專利名稱：堿性磷酸酶標記抗體的方法
堿性磷酸酶標記抗體的方法本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，特別涉及ー種堿性磷酸酶標記抗體的方法。隨著酶聯(lián)免疫檢測技術的發(fā)展，尋求ー種簡捷高效的酶標記抗體技術越來越重要。堿性磷酸酶(簡稱AP)作為ー 種免疫診斷試劑應用廣泛的酶，將其偶聯(lián)至抗體上，是診斷試劑開發(fā)中至關重要的一歩。將標記抗體的方法基本上分為兩類。一類用雙功能基團的化合物使酶與抗體隨機偶聯(lián)，如戊ニ醛ー步法。由于酶分子上游離氨基極少，而抗體分子上氨基則相對較多，為了彌補這ー缺陷，往往采用8-12個酶分子與I個抗體分子的比值進行調(diào)整。戊ニ醛ニ步法的原理，主要是AP的氨基極少，而加入的戊ニ醛分子數(shù)相對較多，當戊ニ醛中的ー個醛基與酶分子上的ー個氨基結合后，則余下的一個醛基再與另ー酶分子上的氨基作用的可能性極少，故很少產(chǎn)生酶與酶間的偶聯(lián)。當除去未作用的戊ニ醛后，己醛化的酶與抗體作用而成為結合物，但這一方法標記效果也并不理想。另ー類用過碘酸鈉氧化酶分子中的含糖部分使酶本身產(chǎn)生多個醛基，酶的活性中心未受影響或影響不大，而醛化了的酶再與待標記的抗體作用即可獲得結合物。這ー方法由Nakane等首創(chuàng)，其特點是標記效果高而所得的結合物分子量較大。上述方法除標記效果較差的戊ニ醛ー步法外，操作均較為復雜。本發(fā)明結合以上標記方法，對酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時間進行了優(yōu)化，對操作過程中涉及到的透析繁瑣操作進行了方法改進，簡化了操作，縮短了時間。在此基礎上實現(xiàn)了進一歩提高標記效果，操作簡便，穩(wěn)定的堿性磷酸酶標記抗體的方法。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，提供了ー種標記效果好、操作簡單的堿性磷酸酶標記抗體的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設計了ー種堿性磷酸酶標記抗體的方法，采用如下步驟A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6-6. 6的NaAc溶液中，使堿性磷酸酶的濃度為3-10mg/ml ；B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入等體積的過碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min ；C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入與步驟A所得溶液等體積的こニ醇-NaCl溶液；D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無水こ醇，混勻，并在室溫為_20°C的條件下靜置I小時，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶；E)用含量為0. 5ml濃度為0. 05M，pH值為8_10的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻；F)按質(zhì)量比，酶抗體的比例范圍為I : I至I : 4的比例,加入待標記的抗體溶液進行反應，反應時間為1-3小時；G)按質(zhì)量比，NaBH4 :酶的比例范圍為0.1 I至0. 2 I的比例，加入NaBH4溶液，室溫放置1-3小時；H)加入0. 6ml的冰冷無水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時，4000g離心10分鐘；I)按所需酶標抗體濃度用PBS溶解或凍干保存。所述こニ醇-NaCl溶液的配方為NaCl，こニ醇和水。所述的NaCl的含量為22g，こニ醇的含量為2. 3ml，水的含量100ml。所述待標記的抗體溶液為HbcAb的PBS溶液。本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比，對酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時間進行了優(yōu)化，對操作過程中涉及到的透析繁瑣操作進行了方法改進，簡化了操作，縮短了時間。從而進一步提高了標記效果。圖I為本發(fā)明實施例一中表I的線形圖。圖2為本發(fā)明實施例ニ中表2的線形圖。圖3為本發(fā)明實施例三中表3的線形圖。圖4為本發(fā)明實施例四中表4的線形圖。下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步描述。實施例一A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M，PH值為5. 6的NaAc溶液中。B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入0. 5ml濃度為0. 06M過碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min。C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入0. 5mlこニ醇-NaCl溶液。こニ醇-NaCl溶液的配方為，稱取22g NaCl，加2. 3mlこニ醇，再加水至IOOml制得該溶液，室溫可長期保存。D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無水こ醇，混勻，并在室溫為_20°C的條件下靜置I小時，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶。E)用含量為0. 5ml濃度為0. 5M，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中、得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻。F)加待標記的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0. 05ml，反應2小時。 G)加4mg/ml的NaBH4溶液0. 25ml，室溫放置2小時。H)加入0. 6ml的冰冷無水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時，4000g離心10分鐘。I)加 0. 5mlPBS 溶解。在ELISA板上包被HbcAg抗原，進行直接法ELISA進行酶標記效率的檢查，結果如下表和圖I所示。
