本發(fā)明屬于熒光定量pcr領(lǐng)域，具體涉及一種檢測乙型肝炎病毒耐藥多基因突變試劑盒。

背景技術(shù)：

who數(shù)據(jù)顯示，病毒性肝炎一直位列全球排名前七的死亡原因，每年多達145萬人因此喪生。全球乙肝病毒慢性感染者高達近2.4億人，我國是乙型肝炎病毒（hbv）高度易感人群，約有1.2億hbsag攜帶者，該病毒嚴重地危害著我國人民健康。2015年全國法定報告?zhèn)魅静“l(fā)病死亡統(tǒng)計表顯示，乙型肝炎的發(fā)病數(shù)達934215例，死亡數(shù)達352人，均占病毒性肝炎首位。

長期服用核苷（酸）類藥物易產(chǎn)生耐藥，主要核苷（酸）類藥物的服用時間及其耐藥發(fā)生率見表1。在用藥過程中，患者體內(nèi)hbvdna及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt）逐漸下降，繼而達到一個平穩(wěn)期，患者病情減輕。此時，hbv很難被完全清除，而是處于一個低復(fù)制非活動時期。隨著用藥時間的延長，對藥物敏感的野生株數(shù)量下降，具有耐藥突變的變異株因?qū)λ幬锊幻舾?，而得以不斷?fù)制、增加，從而導(dǎo)致hbvdna及alt重新上升，使得肝炎復(fù)發(fā)。

現(xiàn)階段，臨床上檢測乙肝耐藥基因突變主要采取測序法和基因芯片法進行檢測。測序法僅能測出突變比例≥20%的樣本，且整個檢測周期需要7天，操作復(fù)雜不適合臨床推廣；基因芯片法靈敏度僅能達到10⁴copies/ml，且操作過程容易造成交叉污染導(dǎo)致假陽性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測乙型肝炎病毒耐藥多基因突變試劑盒，主要采取多重實時熒光pcr法對乙肝耐藥基因突變進行檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明在一個試劑盒內(nèi)包含乙型肝炎病毒p區(qū)的11種耐藥基因突變檢測（rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250），通過8個反應(yīng)緩沖液進行擴增，每個反應(yīng)緩沖液包含兩個或者三個熒光通道，通過耐藥基因擴增ct值與外控ct值之間的差異（δct值）來判斷是否發(fā)生耐藥突變。

所述試劑盒包括如下：

反應(yīng)液1#包含rt80特異性引物及探針、rt180特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液2#包含rt169特異性引物及探針、rt204特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液3#包含rt181特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液4#包含rt194特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液5#包含rt202特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液6#包含rt184特異性引物及探針、rt250特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液7#包含rt173特異性引物及探針、rt236特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

反應(yīng)液8#包含外控特異性引物及探針、內(nèi)控特異性引物及探針；

酶混合液包含熱啟動taq酶及ung酶；

陽性對照包含特異性質(zhì)粒及te水；

陰性對照包含te水。

引物探針序列：

試劑組分配方：

反應(yīng)液1#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt80上游引物417nmol/l，rt80下游引物417nmol/l，rt80探針62.5nmol/l，rt180上游引物417nmol/l，rt180下游引物417nmol/l，rt180探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液2#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt169上游引物417nmol/l，rt169下游引物417nmol/l，rt169探針62.5nmol/l，rt204上游引物417nmol/l，rt204下游引物417nmol/l，rt204探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液3#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt181上游引物417nmol/l，rt181下游引物417nmol/l，rt181探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液4#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt194上游引物417nmol/l，rt194下游引物417nmol/l，rt194探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液5#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt202上游引物417nmol/l，rt202下游引物417nmol/l，rt202探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液6#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt184上游引物417nmol/l，rt184下游引物417nmol/l，rt184探針62.5nmol/l，rt250上游引物417nmol/l，rt250下游引物417nmol/l，rt250探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液7#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，rt173上游引物417nmol/l，rt173下游引物417nmol/l，rt173探針62.5nmol/l，rt236上游引物417nmol/l，rt236下游引物417nmol/l，rt236探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

