本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒及其rt-pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

血漿中游離病毒顆粒的濃度(血漿病毒載量)，由每毫升血漿的病毒rna的拷貝數(shù)表示，其可以通過pcr方法可靠地定量，并一直作為hiv-1病毒復(fù)制的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療的主要目標(biāo)是為了減少血漿病毒載量，通過抑制病毒復(fù)制降低血漿中的病毒量，并使其低于臨床上大多數(shù)敏感的檢測方法可以檢出的標(biāo)準(zhǔn)，并使治療保持這種標(biāo)準(zhǔn)。在大多數(shù)接受并堅(jiān)持抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv-1感染者中，這個目標(biāo)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了，因此血漿中的病毒載量比較低，甚至低于于可檢測到的限度。就算經(jīng)過了最好的治療，大部分患者體內(nèi)仍殘留低水平的病毒拷貝。由于低水平的血漿病毒檢測具有挑戰(zhàn)性，因此并不清楚低水平的病毒血癥是否能夠?qū)﹂L期治療產(chǎn)生反應(yīng)，新的診斷標(biāo)志物的出現(xiàn)也就十分必要。而細(xì)胞相關(guān)的hiv-1rna在感染hiv進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄治療的病人中被認(rèn)為是具有潛力的診斷標(biāo)志物。

多于40種不同的病毒rna由整合于被感染細(xì)胞中的前病毒轉(zhuǎn)錄，并通過對最初轉(zhuǎn)錄本的可變剪接，在hiv病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生。在感染的進(jìn)程中，有約9kb的非剪接轉(zhuǎn)錄本(unsplicedrna)和大于4kb的不完全剪接轉(zhuǎn)錄本生成，進(jìn)而編碼翻譯病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白gag，pol，env，vif，vpr和vpu。除了被用作翻譯gag蛋白和gag-pol多蛋白的模板外，usrna還被包裝進(jìn)子代病毒中作為遺傳物質(zhì)基因組rna。雖然有時病毒rna在血漿中含量水平比較穩(wěn)定，但與細(xì)胞密切相關(guān)的usrna含量水平卻在一直顯著地增加。現(xiàn)在有文獻(xiàn)證明，外周血淋巴細(xì)胞(pbmc)中hiv-1usrna的水平，可以代替血漿的病毒水平檢測，成為一個強(qiáng)有力的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療診斷標(biāo)記。費(fèi)歇爾等證明在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療者中，90％以上pbmc相關(guān)的hivrna是來源于新感染的細(xì)胞。更有文章表明，細(xì)胞相關(guān)的hivrna可以作為活性病毒儲存庫的鑒定標(biāo)記，作為病毒復(fù)制能力的監(jiān)控指標(biāo)，并可以為輔助推進(jìn)hiv的根治提供潛在的策略。

大部分抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者細(xì)胞相關(guān)的rna和dna的檢測手段是實(shí)時pcr。在近些年，pcr(rt-qpcr)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞相關(guān)hiv-1rna的定量。這種方法具有很高的特異性，但是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后，為了能夠檢測到微量的核酸病毒，檢測手段的敏感性還需要加強(qiáng)。在這里我們通過設(shè)計(jì)特異的引物探針，提供了一種可以精準(zhǔn)檢測到微量病毒拷貝的方法。

對pcr而言，提供一個穩(wěn)定的緩沖體系對反應(yīng)過程至關(guān)重要。tris-hcl緩沖體系是最經(jīng)典的pcr工作反應(yīng)體系，保障pcr工作中ph的穩(wěn)定性等功能。但tris-hcl緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pka為8.3(20℃)，△pka為0.021/℃，相對溫度較敏感，隨著溫度的升高ph降低。在典型的熱循環(huán)條件下，當(dāng)延伸溫度在72℃時，真正的ph值在6.8-7.8之間，在ph小于7.5以下，緩沖能力極差。對許多熱啟動酶而言，ph變化導(dǎo)致酶活性下降甚至失活，影響pcr或rt-pcr的檢測靈敏度及精密度。

目前，缺乏一種快速檢測的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒及其rt-pcr檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種快速檢測的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒及其rt-pcr檢測方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：本發(fā)明的一種外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒，包括rt-pcrmix、酶混合液、引物組、探針和質(zhì)控品，所述引物組由核苷酸序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4組成，

所述hivusrna-f1上游引物具有seqidno.1的核苷酸序列；

所述hivusrna-f2上游引物具有seqidno.3的核苷酸序列；

所述hivusrna-r1下游引物具有seqidno.2的核苷酸序列；

所述hivusrna-r2下游引物具有seqidno.4的核苷酸序列；

所述探針具有seqidno.5的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，所述質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，所述陽性質(zhì)控品為假病毒，所述陰性質(zhì)控品為生理鹽水。

進(jìn)一步地，所述的rt-pcrmix包含tris-mops-檸檬酸鈉緩沖體系、硫酸銨和氯化鉀。

更進(jìn)一步地，所述tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為20-100：10-50：1-5。

