本發(fā)明涉及齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)的snp標記及其應用，具體涉及齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)的snp標記，用于檢測前述snp標記的引物對和試劑盒，以及前述snp標記、引物對及試劑盒在齊口裂腹魚選育中的用途，以及檢測齊口裂腹魚患有細菌性敗血癥的方法。
背景技術(shù)：
：齊口裂腹魚（schizothoraxprenanti）是我國重要的冷水魚類之一，其肉質(zhì)細嫩、味鮮美、營養(yǎng)價值高，深受消費者青睞，目前已成為我國長江上游名貴經(jīng)濟魚類。我國曾有豐富的齊口裂腹魚野生資源，然而近年來，由于過度捕撈、修建電站、水體污染等導致齊口裂腹魚野生資源遭到嚴重破壞，種群數(shù)量急劇下降，自然資源將近枯竭。為有效保護齊口裂腹魚的野生資源，多位研究者先后攻克了齊口裂腹魚的人工繁殖和人工養(yǎng)殖技術(shù)，目前，已在重慶、四川、云南等地進行了規(guī)模化的養(yǎng)殖。但由于近年來養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、集約化程度的提高、養(yǎng)殖密度的增加、飼養(yǎng)管理操作不當及水質(zhì)污染等原因，導致了養(yǎng)殖的齊口裂腹魚抗病力下降，疾病頻發(fā)，如敗血癥、肌肉潰瘍病，以及由小瓜蟲、斜管蟲、絳蟲等引起的寄生蟲性疾病，其中細菌性敗血癥危害最大。養(yǎng)殖者為控制病害而大量使用藥物，不僅導致水產(chǎn)品藥物殘留等食品安全問題，還造成了病原微生物耐藥性增加、養(yǎng)殖環(huán)境惡化等一系列問題。因此，篩選與抗病性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記，利用標記輔助育種，培育齊口裂腹魚抗病優(yōu)良品種成為控制病害發(fā)生的有效途徑之一。分子標記輔助育種（marker-assistedselection,mas）是依據(jù)與某一基因或性狀緊密連鎖的標記的出現(xiàn)來推斷該基因或性狀而進行選育，它是在dna水平上而不是根據(jù)表型進行選擇，因此可以提高選擇的準確性，并可在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個體，篩選優(yōu)良親本，從而加快育種進程縮短育種周期。snp標記是繼微衛(wèi)星標記之后最為高效的標記，由于其是雙等位型標記，具有在全基因組多態(tài)性高、含量豐富、遺傳穩(wěn)定、分析簡單等優(yōu)點，廣泛用于多種動物及少數(shù)魚類的選擇育種中。然而，齊口裂腹魚抗病相關(guān)snp未見報道，能有效用于齊口裂腹魚抗病相關(guān)性狀選育的snp標記有待挖掘。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)的snp標記及其應用，通過該snp標記能夠快速檢測齊口裂腹魚對細菌性敗血癥的抗病能力，能夠有效用于齊口裂腹魚抗病性狀的選育。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：1.齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)的snp標記，所述snp標記核苷酸序列如seqidno.1所示，序列自5’端起第779位堿基為c或t。2.用于檢測權(quán)利要求1所述的snp標記的引物對，所述snp標記的引物對核苷酸序列為：f：tccttaaacctctggtgtctct，（seqidno.2）；r：gctgtttccagataggtccaa，（seqidno.3）。3.用于檢測上述snp標記的試劑盒，包含上述的引物對。4.一種檢測齊口裂腹魚對細菌性敗血癥易感性的方法，通過對待測齊口裂腹魚進行snp標記的檢測，確定所述待測齊口裂腹魚對細菌性敗血癥是否易感。優(yōu)選的，包括以下步驟：（1）提取待測齊口裂腹魚的基因組dna；（2）利用所述的引物對，將步驟（1）獲取的dna進行pcr擴增，以獲得pcr擴增產(chǎn)物；（3）對步驟（2）獲得的pcr擴增產(chǎn)物進行測序，獲得測序結(jié)果后根據(jù)結(jié)果確定待測齊口裂腹魚的snp標記的基因型；（4）根據(jù)步驟（3）確定的snp標記的基因型確定待測齊口裂腹魚對細菌性敗血癥是否易感。所述snp標記的個體基因型為ct的齊口裂腹魚對細菌性敗血癥更易感，即所述snp位點的基因型為ct的齊口裂腹魚感染細菌性敗血癥的概率顯著高于其他基因型個體。