反應(yīng)液8#配方：tris（ph8.8）20mmol/l，kcl60mmol/l，mgcl22.0mmol/l，edta·2na0.5mmol/l，2%dmso，datp200μmol/l，dgtp200μmol/l，dctp200μmol/l，dttp200μmol/l，外控上游引物417nmol/l，外控下游引物417nmol/l，外控探針62.5nmol/l，內(nèi)控上游引物417nmol/l，內(nèi)控下游引物417nmol/l，內(nèi)控探針62.5nmol/l。

酶混合液配方：taq酶4u/μl，ung酶0.04u/μl。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明的優(yōu)勢為1、靈敏度達到500copies/ml；2、擴增完后直接得到結(jié)果，無需后續(xù)操作，獲得樣本后2.5小時就能得到結(jié)果；3、能夠檢測出1%的突變比例。

發(fā)明的有益效果：1、為臨床治療提供準確的參考，提高治療有效率，減少藥物副作用；2、一次檢測覆蓋臨床常用藥物，降低檢測成本；3、降低患者經(jīng)濟負擔(dān)。

附圖說明

圖11#樣本結(jié)果圖。

圖22#樣本結(jié)果圖。

圖33#樣本結(jié)果圖。

圖44#樣本結(jié)果圖。

圖55#樣本結(jié)果圖。

圖66#樣本結(jié)果圖。

圖77#樣本結(jié)果圖。

圖88#樣本結(jié)果圖。

圖99#樣本結(jié)果圖。

圖1010#樣本結(jié)果圖。

圖1111#樣本結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1

1、反應(yīng)液的配制

（1）反應(yīng)液1#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt80上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt80探針12.5μl，50μmol/l的rt180上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt180探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）反應(yīng)液2#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt169上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt169探針12.5μl，50μmol/l的rt204上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt204探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）反應(yīng)液3#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt181上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt181探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）反應(yīng)液4#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt194上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt194探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）反應(yīng)液5#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt202上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt202探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）反應(yīng)液6#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt184上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt184探針12.5μl，50μmol/l的rt250上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt250探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（7）反應(yīng)液7#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的rt173上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt173探針12.5μl，50μmol/l的rt236上下游引物各83.4μl，50μmol/lrt236探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（8）反應(yīng)液8#的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/ltrizma^?hcl64μl，0.5mol/ltrizma^?base336μl，1mol/lmgcl220μl，1mol/lkcl600μl，0.5mol/ledta·2na10μl，dmso200μl，dntps90μl，50μmol/l的外控上下游引物各83.4μl，50μmol/l外控探針12.5μl，50μmol/l的內(nèi)控上下游引物各83.4μl，50μmol/l內(nèi)控探針12.5μl。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按1ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（9）酶混合液的配制取10ml容量瓶，分別加入10000u/ml的taq酶4ml，1000u/ml的ung酶0.4ml。用雙重蒸餾水補足體積到10ml，翻轉(zhuǎn)使之充分混勻，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按100μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（10）陰性對照的配制取100ml容量瓶，加入生理鹽水定容至100ml，將液體轉(zhuǎn)移到10ml燒杯中，按500μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（11）陽性對照的配制（濃度為5.0×10³copies/ml）

取100ml容量瓶，分別加入5.0×10⁷copies/mlrt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250、外控和內(nèi)控質(zhì)粒（各質(zhì)粒委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成）各10μl。用生理鹽水定容至100ml，將液體轉(zhuǎn)移到100ml燒杯中，按500μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、核酸提取采用已備案的核酸提取試劑盒進行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度計測核酸純度，其od260/od280應(yīng)在1.6~2.0之間。

3、加樣上機

（1）反應(yīng)混合物配制取出反應(yīng)液1#~8#、酶混合液室溫放置，使其充分溶解，配制反應(yīng)混合物（每測試配置體系：29.5μl反應(yīng)液+0.5μl酶混合液），按照需要計算好試劑用量，充分混合均勻后，3000-5000g離心5秒。

（2）加樣取出八聯(lián)管，依次加入30μl配制好的反應(yīng)混合物，然后將提取好的樣本取2μl加入擴增管或八聯(lián)管，蓋好蓋子，稍微離心后置入熒光pcr擴增儀內(nèi)。加樣順序，建議參照一下表格進行：

（3）上機檢測

1）循環(huán)條件設(shè)置38℃5分鐘，95℃10分鐘；進入以下循環(huán)：95℃15秒，58℃40秒（檢測信號），40循環(huán)；25℃30秒。

2）儀器檢測通道選擇熒光素設(shè)定為fam、hex和rox。

4、結(jié)果判斷

（1）陰性對照應(yīng)無ct值或者為0；陽性對照ct值應(yīng)≤36；反應(yīng)液4#中rox通道ct值應(yīng)≤36；

（2）突變結(jié)果的判斷：確定待測樣本的各突變反應(yīng)孔fam通道或hex通道的檢測ct值和hbv外控孔的fam通道的外控ct值，計算δct（δct＝突變ct值－外控ct值），通過比較δct與cut-offδct之間的關(guān)系來判讀結(jié)果。若突變ct值=0，則判斷為陰性或者低于本試劑盒的檢測下限；若突變ct值<40則判斷δct值：若δct小于cut-offδct時，則判斷為突變陽性；若δct大于或等于cut-offδct時，則判斷為陰性或者低于本試劑盒的檢測下限（如下表所示）。

樣本測試結(jié)果應(yīng)以下表判斷：

實施例2

1、試劑特異性驗證

（1）實驗樣本采取10份特異性樣本對試劑的特異性進行驗證，其中2份為生理鹽水樣本、2份為大腸桿菌、2份為小牛血清樣本、2份為人陰性血清樣本、2份為丙型肝炎病毒陽性樣本。

（2）實驗過程用反應(yīng)液1#~8#分別檢測以上10份特異性樣本，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的特異性。

（3）實驗結(jié)果10份特異性樣本檢測結(jié)果皆為陰性，表明試劑特異性好，無交叉反應(yīng)情況。具體結(jié)果見下表：

2、試劑精密性驗證

（1）實驗樣本采取1份精密性樣本（濃度為5.0×10³copies/ml）對試劑的精密性進行驗證，樣本配制方法為取100ml容量瓶，分別加入5.0×10⁷copies/mlrt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250、外控和內(nèi)控質(zhì)粒各10μl，用生理鹽水定容至100ml。

（2）實驗過程用反應(yīng)液1#~8#分別重復(fù)檢測以上精密性樣本10次，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的精密性。

（3）實驗結(jié)果三種反應(yīng)液檢測精密性樣本批內(nèi)變異系數(shù)（cv值）均＜5%，表明試劑重復(fù)性好。具體結(jié)果見下表：試劑精密性檢測結(jié)果

3、試劑最低檢測限驗證

（1）實驗樣本采取1份最低檢測限樣本（濃度為5.0×10²copies/ml）對試劑的最低檢測限進行驗證，樣本配制方法為取100ml容量瓶，分別加入5.0×10³copies/ml的精密性樣本10ml，用生理鹽水定容至100ml。

（2）實驗過程用反應(yīng)液1#~8#分別重復(fù)檢測以上最低檢測限樣本10次，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的最低檢測限。