本發(fā)明所述的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒的pcr擴(kuò)增體系，所述實(shí)時熒光定量pcr擴(kuò)增檢測體系包括50μl的擴(kuò)增體系：50μl體系，包含pcrmix27.5μl、酶混合液2.5μl，瞬時離心，然后加入待檢測的rna20μl；同樣按照上述體系設(shè)置陽性對照和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品20μl進(jìn)行擴(kuò)增。

本發(fā)明的一種外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒的檢測方法，所述pcr擴(kuò)增設(shè)置反應(yīng)條件包括：包括逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性、6～9個循環(huán)的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)、8個溫度降低的低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)、40個溫度進(jìn)一步降低的低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)。

進(jìn)一步地，熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃20～45分鐘，94～96℃2分鐘；94～95℃15～30秒，65～69℃30～75秒，68～72℃30～40秒，6～9個循環(huán)；93～95℃15～20秒，60℃30秒，68～72℃30秒，8個循環(huán)；93～95℃15秒，52～55℃30～60秒，40個循環(huán)。

進(jìn)一步地，熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃40分鐘，94℃2分鐘；94℃15秒，65℃30秒，72℃30秒，8個循環(huán)；94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，8個循環(huán)；94℃15秒，53℃50秒，40個循環(huán)；55℃時收集熒光。

本發(fā)明所述的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒及其檢測方法在檢測外周血淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對外周血淋巴細(xì)胞中的hivusrna進(jìn)行快速檢測，檢測靈敏度好，應(yīng)用極為方便。由于引入了更適合rna擴(kuò)增的tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了普通rt-pcr方法特異性不高，以及無法對低濃度模版進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)hivusrna被認(rèn)為是有價值的生物標(biāo)志物。目前關(guān)于hivusrna的研究很多，但在臨床應(yīng)用上并未有見到商業(yè)化的usrna檢測試劑及方法。

(2)mops是一種常用于制備中性緩沖體系的化學(xué)物質(zhì)，中文名又稱3-(n-嗎啉)丙磺酸，溶液狀態(tài)成酸性，pka72(25℃)緩沖范圍6.5-7.9之間，廣泛用于二維凝膠電泳中等電聚焦電泳的電解質(zhì)系統(tǒng)成分，還可用于northern雜交，作為rna的分離及轉(zhuǎn)膜時的緩沖液。

附圖說明

圖1為本發(fā)明從左到右依次為2.5×10⁵、2.5×10⁴、2.5×10³、2.5×10²、2.5×10¹拷貝/ml的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果的圖譜；

圖2為本發(fā)明進(jìn)行數(shù)據(jù)經(jīng)可用性檢查和多項(xiàng)回歸分析，并經(jīng)精密度檢驗(yàn)后，確定在檢測范圍內(nèi)的線性圖譜；

圖3為本發(fā)明hivusrna實(shí)時熒光定量pcr檢測方法對hivusrna檢測的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖譜；

如圖4為本發(fā)明的對hiv-1陰性標(biāo)本或健康人群標(biāo)本進(jìn)行檢測的特異性實(shí)驗(yàn)的圖譜。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅處于說明性目的，而不是想要限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

本發(fā)明的一種外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒，包括rt-pcrmix、酶混合液、引物組、探針和質(zhì)控品，所述引物組由核苷酸序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4組成，

所述hivusrna-f1上游引物具有seqidno.1的核苷酸序列；

所述hivusrna-f2上游引物具有seqidno.3的核苷酸序列；

所述hivusrna-r1下游引物具有seqidno.2的核苷酸序列；

所述hivusrna-r2下游引物具有seqidno.4的核苷酸序列；

所述探針具有seqidno.5的核苷酸序列。

所述質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，所述陽性質(zhì)控品為假病毒，所述陰性質(zhì)控品為生理鹽水。

所述的rt-pcrmix包含tris-mops-檸檬酸鈉緩沖體系、硫酸銨和氯化鉀。

所述tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為20：40：1。

本發(fā)明所述的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒的pcr擴(kuò)增體系，所述實(shí)時熒光定量pcr擴(kuò)增檢測體系包括50μl的擴(kuò)增體系：50μl體系，包含pcrmix27.5μl、酶混合液2.5μl，瞬時離心，然后加入待檢測的rna20μl；同樣按照上述體系設(shè)置陽性對照和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品20μl進(jìn)行擴(kuò)增。

本發(fā)明的一種外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒的檢測方法，所述pcr擴(kuò)增設(shè)置反應(yīng)條件包括：包括逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性、6～9個循環(huán)的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)、8個溫度降低的低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)、40個溫度進(jìn)一步降低的低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(非降落pcr)。

熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃20分鐘，94～96℃2分鐘；94～95℃15秒，65～69℃75秒，68～72℃30秒，6～9個循環(huán)；93～95℃20秒，60℃30秒，68～72℃30秒，8個循環(huán)；93～95℃15秒，52～55℃30秒，40個循環(huán)。

本發(fā)明所述的外周血淋巴細(xì)胞中hivusrna實(shí)時熒光定量的試劑盒及其檢測方法在檢測外周血淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。