本發(fā)明提供的檢測齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)snp的檢測方法中，基因組提取不受特別限制，可以采用傳統(tǒng)酚氯仿法提取，也可采用試劑盒提取，本發(fā)明中的具體實施例是采用試劑盒提取，試劑盒操作簡便、快速、提取的dna質(zhì)量高。另外，待測齊口裂腹魚個體基因型檢測方法不受特別限制，飛行時間質(zhì)譜、測序、芯片、單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈式反應、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應等技術(shù)均可用于snp的檢測。其中，飛行時間質(zhì)譜準確性高、靈活性強、通量大、檢測周期短，因此，本發(fā)明采用飛行時間質(zhì)譜檢測snp標記。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明所述snp位點處，基因型為ct的齊口裂腹魚感染細菌性敗血癥的概率顯著高于純合cc型個體。因此，通過檢測齊口裂腹魚上述snp，能夠有效地確定其是否易患染細菌性敗血癥。具體講，該位點基因型為雜合ct時齊口裂腹魚容易患細菌性敗血癥，則說明該位點c突變?yōu)閠后，齊口裂腹魚易患細菌性敗血癥，該位點為編碼非同義snp位點，是亮氨酸（leu，cuc）和苯丙氨酸（phe，uuc）的多態(tài)位點。因此，本發(fā)明的snp標記與齊口裂腹魚細菌性敗血癥緊密相關(guān)，在親本選育中淘汰ct基因型個體利于提高后代抗細菌性敗血癥感染的能力，利用本發(fā)明標記進行輔助育種，進而加快齊口裂腹魚抗病優(yōu)良品種培養(yǎng)進程。利用上述snp位點的引物對可以有效的檢測待測齊口裂腹魚的基因型，其結(jié)果一方面可以判斷待測齊口裂腹魚是否易感染細菌性敗血癥，另一方面可以為親本選擇提供參考，例如，選擇在該位點處基因型都為cc的個體為親本，淘汰基因型為ct的個體，則后代個體在該位點處基因型都為純合cc，后代個體不會出現(xiàn)易患細菌性敗血癥的ct基因型個體。因此，利用本發(fā)明的snp位點引物可檢測齊口裂腹魚基因型，判斷該個體是否易患細菌性敗血癥，能夠有效用于齊口裂腹魚分子標記輔助選擇育種，加快齊口裂腹魚抗病優(yōu)良品種培育進程。本發(fā)明還提供了一種用于檢測所述的snp標記的試劑盒，該試劑盒可以有效檢測齊口裂腹魚抗細菌性敗血癥感染，用于齊口裂腹魚分子標記輔助育種。附圖說明圖1為96個snpspcr擴增電泳圖。具體實施方式下面將對本發(fā)明技術(shù)方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。1.1齊口裂腹魚群體樣本來源待測魚取自于峨眉山冷水魚養(yǎng)殖場同一批次人工繁殖的13月齡的齊口裂腹魚，隨機挑選健康齊口裂腹魚178尾，體重在100g/尾左右，采用胸腔注射法向齊口裂腹魚注射半致死濃度嗜水氣單胞菌菌液，7天內(nèi)死亡個體和有典型癥狀個體為易感個體，無感染癥狀的個體為抗病個體。其中易感組有109個個體，抗病組有69個個體，剪取其鰭條，保存于無水乙醇中，用于基因組dna提取。1.2待測齊口裂腹魚基因組dna提取基因組dna提取采用苯酚-氯仿抽提方法提取，具體方法如下：取鰭條約50mg，加入650μl消化液（1l消化液含2ml5mol/lnacl，10ml1mol/ltris-cl，50mlsds(10%)和200ml0.5mol/ledta，ph=8.0），10μl20mg/ml的蛋白酶k，55℃水浴鍋內(nèi)消化過夜；加入4μl終濃度40μg/ml的rnasea（4mg/ml），37℃水浴1小時；加650μl（ph值8.0）平衡酚，溫和顛倒混勻，離心（12000g,4℃）10min，吸取上清；等體積酚重復抽提一次；加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合物（苯酚：氯仿：異戊醇體積比25：24：1），顛倒混勻10min，同上條件離心，小心吸取上清液，并重復一次；加等體積氯仿-異戊醇混合物（氯仿和異戊醇的體積比24：1）洗一次，記錄上清的體積；加2.5倍體積的無水乙醇，離心（12000g,4℃,5min），輕柔倒去乙醇保留沉淀；加入200μl體積分數(shù)75%的乙醇，緩慢顛倒，離心（12000g,4℃,5min）去乙醇；體積分數(shù)75%的乙醇重復洗滌；風干15min，加入100μl超純水溶解，將抽提的dna采用瓊脂凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和體積分數(shù)，并將其稀釋成40ng/ul的濃度，保存在4℃?zhèn)溆谩?.3測序及snp標記開發(fā)隨機選擇108尾人工養(yǎng)殖的健康齊口裂腹魚平均分成兩組，一組注射生理鹽水，另一組注射嗜水氣單胞菌，并在注射后4h，24h和48h分別在對應重復組中隨機取18尾魚，用300mg/l的ms222麻醉，迅速解剖并取其脾臟，記錄每尾魚感染表現(xiàn)情況。