_標執(zhí)體酶標抗體 |~ 酶標執(zhí)體 I酶標沉體 [f
不加酶標抗體
(1:1000 稀釋)(1:2000 稀釋)(1:4000 稀釋)(1:8000 稀釋)
1.8450.912 0.4950.1580.009AG (1:1)
1.8860.895 0.5010.2130.002AG (1:1)重復
0.8960.467 0.2580. 1330.005" AG (1:2)
0.8750.463 0.2740.1860.003AG (1:2)重復
0.5030.325 0.1850.0900.003AG (1:4)
0.4990.345 0.2060.1030.003AG (1:4)重復
0.3650.162 0.0750.0400.006AG (1:8)
0. 3450. 174 0.0980.0490.004Aft (1:8)重復實施例ニ A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6的NaAc溶液中。B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入0. 5ml濃度為0. 06M過碘酸鈉溶液，并在室溫為4
攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min。C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入0. 5mlこニ醇-NaCl溶液。こニ醇-NaCl溶液的配
方為，稱取22g NaCl，加2. 3mlこニ醇，再加水至IOOml制得該溶液，室溫可長期保存。D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無水こ醇，混勻，并在室溫
為_20°C的條件下靜置I小時，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶。E)用含量為0. 5ml濃度為0. 5M，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中
得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻。F)加待標記的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0. 05ml，反應2小時。G)加4mg/ml的NaBH4溶液0. 25ml，室溫放置2小時。H)加入0. 6ml的冰冷無水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時，4000g離心10分鐘。I)加 0. 5mlPBS 溶解。在ELISA板上包被HbcAg抗原，進行直接法ELISA進行酶標記效率的檢查，結果下
表和圖2所示。
權利要求
1.ー種堿性磷酸酶標記抗體的方法，采用如下步驟 A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0.5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6-6. 6的NaAc溶液中，使堿性磷酸酶的濃度為3-10mg/ml ； B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入等體積的過碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min; C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入與步驟A所得溶液等體積的こニ醇-NaCl溶液； D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為I.5ml的冰冷無水こ醇，混勻，并在室溫為_20°C的條件下靜置I小時，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶； E)用含量為0.5ml濃度為0. 5M，pH值為8_10的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻； F)按質(zhì)量比，酶抗體的比例范圍為I: I至I : 4的比例，加入待標記的抗體溶液進行反應，反應時間為1-3小時； G)按質(zhì)量比，NaBH4:酶的比例范圍為0. I I至0. 2 I的比例，加入NaBH4溶液，室溫放置1-3小時；H)加入0.6ml的冰冷無水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時，4000g離心10分鐘； I)按所需酶標抗體濃度用PBS溶解或凍干保存。
2.根據(jù)權利要求I所述的堿性磷酸酶標記抗體的方法，其特征在于所述こニ醇-NaCl溶液的配方為NaCl，こニ醇和水。
3.根據(jù)權利要求2所述的堿性磷酸酶標記抗體的方法，其特征在于所述的NaCl的含量為22g，こニ醇的含量為2. 3ml，水的含量100ml。
4.根據(jù)權利要求I所述的堿性磷酸酶標記抗體的方法，其特征在于所述待標記的抗體溶液為fficAb的PBS溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，特別涉及一種堿性磷酸酶標記抗體的方法，采用如下步驟包括堿性磷酸酶的溶解過程，堿性磷酸酶的氧化過程以及堿性磷酸酶與待標記的抗體溶液的反應過程，本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比對酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時間進行了優(yōu)化，對操作過程中涉及到的透析繁瑣操作進行了方法改進，簡化了操作，縮短了時間。從而進一步提高了標記效果。
文檔編號G01N33/535GK102645531SQ20121009961
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權日2012年4月6日
發(fā)明者李子樵, 王志文 申請人:上海藍怡科技有限公司