本發(fā)明涉及一種用于山羊支原體山羊肺炎亞種的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

山羊支原體山羊肺炎亞種(mycoplasmacapricolumsubsp.capripenumoniae,mccp)是絲狀支原體簇的成員之一，是引起山羊傳染性胸膜肺炎(contagiouscapripleuropneumonia,ccpp)的病原。被感染羊群無(wú)年齡和性別差異，發(fā)病率和死亡率都較高(儲(chǔ)岳峰,2009;趙萍,2010)，該病的發(fā)病率達(dá)100%(nichlasetal.,2012;chuetal.,2011)，死亡率高達(dá)60-70%（鄭瑩瑩,2014）。該病潛伏期為2-28d，平均10d，其臨床特征主要表現(xiàn)為纖維素性胸膜肺炎。ccpp最早可追溯到1873年的阿爾及利亞，1976年由macowan和minette在肯尼亞成功分離到病原，命名為f38?，F(xiàn)主要流行于非洲、亞洲和地中海沿岸各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)，我國(guó)最早可追溯到1992年新疆伊犁，隨后寧夏、甘肅、貴州、湖南、廣西、河北、貴州、遼寧、江蘇、內(nèi)蒙、河南、青海、四川等省市均勻該病發(fā)生的報(bào)道(趙萍,2010,2016;郭晗,2011)。該病每年給養(yǎng)羊業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。

sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr是在pcr反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr過(guò)程，對(duì)未知模板可進(jìn)行定量分析的方法。因其無(wú)需電泳，且具有快速性及定量性而廣為推崇。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，至今尚未見(jiàn)檢測(cè)mccp的sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法。本發(fā)明的建立可以填補(bǔ)該領(lǐng)域的空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的引物。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種用于山羊支原體山羊肺炎亞種的sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物，引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’-gaactgaagaaggtatggctgaaga-3’，

下游引物：5’-cctgttccagcaccaactaaaac-3’。

利用本發(fā)明的引物可用于對(duì)mccp的相應(yīng)基因進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的各種優(yōu)化，建立了一套可用于檢測(cè)mccp的sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法。具體操作方法如下：

1、引物設(shè)計(jì)：根據(jù)genbank上公布的mccpay529462.1基因組序列，利用primer6.0軟件對(duì)arcd基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用blast工具進(jìn)行檢索，初步驗(yàn)證其特異性。

2、反應(yīng)體系的優(yōu)化：優(yōu)化出的25μl最佳反應(yīng)體系為：sybrpremixextaq2×12.5μl、上、下游引物（10μmol/l）各0.5μl、模板2μl、水補(bǔ)足至25μl。最佳反應(yīng)條件為：95℃，30s預(yù)變性；95℃，5s，60℃，30s，共40個(gè)循環(huán)。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備：以mccpf38株的dna為模板，進(jìn)行arcd基因的pcr擴(kuò)增。20μlpcr擴(kuò)增體系為：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、模板2μl、無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。取pcr產(chǎn)物5μl，在1%瓊脂糖凝膠上電泳。將pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后連接至pmd19-t載體上，并轉(zhuǎn)化至基因工程菌dh5α.中，提取重組質(zhì)粒，用pcr和雙酶切方法鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用easydilution將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl)作為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。

該方法可用于山羊傳染性胸膜肺炎病原的早期快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，為疾病的預(yù)防和治療奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

有益效果

本發(fā)明根據(jù)genbank登錄的ay529462.1的arcd基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，于國(guó)內(nèi)外首先建立山羊支原體山羊肺炎亞種的sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，該方法特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于山羊傳染性胸膜肺炎病原的早期快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

附圖說(shuō)明

圖1mccpsybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的擴(kuò)增曲線。

圖2為mccp的sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1mccpsybrgreenⅰ熒光定量pcr方法的建立

一、材料：

mccpf38株由中國(guó)科學(xué)院蘭州研究所饋贈(zèng)，大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌等由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室和豬病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；綿肺炎支原體、羊口瘡病毒為本科室分離、保存。

二、步驟

1、儀器與試劑：

mastercyclereprealplex熒光定量pcr儀購(gòu)自eppendorf公司；膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；sybrpremixextaqⅱ（2×）、pmd19-t載體、dl2000marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自omegabio-tek公司；熒光定量pcr管購(gòu)自axygen。

2.引物的特異性

引物的特異性是本實(shí)驗(yàn)所建立方法的最重要因素。根據(jù)genbank登錄的ay529462.1的arcd基因序列，通過(guò)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)引物。

引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’-gaactgaagaaggtatggctgaaga-3’，

下游引物：5’-cctgttccagcaccaactaaaac-3’。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以mccpf38株dna為模板，進(jìn)行arcd基因的pcr擴(kuò)增。20μlpcr擴(kuò)增體系為：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、模板2μl、無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。取pcr產(chǎn)物5μl，在1%瓊脂糖凝膠上電泳。將pcr產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后連接至pmd19-t載體上，并轉(zhuǎn)化至基因工程菌dh5α.中，提取重組質(zhì)粒，用pcr和雙酶切方法鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用25μl反應(yīng)體系(sybrpremixextaq2×)12.5μl，pcr上游引物（10μmol/l）0.5μl，pcr下游引物（10μmol/l）0.5μl，倍比稀釋后的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2μl，補(bǔ)水至終體積25μl，以出現(xiàn)最小的ct值以及在熔解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰為指標(biāo)，分別對(duì)退火溫度（51～65℃）和引物濃度（0.2～1.0μmol/l）進(jìn)行優(yōu)化。

用nanodrop2000測(cè)定提取質(zhì)粒的濃度。根據(jù)重組質(zhì)粒的分子量將其質(zhì)量濃度換算為拷貝數(shù)濃度：拷貝/μl=(ng/μl×10^-9)×(6.02×10²³)/dnalength×660)；其中重組質(zhì)粒濃度為87.6ng/μl，總長(zhǎng)度為2862bp。經(jīng)計(jì)算拷貝數(shù)為2.79×10¹⁰拷貝/μl，用easydilution將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl)作為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，建立的sybrgreenⅰ熒光定量pcr方法對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種的ct與拷貝數(shù)在2.79×10³～2.79×10⁹copies/μl反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998，擴(kuò)增效率為103%。擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

6特異性檢測(cè)

6.1特異性檢測(cè)

用優(yōu)化的條件分別檢測(cè)mccp、絲狀支原體山羊亞種、大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、綿肺炎支原體、羊口瘡病毒核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，除mccp有檢測(cè)到熒光信號(hào)，其余樣品均未檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明該方法特異性好。

6.2可重復(fù)性及再現(xiàn)性評(píng)估

對(duì)同一陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù)管，用sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其重復(fù)性，計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品置于-20℃冰箱保存，分別于第3、6、9d重檢，評(píng)價(jià)其再現(xiàn)性，計(jì)算其組間變異系數(shù)。結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.59%～0.67%，組間變異系數(shù)為0.82%～0.98%，表明該方法重復(fù)性好。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>用于山羊支原體山羊肺炎亞種的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物

<130>2

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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gaactgaagaaggtatggctgaaga25

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cctgttccagcaccaactaaaac23