每時間點的18尾魚分成3個重復，每個重復6尾魚的脾臟組織混合成一個樣本池，用illuminahisseq2500測序平臺進行雙末端測序，每個樣品的產(chǎn)生不低于4gb數(shù)據(jù)。通過go富集和kegg富集分析，選擇免疫相關(guān)基因用于開發(fā)snp標記，采用samtools1.19和gatk2.8.1軟件開發(fā)假定的snps，最終選擇3個免疫相關(guān)基因上的96個snps進行pcr擴增（電泳圖見圖1）和選擇性測序，并利用spss18.0進行關(guān)聯(lián)分析，獲得了1個與細菌性敗血癥相關(guān)的snp位點，該snp位于seqidno.1所示核苷酸序列（全長1875bp）自5’端起第779bp處，該位點堿基以y表示，y代表c或t。seqidno.1所示核苷酸序列來自發(fā)明人前期研究獲得的齊口裂腹魚脾臟轉(zhuǎn)錄組序列。1.4pcr擴增及檢測以齊口裂腹魚基因組dna為模板，采用下述引物進行pcr擴增，引物序列如下：f：tccttaaacctctggtgtctct，（seqidno.2）；r：gctgtttccagataggtccaa，（seqidno.3）。在經(jīng)pcr擴增后的產(chǎn)物中加入snp序列特異性延伸引物（ext），在snp位點上延伸一個堿基。snp延伸引物序列為：ext：accctgaaagctgagga，（seqidno.4）。pcr反應條件為：94℃15分鐘；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分鐘，45個循環(huán)；72℃延伸3分鐘。反應體系以5μl計為：0.5μm引物1μl，2.5mmdntp0.1μl，10mmmgcl20.3μl，0.5μl10×pcrbuffer，5utaqpolymerase(qiagen)0.2μl，和10ng基因組dna1μl，滅菌雙蒸水1.9μl。延伸產(chǎn)物經(jīng)純化后與表面覆蓋基質(zhì)的massarrayspectrochip芯片共結(jié)晶。將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管中即可自動分析snp的位點信息。1.5snp位點與細菌性敗血癥的關(guān)聯(lián)分析采用spss18.0的一般線性模型中的多元方差分析和獨立樣本t檢驗對snp位點的基因型和等位基因與抗病性關(guān)聯(lián)進行分析，等位基因及基因型在兩組間的差異分析結(jié)果見表1和表2。表1等位基因在兩組間的分布差異統(tǒng)計表表2基因型在兩組間的分布差異均具有統(tǒng)計顯著性基因型抗病組（%）易感組（%）卡方值p值cc68(1.000)98(0.899)ct0(0.000)11(0.101)7.31710.0068由表1可知，在該位點處，等位基因和基因型頻率在抗病和易感群體中都存在極顯著差異（p<0.01），在抗病群體中，等位基因t和c的頻率分別為0和100%，基因型ct和cc基因型頻率分別為0和100%；在易感群體中，等位基因t和c的頻率分別為5%和95%，基因型ct和cc基因型頻率分別為10.1%和89.9%。進而證明seqidno.1所示核苷酸序列（全長1875bp）自5’端起第779位堿基c或t與齊口裂腹魚細菌性敗血癥顯著相關(guān)，為齊口裂腹魚疾病關(guān)聯(lián)snp標記，本發(fā)明的snp標記可用于齊口裂腹魚抗病性狀選育。最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當中?！?10〉西南大學〈120〉齊口裂腹魚細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)的snp標記及其應用〈160〉4〈210〉1〈211〉1875〈212〉dna〈213〉齊口裂腹魚（schizothoraxprenanti）〈220〉〈223〉snp序列〈400〉1gaaagttatttcctatttcagaagtgttgggaaacacaaatgaaacgaagagagagaacg60gaggaagaactcattatcaccgtgaggaactcaagcgagaggacggatagttgtttattt120gacgctgtacgactcttaatattgcgttattgaaactctctcattatttcacgccaaaac180gctgcatagtgaacgagccagagctctcagaatggaatatatatttatactgatcctttt240tggatggtgcatcaacactgaagttgtgaagtgcacggtgtgttcagttaatggctatgc300cgccttctgcatagatagaggtcttcatcatgtgccagagctgcccacgcatgtcaatta360tgtggatctgagtttaaacagcattgctgaactcaacgaaacatccttttctcatctcga420aggtctacaagtccttaaagtggagcaacaaacaccaggtcttgtgatcagaaacaacac480atttagaagactctccaaactaatattacttaaactagactacaaccgcttcctgcaaat540agaaacaggagcttttaacggattatccaaccttgagattctcactctcactcagtgcag600tttagatggttctgttttgtctggtgacgtccttaaacctctggtgtctctagagatgct660tgtcttacgagataacaacattcacagaatccagccggcatcgttctttttaagtatgag720gagattccatgtgctggatctctcttacaacaaagtgaagagcatctgtgaagaagacyt780cctcagctttcagggtaaacatttcacgcttctgacccttgcctctgtgacactgcaaga840catgaatgagtactggttacgatgggacaagtgtggaaacccatttaagaacatgtccgt900aactgtattggacctatctggaaacagctttaatgttaacaatgcaaagcaattttttaa960tgcaatcaccggcaccaaaatccaaagtctcattctaagtaagagttacagcatgggcag1020ttcttttggtcataataatttcccagatccagacaaattcacattcaagggtcttgaggc1080gagtggtattaaaacttttgatctgtccaattcaagtattttttctctgtcatattcagt1140atttagttatttgccagatctagaacaaattacattagcacaaagtcagatcaacaagat1200tgaaagcaatgcatttttgggtatgacaaatttacaaaagctaaacttgtccgtaaactt1260cctgggtaatattaattcagaaacttttaaaaatctacagaaacttgaggtgcttgattt1320atcatataatcatatatggatgcttgaaattcagtcatttcaaggacttccaaatctact1380catcctaaatttaacaggaaattctatcctttatgcacacagatttgcaaccctaccaag1440cctagagaaactctacttgggtgacaacaaaattatacatgcgtccgatttactcaacat1500tgccacaaacctcaaaaccctttacctggagtttaacaaaatattttccatgtcagagct1560ctacacgatactagagaaatttcctcaaattgaggaaatcgtttttcgaggtaacggact1620tgtttgttgccctgacgacaaacataaagtgctttcgcaaaaaatacaaatccttgatct1680tgcaattgcaggtttggaagttatctggttagaaggaaaatgtttaaatgtatttaatga1740ccttcaccagttagaagtgctttatctgagttacaacagactgcagtcgcttcccaaaga1800cgttttcaaagacctcacctctttgatctttttggatttgtccttcaattctttgaagta1860ccttcctaatggtat1875〈210〉2〈211〉22〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉〈223〉克隆snp序列上游引物〈400〉2tccttaaacctctggtgtctct22〈210〉3〈211〉〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉〈223〉克隆snp序列下游引物〈400〉3gctgtttccagataggtccaa21〈210〉4〈211〉17〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉〈223〉ext序列（snp延伸引物序列）〈400〉4accctgaaagctgagga17當前第1頁12