(35.02±1.53)nm(圖3)。

2.2⁶⁸ga-nota-dgl-ac的標記及質量控制

如圖4所示，⁶⁸ga-nota-dgl-ac的放化產(chǎn)率可達96％,經(jīng)pd10純化柱分離純化后放化純度大于98％，ph值介于4.0-4.2之間為無色、透明、澄清的溶液，無其他重金屬污染。將250μl的⁶⁸ga-nota-dgl-ac探針經(jīng)尾靜脈注射正常km小鼠體內(nèi)(n＝3)，觀察7天，均未出現(xiàn)km小鼠死亡的現(xiàn)象，說明此納米探針無明顯毒性。

2.3脂水分配系數(shù)測定

脂水分配系數(shù)實驗是為了測量其親脂程度，經(jīng)測定⁶⁸ga-nota-dgl-ac的logp＝log[(脂相γ計數(shù)-背景平均γ計數(shù))/(水相γ計數(shù)-背景平均γ計數(shù))]＝-1.62,說明此納米分子探針呈親水性。

2.4⁶⁸ga-nota-dgl-ac的radio-tlc分析及體外穩(wěn)定性實驗

radio-tlc分析結果顯示，gacl3的rf值為0.505，⁶⁸ga-nota-dgl-ac的rf值為0.19。體外穩(wěn)定性研究結果如圖5所示，其在0.01mol/lph值7.4pbs溶液及小牛血清中靜置2h，放化純均>95％。上述實驗表明，⁶⁸ga-nota-dgl-ac具有較好的體外穩(wěn)定性，該標記化合物的比活度為30gbq/μmol。

2.5細胞攝取及洗脫實驗

為測定⁶⁸ga-nota-dgl-ac的細胞結合及細胞滯留特性，分別用a549及u87mg進行細胞攝取及洗脫實驗。結果表明a549及u87mg細胞能快速、高效地結合⁶⁸ga-nota-dgl-ac，如圖6所示，且隨著孵育時間延長，顯像劑對兩種細胞結合力進一步增強，在孵育2h時達到高峰。在細胞洗脫實驗中，⁶⁸ga-nota-dgl-ac在兩種細胞中均表現(xiàn)為隨時間的延長緩慢下降，說明⁶⁸ga-nota-dgl-ac在細胞內(nèi)排泄緩慢，而在2h末仍有顯像劑滯留。

2.6⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常小鼠的體內(nèi)生物學分布

⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常昆明小鼠的體內(nèi)生物學分布結果如圖7所示，結果顯示：在注射顯像劑30min后血液的放射性明顯低于5min，各為(3.43±1.93)id％/g和(8.73±1.21)id％/g，說明⁶⁸ga-nota-dgl-ac在血液中清楚速度較快。在注射顯像劑5min、30min、60min及120min后，放射性攝取主要聚集在肝臟和脾臟，且放射性攝取在肝臟隨著時間的延長有所升高，而在脾臟隨著時間的延長有所下降。雙腎在各個時間點放射性攝取值均較低，而肝臟在各個時間點放射性攝取值均較高，說明⁶⁸ga-nota-dgl-ac是通過肝臟代謝，而非經(jīng)腎臟排泄。

2.7⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常小鼠的micro-pet顯像

⁶⁸ga-nota-dgl-ac在正常km小鼠經(jīng)尾靜脈注射120min后的micro-pet顯像結果(圖8)表明，探針⁶⁸ga-nota-dgl-ac主要分布在肝臟，其次為脾臟，膀胱少量攝取，雙腎及其他臟器未見明顯攝取。

2.8⁶⁸ga-nota-dgl-ac在荷u87mg腫瘤鼠的體內(nèi)生物學分布

納米分子探針⁶⁸ga-nota-dgl-ac在u87mg腫瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射1小時后，其在腫瘤組織及主要臟器中的放射性攝取程度見圖9。結果表明：注射顯像劑1小時后，u87mg腫瘤組織攝取值為(0.19±0.02)id％/g，低于其他主要臟器組織。顯像劑在肝臟和脾臟放射性攝取較高，分別為(65.75±0.10)id％/g及(9.79±0.58)id％/g。

2.9⁶⁸ga-nota-dgl-ac在u87mg荷瘤鼠的micro-pet顯像

通過micropet/ct顯像可觀察⁶⁸ga-nota-dgl-ac在u87mg荷瘤鼠中的體內(nèi)藥代動力學特性，從圖10中可見，經(jīng)尾靜脈注射⁶⁸ga-nota-dgl-ac后，顯像劑主要分布在肝臟，其次是心臟，瘤結節(jié)未見明顯攝取。在注射顯像劑15min、60min及120min后瘤組織的攝取值分別為(6.18±1.44)、(7.58±1.88)和(5.93±0.48)。而瘤內(nèi)注射結果顯示，顯像劑⁶⁸ga-nota-dgl-ac主要分布在瘤結節(jié)內(nèi)，全身其他組織及臟器均未見明顯攝取。在瘤內(nèi)注射顯像劑15min、60min及120min后，瘤組織的攝取值分別是(29.82±1.88)、(27.68±3.78)及(27.28±2.65)。

3.結論分析

本發(fā)明通過合成了樹狀大分子多聚賴氨酸衍生物dgl-nota-ac，并用正電子核素⁶⁸ga進行了成功標記，該方法探索了一條簡單、快速、放化產(chǎn)率高的正電子標記納米分子探針途徑。在正常小鼠的體內(nèi)生物學分布及正常小鼠的micro-pet顯像中均表明，⁶⁸ga-nota-dgl-ac納米分子探針在正常鼠體內(nèi)主要分布于肝臟和脾臟，其他臟器未見明顯代謝。而在u87mg荷瘤鼠活體成像及體內(nèi)生物學分布中也顯示出納米探針主要集聚于肝臟及脾臟，腫瘤內(nèi)未見明顯攝取。主要原因可能在于：1.⁶⁸ga-nota-dgl-ac作為納米探針，由于水動力學檢測出納米粒徑為(35.02±1.53)nm，因此該探針易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，造成肝臟內(nèi)的大量攝取。2.⁶⁸ga-nota-dgl-ac納米探針具有腫瘤被動靶向性，造成腫瘤攝取及成像效果不理想。

后期研究我們將從以下兩方面進行改進：1.選取納米尺寸較小的納米分子作為載體，如dgl-g2等，使得修飾后的納米尺寸適合在腫瘤部位積聚，最大可能減少肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取。2.增加納米探針的腫瘤主動靶向性，可在納米表面修飾rgd等靶向膠質瘤的靶向肽，增加其腫瘤靶向性。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質。