應(yīng)用本發(fā)明以假病毒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品hivusrna實(shí)時熒光定量pcr檢測方法的實(shí)驗(yàn)，圖1為本發(fā)明從左到右依次為2.5×10⁵、2.5×10⁴、2.5×10³、2.5×10²、2.5×10¹拷貝/ml的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果的圖譜；機(jī)型：abi7500。

如圖2所示，圖2為本發(fā)明進(jìn)行數(shù)據(jù)經(jīng)可用性檢查和多項(xiàng)回歸分析，并經(jīng)精密度檢驗(yàn)后，確定在檢測范圍內(nèi)的線性圖譜；本試劑結(jié)果為線性；最終結(jié)果顯示線性覆蓋范圍為25～2.5×10⁵copies/ml；機(jī)型：abi7500。

圖3為最低檢出限實(shí)驗(yàn)，將假病毒稀釋到25copies/ml，總體積為200ul進(jìn)行提取(相當(dāng)于每個pcr反應(yīng)中檢測2個拷貝hiv-1usrna)，采用以上檢測方法對hiv-1usrna進(jìn)行檢測；檢測結(jié)果如圖3所示，通過多次重復(fù)檢測，本發(fā)明的最低檢出限(每個pcr反應(yīng)中檢測2個拷貝)檢出率可達(dá)96％。機(jī)型：abi7500。

如圖4所示，為本發(fā)明的特異性實(shí)驗(yàn)，對hiv-1陰性標(biāo)本或健康人群標(biāo)本進(jìn)行檢測，陰性標(biāo)本包括為hbv、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、eb病毒、細(xì)胞巨化病毒、6型單純皰疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病病毒、人類t細(xì)胞白血病病毒1型和2型、柯薩奇病毒b3以及大腸桿菌提取的核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示為陰性(100％)。以上結(jié)果證明本發(fā)明方法具有很好的特異性。機(jī)型：伯樂cfx96。

實(shí)施例2

實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于：

所述tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為100：10：4。

熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃35分鐘，94～96℃2分鐘；94～95℃30秒，65～69℃30秒，68～72℃40秒，6～9個循環(huán)；93～95℃15秒，60℃30秒，68～72℃30秒，8個循環(huán)；93～95℃15秒，52～55℃60秒，40個循環(huán)。

實(shí)施例3

實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于：

所述tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為80：50：5。

熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃45分鐘，94～96℃2分鐘；94～95℃20秒，65～69℃65秒，68～72℃35秒，6～9個循環(huán)；93～95℃18秒，60℃30秒，68～72℃30秒，8個循環(huán)；93～95℃15秒，52～55℃50秒，40個循環(huán)。

試驗(yàn)1

特異性引物及探針的設(shè)計(jì)：

根據(jù)從genbank上檢索到的hiv基因組核酸序列，選擇ltr區(qū)域，設(shè)計(jì)用于檢測hivusrna的引物組和探針，其序列如下：

引物組：

hivusrna-f1：5’-tacacaccagggccagggat-3’(seqidno.1)

hivusrna-r1：5’-acagggtgtaacaagctggtgt-3’(seqidno.2)

hivusrna-f2：5’-acctttggatggtgctacaa-3’(seqidno.3)

hivusrna-r2：5’-tgttctctcctttgttggct-3’(seqidno.4)

熒光探針：

hivusrna–p：5’-fam-

accagttgagccagagaagt-3’bhq1(seqidno.5)，

擴(kuò)增片段長度為76bp；

標(biāo)本采集和預(yù)處理：

本方法及試劑盒適用標(biāo)本類型：新鮮的外周血淋巴細(xì)胞樣品。

無菌條件下用淋巴細(xì)胞分離液采集外周血淋巴細(xì)胞，直接檢測，或液氮保存待檢。

rna的提?。?/p>

(1)離心樣本細(xì)胞，用pbs進(jìn)行洗滌；

(2)使用qiagen的細(xì)胞rna提取試劑盒(離心柱型)，按照說

明書方法進(jìn)行rna的提取。并進(jìn)行膜上dna的消化；

熒光定量pcr擴(kuò)增：

每個測試反應(yīng)體系配制如下，50μl體系，包含pcrmix(設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組)27.5μl、瞬時離心，然后加入待檢測的rna20μl；同樣按照上述體系設(shè)置陽性和陰性對照。

所述的rt-pcrmix包含tris-mops-檸檬酸鈉緩沖體系、硫酸銨和氯化鉀。所述tris-mops-檸檬酸鈉緩沖液為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為20-100：10-50：1-5。

所述pcrmix(實(shí)驗(yàn)組)為表1所示，

表1

將各反應(yīng)管放入定量pcr儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類(設(shè)置hivusrna的報(bào)告基團(tuán)為fam，淬滅基團(tuán)選擇none)，設(shè)定循環(huán)條件：

熒光pcr儀循環(huán)條件為45℃40分鐘，94℃2分鐘；94℃15秒，65℃30秒，72℃30秒，8個循環(huán)；94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，8個循環(huán)；94℃15秒，53℃50秒，40個循環(huán)；55℃時收集熒光。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。