（3）實驗結(jié)果八種反應(yīng)液檢測最低檢測限樣本均為陽性，試劑的最低檢測限為5.0×10²copies/ml。具體結(jié)果見下表：

4、試劑突變檢測敏感性驗證

（1）實驗樣本采取11份突變敏感性樣本對試劑突變檢測敏感性進行驗證。1號為5.0×10⁷copies/ml的rt80、外控質(zhì)粒1：100混合；2號為5.0×10⁷copies/ml的rt169、外控質(zhì)粒1：100混合；3號為5.0×10⁷copies/ml的rt173、外控質(zhì)粒1：100混合；4號為5.0×10⁷copies/ml的rt180、外控質(zhì)粒1：100混合；5號為5.0×10⁷copies/ml的rt181、外控質(zhì)粒1：100混合；6號為5.0×10⁷copies/ml的rt184、外控質(zhì)粒1：100混合；7號為5.0×10⁷copies/ml的rt194、外控質(zhì)粒1：100混合；8號為5.0×10⁷copies/ml的rt202、外控質(zhì)粒1：100混合；9號為5.0×10⁷copies/ml的rt204、外控質(zhì)粒1：100混合；10號為5.0×10⁷copies/ml的rt236、外控質(zhì)粒1：100混合；11號為5.0×10⁷copies/ml的rt250、外控質(zhì)粒1：100混合。

（2）實驗過程分別檢測以上樣本，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的基因突變檢測敏感性。

（3）實驗結(jié)果11份突變敏感性樣本均為陽性，證明本試劑在突變比例為1%時能夠準確檢出。具體結(jié)果見圖1-11。

實施例3：60例臨床樣本的檢測結(jié)果

1、按照實施例1所示的配制方法，配制試劑盒相關(guān)組分，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院收集了60例臨床乙型肝炎病毒感染且抗病毒藥物治療效果不佳的患者血清，采用德必碁生物科技（廈門）有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（病毒型）進行核酸提取，用紫外分光光度計檢測dna樣本的純度，60例樣本od260/od280皆在1.6~2.0之間。

3、按照實施例1所示的步驟，進行dna加樣并上熒光定量pcr儀進行檢測，本次使用的儀器為abi750。

4、按照實施例1所示判斷標(biāo)準，對結(jié)果進行判讀并統(tǒng)計，結(jié)果如下表：

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>德必碁生物科技(廈門)有限公司

<120>一種檢測乙型肝炎病毒耐藥多基因突變試劑盒

<130>39

<160>39

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttgcccgtttgtcctctaa19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atagaggttccttgagca18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcatcgacaaccagcaccgg20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cttgggctttcgcaacac18

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tacgaaccactgaacaaatgg21

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cctatgggagtgggcctcag20

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgcaagattcctatgggac19

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

caaacagtgggggaaagc18

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ctcagtccgtttctcctggctca23

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gcctcagtccgtttccca18

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

cccccaataccacatcatc19

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

agtgccatttgttcagtggttcg23

<210>13

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

acaaatggcactagtaaactgact24

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

tgtattcccatcccatcatc20

<210>15

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

aaacggactgaggcccactccc22

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

tctcctggctcagttcgg18

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ccccaataccacatcatc18

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

tttgttcagtggttcgtagggctt24

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

tttgttcagtggttcgtagca21

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aaagggactcaagatgttgtac22

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

tatggatgatgtggtattgggggc24

<210>22

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

cccactgtttggctttgat19

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

aaagggactcaagatgttgtac22

<210>24

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

tggatgatgtggtattgggggc22

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

cccaataccacatcatcaac20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

tccgtttctcttggctcagt20

<210>27

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

ccaaacagtgggggaaagccc21

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

caacgtttggttttattagtgg22

<210>29

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ctgtacaacatcttgagtccct22

<210>30

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

acccaaagacaaaagaaaattgg23

<210>31

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

aacttccaattacatatccctc22

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

ggccaagtctgtacaacatc20

<210>33

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

cccaaagacaaaagaaaattggt23

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

gttgcccgtttgtcctctaa20

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

agcaggagttgtgcaggttt20

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

ttccaggatcatcgacaacc20

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

acagtcagccgcatcttctt20

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

acgaccaaatccgttgactc20

<210>39

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

cagccgagccacatcgctca20